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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CINCIAS BIOLOGICAS CCB DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA BIOQUIMCA I

RELATRIO DA AULA PRTICA SOBRE ENZIMAS

Adelson da Silva Filho; James Chagas Almeida; Jos Roberto Pimentel Cabral de Seixas; Luiz Nascimento de Arajo Neto; Maira de Vasconcelos.

Curso: Biomedicina 1 perodo

RECIFE, 2010.2

1. Introduo As enzimas so protenas especializadas na catlise de reaes biolgicas. Elas esto entre as biomolculas mais notveis devido a sua extraordinria especificidade e poder cataltico, que so muito superiores aos dos catalisadores produzidos pelo homem. Praticamente todas as reaes que caracterizam o metabolismo celular so catalisadas por enzimas, sendo assim, consideradas as unidades funcionais do metabolismo celular. A urease foi primeira enzima a ser purificada e cristalizada, um feito de James B. Sumner em 1926, numa altura em que a maior parte dos cientistas acreditava ser impossvel cristalizar enzimas. A urease catalisa a hidrlise de ureia em dixido de carbono e amnia. Encontra-se principalmente em sementes, micro-organismos e invertebrados. Nas plantas, a urease um hexmero (consiste em seis cadeias idnticas) e localiza-se no citoplasma. Em bactrias, constituda por duas ou trs subunidades diferentes. Para ser ativada, a urease precisa ligar-se a dois ons nquel por subunidade. Todos os organismos decompem cidos nuclicos e protenas produzindo resduos nitrogenados, pois os cidos nuclicos e as protenas contm nitrognio. Os mamferos, anfbios e alguns invertebrados libertam resduos azotados na forma de ureia, que produzida no fgado. A ureia um composto especialmente indicado para a eliminao de azoto, pois solvel em gua e menos txica que a amnia, no qual o produto da excreo nos peixes, por exemplo. A urina humana contm 2% de ureia. Por isto, o referente trabalho tem como objetivo mostrar em quatro diferentes mtodos a atividade enzimtica da urease frente a fatores adversos (pH, temperatura etc.) nessas reaes realizada no laboratrio de Bioqumica durante a aula prtica dos alunos do 1 perodo do curso de Biomedicina da Universidade Federal de Pernambuco.

2. Teste de Atividade Enzimtica

A atividade da enzima pode ser demonstrada fazendo-a reagir com uma soluo de ureia a pH=7, muito fracamente tamponada. A soluo contem um indicador, vermelho de fenol, que muda de amarelo para rosa pela subida dos valores de pH. Estando a enzima ativa ocorrera liberao de amnia em quantidades suficientes para sobrepujar a ao do tampo tornando o meio da reao alcalino. Como conseqncia da subida do pH, a soluo, originalmente amarela, passa a cor rsea. 2.1. Materiais 2.1.1. Tubos de ensaio; 2.1.2. Pipetas; 2.1.3. Ureia tamponada com indicador (substrato); 2.1.4. Urease; 2.1.5. gua Destilada. 2.2. Mtodo Marcar dois tubos (1 e 2) e distribuir neles as quantidades de 3ml cada um, de ureia tamponada com indicador, logo em seguida adicionar 3 gotas de urease no tubo 1 e colocar 3 gotas de gua destilada no tubo 2. Depois agitar. Observar e anotar os resultados em forma de tabela marcando com um + ou um a mudana de cor observada. 2.3. Resultados Observados
Tabela 1. Resultado da mudana de cor do experimento I:

Tubos 1 2

Ureia tamponada c/ indicador 3ml 3ml

Urease 3 gotas

gua destilada

AGITAR

Mudana de cor + -

3 gotas

2.4. Discusso

A partir dos resultados obtidos na tabela 1, pode-se inferir que no tubo 1 houve mudana na cor da reao devido a presena da ureia no meio, onde a mesma o substrato da urease. Com isso o produto final dessa reao a amnia constatada pela mudana na colorao, pois ao ocorrer a reao CO(NH2)2 + H2O 2 NH3 + CO2 h um aumento do pH e o indicador vermelho de fenol presente na soluo muda para uma tonalidade rsea. No entanto no tubo 2 no foi observado nenhuma mudana na colorao, visto que no mesmo s foi adicionado gua destilada e urease e com isso a enzima no pode ser ativada uma vez que o seu substrato estava ausente na soluo. Por isto, com o tubo 2, pode-se ainda concluir a natureza da atividade da urase X ureia, sendo o tubo 2 um padro para o experimento.

3. Especificidade Enzimtica

A urease altamente especifica para a ureia. Isto pode ser demonstrado fazendo a enzima reagir com um composto com estrutura semelhante do substrato, a tiouria H2NCS-NH2, e verificar se houve mudana de cor. 3.1. Materiais 3.1.1. Tubos de ensaio; 3.1.2. Pipetas; 3.1.3. Ureia tamponada com indicador (substrato); 3.1.4. Urease; 3.1.5. Tiouria tamponada com indicador. 3.2. Mtodo Marcar dois tubos (1 e 2) de ensaio e distribuir neles as substncias nas quantidades de 2ml de ureia tamponada com indicador no tubo 1, 2ml de tiouria tamponada com indicador no tubo 2, e adicionar 3 gotas de urease em ambos os tubos. Depois agitar. Observar e anotar os resultados em forma de tabela marcando com um + ou um a mudana de cor observada.

