ENZIM

Fenny Alicia Andini 10613308/ D11/ D

ABSTRAK Enzim adalah sekelompok protein yang berfungsi sebagai katalisator untuk berbagai reaksi kimia dalam system biologik. Sintesis enzim terjadi di dalam sel dan sebagian besar enzim dapat diekstrasi dari sel tanpa merusak fungsinya. Oleh karena peranan yang sangat penting dalam tubuh, maka makalah ini bertujuan untuk melakukan uji aktifitas enzim -amilase dalam hidrolisis pati dan menjelaskan factor-faktor yang mempengaruhi aktifitas enzim. Untuk uji aktifitas -amilase saliva menggunakan metode reaksi kualitatif untuk amylase saliva, metode colorless point, aktifitas amylase. Enzim amilase bertujuan untuk memecah ikatan 1-4 glikosidik yang terdapat dalam amilum. Faktor-faktor yang mempengaruhi aktifitas enzim antara lain kadar enzim, suhu, pH, kadar substrat, dan inhibitor.

A.

PENDAHULUAN Enzim adalah polimer biologis yang mengkatalisis reaksi kimia yang memungkinkan berlangsungnya kehidupan. Enzim yang mengkatalisis perubahan satu atau lebih senyawa (substrat) menjadi satu atau lebih senyawa lain (produk) meningkatkan laju reaksi setidaknya 106 kali dibandingkan jika tidak dikatalisis(1). Ada beberapa faktor yang berpengaruh atas aktifitas enzim antara lain pH, suhu, inhibitor, kadar substrat. Faktorfaktor itu mempunyai dua pengaruh atas enzim yaitu struktur dan reaktivitas(2). Pada percobaan ini bertujuan untuk melakukan uji aktifitas enzim -amilase dalam hidrolisis pati serta faktor-faktor yang mempengaruhi aktifitas enzim. Diketahui bahwa enzim -amilase merupakan golongan enzim hidrolase yang berfungsi untuk memecah ikatan 1-4 glikosidik yang terdapat pada amilum dan disebut endoamylase sebab enzim ini memecah bagian dalam atau bagian tengah molekul amilum(3). Kelebihan enzim
dibandingkan katalis biasa adalah dapat meningkatkan produk beribu kali lebih tinggi, bekerja

pada pH yang relatif netral dan suhu yang relatif rendah, dan bersifat spesifik dan selektif terhadap subtrat tertentu(4). Ada pula faktor-faktor yang dapat mempengaruhi kerja dari enzim antara lain: 1. Konsentrasi enzim: Kecepatan reaksi bertambah dengan bertambahnya konsentrasi enzim(3). 2. Konsentrasi substrat: Jumlah substrat yang belebih dapat menaikkan kecepatan reaksi enzim. Akan tetapi pada batas konsentrasi tertentu, tidak terjadi kenaikan kecepatan reaksi walaupun konsentrasi substrat diperbesar. Hal itu dikarenakan enzim telah jenuh dengan substrat. Aktifitas maksimum ditemukan pada pati 1% sebagai substrat (3)(5).

3. Suhu: Kecepatan reaksi dipengaruhi oleh kenaikan suhu pada kondisi optimum. Aktifitas
amylase berada pada suhu >30C (3)(5).

4. pH: pH dapat berpengaruh terhadap efektifitas bagian aktif enzim. pH rendah maupun tinggi
dapat menyebabkan denaturasi. Pada amylase pH optimum adalah 5,6-7,2(3).

5. Inhibitor: Inhibitor dapat menghambat kerja enzim. Namun pengaruh inhibitor dapat
dihilangkan dengan cara menambah substrat dalam konsentrasi besar(3).

Adapun fungsi suatu enzim ialah sebagai katalis untuk proses bikimia yang terjadi dalam sel maupun diluar sel, disamping itu mempunyai derajat kekhasan yang tinggi. Enzim juga dapat menurunkan energy aktivasi suatu reaksi kimia(3). B. METODE

Alat: Tabung reaksi, Cawan petri, Pipet tetes, Pipet volume, Gelas beaker, Mikro pipet, Propipet, Kertas perkamen, Waterbath, Spektro UV, Bejana, Labu ukur 5 ml, Blue tip, Yellow tip, Rak tabung. Bahan: Larutan amilum 0,5%; 0,4%, (saliva), Buffer fosfat, Larutan Iodium, Aquades, NaCl 0,5%, Larutan dapar, Substrat amilum, Es Batu, Ekstrak phaseolamin. Cara Kerja: 1. Uji aktifitas -amilase saliva 1.1. Reaksi kualitatif untuk amylase saliva Cawan petri diteteskan 1 tetes larutan amilum dan 1 tetes saliva, dicampur dan didiamkan. Setelah 5 menit ditambahkan 1 tetes larutan iodium. Di catat perubahannya.