3.3. Resultados Observados


Tabela 2. Resultado da mudana de cor do experimento II:

Tubos

Ureia tamponada c/ indicador 2ml

Tiouria tamponada c/ indicador 2ml

Urease

AGITAR

Mudana de cor + -

1 2

3 gotas 3 gotas

3.4. Discusso

De acordo com a tabela 2, pode concluir que a urease tem alta especificidade com o seu substrato, ou seja, a ureia, visto que no experimento anterior foi usado como um controle a gua destilada, no qual a enzima no reagiu, mas esse dado obtido no pode ser tido como uma especificidade da urease com a ureia uma vez que a gua completamente diferente da ureia. Por isto, nesse experimento, onde a tioureia utilizada no tubo 2 a soluo final aparentemente ficou semelhante inicial, mostrando que no houve produo de amnia e consequentemente inalterao de cor. J no tubo 1 pode ser visto o mesmo fenmeno do experimento I, aquele em que testa a atividade da enzima.

4. Desnaturao Pelo Calor

Devido sua natureza protica, as enzimas so sensveis ao de temperaturas elevadas, que podem destruir a funo cataltica do seu centro ativo.

4.1. Materiais 4.1.1. Tubos de ensaio; 4.1.2. Pipetas; 3.1.3. Ureia tamponada com indicador (substrato); 3.1.4. Urease; 3.1.5. gua destilada. 4.2. Mtodo Colocar em um tubo (1) de ensaio 3ml de gua destilada e 3 gotas de urease. Agitar. Colocar em banho-maria fervente por 3 minutos. Esfriar em gua corrente. Em outro tubo (2) pipetar 2ml de ureia tamponada e juntar 1mL da urease fervida do tubo 1. Agitar. 4.3. Resultados No primeiro tubo, onde foi adicionada gua e urease no foi observado mudana de cor nem na textura da soluo; No segundo tubo, onde foi adicionado a urease fervida do tubo anterior contendo ureia, houve uma mudana de cor para o rosa fracamente, quase que imperceptvel; Aps 5 minutos houve uma mudana na textura da soluo, aparecendo um precipitado.

4.4. Discusso

No primeiro procedimento do protocolo foi adicionada gua para que ao entrar em contato com uma temperatura elevada a urease no sofresse vaporizao, e como a urease apenas reage com a ureia no houve mudana na colorao para um tom rseo. Aps adicionar a ureia fervida em um tubo contendo ureia, a soluo mudou fracamente de cor para uma tonalidade rosa, no entanto de acordo com as propriedades das protenas, categoria no qual a grande maioria das enzimas est inserida, temperaturas elevadas quebra os centros ativos das protenas, fazendo com que as mesmas percam sua estrutura e consequentemente sua funo, ou seja, elas desnaturam, revelando um erro durante o procedimento de fervura da urease, pois se a tonalidade da reao mudou, mostrou que ainda havia enzimas no desnaturadas para reagir com a ureia da soluo. Porem se a soluo de urease tivesse sido fervida adequadamente como mandou o protocolo no haveria mudana na cor. Aps cinco minutos apareceu um precipitado na soluo final, isto se deu ao fato de que, protenas desnaturadas perdem sua solubilidade em conseqncia da falta da camada de salvatao que a sua estrutura original (protena no desnaturada) lhe fornece.

5. Inibio Enzimtica

Grupos sulfidrila (SH) prximos aos centros ativos da urease so essenciais para a manuteno da conformao ativa. Compostos como os sais de metal pesados tais como: Hg, Pb e Ag ao se combinarem com os grupos sulfidrilas, causam modificaes permanentes na conformao da enzima, provocando diminuio e perda de sua atividade. 5.1. Materiais 5.1.1. Tubos de ensaio; 5.1.2. Pipetas; 5.1.3. Ureia tamponada com indicador (substrato); 5.1.4. Urease; 5.1.5. gua destilada; 5.1.6. HgCl2. 5.2. Mtodo Marcar dois tubos de ensaio (1 e 2) e distribuir as substancias nas quantidades de 3 gotas em ambos os tubos de urease, 1ml de gua destilada tambm em ambos os tubos, 8 gotas de HgCl2 no tubo 1 e 3ml de ureia tamponada com indicador nos tubos 1 e 2. Depois agitar. Observar e anotar os resultados em forma de tabela marcando com um + ou um a mudana de cor observada.

5.3. Resultado
Tabela 3. Resultado da mudana de cor do experimento IV:

Tubos

Urease

gua destilada 1ml 1ml

HgCl2

1 2

3 gotas 3 gotas

8 gotas

Ureia tamponada c/ indicador 3ml 3ml

AGITAR

Mudana de cor +

5.4. Discusso No tubo 1 no foi observado cor na tonalidade rosa devido a concentrao de HgCl2 ter sido maior que a concentrao de urease havendo uma competio do sitio ativo

da enzima e em conseqncia a inibio da mesma, ou seja, os grupos SH presentes no centro ativo se combinaram aos sais de metal no tendo reao pois a urease sofreu uma desconformao estrutural e com isso perdeu sua funo. A ordem na qual foram adicionados os compostos tambm foi fundamental, pois se adicionou primeiro a urease e o sal metlico para se ter certeza de que todos os stios estariam bloqueados para que, quando a ureia fosse colocada, a enzima estivesse totalmente inativada e a soluo no apresentasse cor na tonalidade rsea. J no tubo 2 a cor rosa foi observada, pois, como j foi visto nos experimentos anteriores, a urease reage com a ureia produzindo amnia, que aumenta o pH e o indicador fornece a colorao.

6. Referncia Bibliogrfica

LEHNINGER, Albert Lester; NELSON, David L; COX, MICHAEL M. Principios de bioquimica. 2. ed. Sao paulo: Sarvier, 2000. 839 p. : il ISBN 857378-026-6

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