1.2. Colorless Point

11 tabung reaksi masing-masing diisi 1 ml buffer fosfat. Tabung 1, ditambahkan 1 ml saliva dan dihomogenkan. Pengenceran diambil 1 ml dari tabung 1 dimasukkan ke tabung 2 dan di homogenkan. Dilakukan hal serupa pada tabung 3-10, diperoleh seri kadar 1:2 sampai 1:1024. Tabung 1 sebagai blanko. Larutan substrat ditambahkan pada semua tabung, masing-masing 1 ml dan dihomogenkan, di inkubasi pada 37C. setelah 15 menit, ditambahkan 2 tetes larutan iodium, diperhatikan tabung nomor berapa tarakhir yang tidak berwarna. Dihitung perkiraan unit amilase dengan rumus 2n, n adalah jumlah tabung yang tidak berwarna. 1.3. Aktifitas amylase Tabung 1-6 diisi 0,8 ml larutan iodium (suhu kamar). Tabung 7 diisi 1,5 ml larutan amilum, di inkubasi 37C slma 2 menit. Ditambah 0,1 ml saliva encer (1:100 dalam 0,5 NaCl), dicampur dan dicatat sebagai waktu awal. 0,2 ml di tabung 7 ditambahkan di tabung 1, dicampur dan dicatat warnanya. Apabila masih berwarna biru, 0,2 ml di tabung 7 diambil lagi setelah 2 menit, ditambah di tabung 2. Dicampur dan dicatat warnanya. Jika tetap warna biru, diulang lagi dengan interval 2 menit, diinkubasi hingga warna merah-coklat dan dicatat waktu total. Dihitung nilai Somogyi Units. 2. Pengaruh Kadar Enzim Terhadap Aktifitas Enzim Saliva ditampung 1 ml dalam gelas beker, diencerkan dengan pengenceran 10x, 20x, 40x, 80x, dan 160x. Disiapkan 6 tabung reaksi, 1 tabung untuk blangko dan 5 tabung untuk Uji. Dipipet kedalam tiap-tiap tabung, untuk tabung B dan U masing-masing diisi larutan amilum 1 ml, diinkubasi suhu 37oC selama 5 menit di waterbath. Tabung B ditambahkan aquadest 200l dan tabung U ditambahkan saliva 200l dengan mikropipet, diinkubasi selama 1 menit. Tabung B dan tabung U ditambahkan 1 ml larutan iodium dan ditambahkan masing-masing tabung 4 ml air suling. Dibaca serapan absorbansi dengan spektofotometer = 580 nm, dihitung serapan antara tabung B dan Tabung U pada tiap-tiap pengenceran. Dibuat kurva hubungan antara kecepatan reaksi enzimatis dengan kadar enzim. 3. Pengaruh Suhu Terhadap Aktifitas Enzim Ditampung 2 ml saliva dalam beker gelas, diencerkan 10x dengan aquades. Disiapkan 12 tabung reaksi, tabung 1 dan 2 di bejana berisi es 10oC, tabung 3 dan 4 di bejana berisi air suhunya 25oC. Tabung 5 dan 6 di penangas air suhunya 37oC, tabung 9 dan 10 di penangas air suhu 60oC. Tabung 11 dan 12 di penangas air mendidih. Tabung dengan nomor ganjil

digunakan tabung uji ( U ), dan nomor genap tabung blanko ( B ). Ditambahkan 1 ml larutan amilum pada tabung B dan tabung U, diinkubasi 37oC selama 5 menit di waterbath. Tabung U ditambahkan 200l air liur, dicampur dan inkubasi selama 1 menit, masing-masing tabung U dan B ditambahkan 1 ml larutan iodium dan 4 ml aquades. Segera dibaca serapan (A) pada = 580 nm, dihitung serapan antara tabung B dan tabung U, dibuat kurva hubungan antara kecepatan reaksi enzimatis dengan suhu. 4. Pengaruh pH Terhadap Aktifitas Enzim Digunakan alfa- amilase, dibuat dapar dengan pH antara 1 10,misal pH 2,4,6,7,8,dan 10. Dibuat substrat amilum dari macam dapar tersebut dengan konsentrasi 0,4%, dibuat blanko untuk masing-masing pH. Ditentukan aktivitas amilase dalam berbagai larutan. Tabung B dan tabung U ditambahkan 1 ml larutan amilum dengan variasi Ph, diinkubasi selama 5 menit suhu 37oC, tabung U ditambahkan 200l air liur , dicampur dan inkubasi selama 1 menit, tabung U dan B ditambahkan 1 ml larutan iodium dan 4 ml aquades. Dibaca serapan (A) pada = 580nm. Dihitung serapan antar tabung B dan tabung U. Dibuat kurva pH vs aktivitas, ditentukan pH optimum. 5. Pengaruh Inhibitor Terhadap Aktifitas Enzim Disiapkan 3 tabung reaksi, tabung 1 diisi dengan ekstrak phaseolamin 100 l + buffer 300 l + saliva ( 1:10) 30 l, diinkubasi selama 15 menit pada 37oC , ditambahkan 100 l larutan amilum. Dicampur dan diinkubasi 370C selama 5 menit. Tabung 2 diisi dengan ekstrak phaseolamin 100 l + buffer 300 l + saliva ( 1:10) 30 l + 100 l larutan amilum. Dicampur dan diinkubasi 370C selama 15 menit. Tabung 3 diisi dengan buffer 300 l + saliva ( 1:10) 30 l + 100 l larutan amilum, dicampur dan diinkubasi 37oC selama 15 menit. Ditambahkan larutan iodium 1 ml pada masing-masing tabung dan dibaca serapannya pada = 580nm. 6. Pengaruh Kadar Substrat Terhadap Aktifitas Enzim Ditampung 1 ml liur dalam beker gelas atau. Diencerkan 10x dengan aquades. Dibuat perbandingan volume amilum vs larutan dapar dengan kadar sebagai berikut : amilum dapar Kadar 2 0 2 1,75 0,25 1,75 1,5 0,5 1,5 1,25 0,75 1,25 1 1 1 0,75 1,25 0,75 0,5 1,5 0,5 0,25 1,75 0,25 0 2 0

Disiapkan 2 jenis tabung rekasi (tabung B dan U), ditentukan aktivitas amilase dengan menggunakan berbagai kadar substrat tersebut. Dimasukan masing-masing pada tabung U 1 ml larutan amilum dan tabung B 1 ml aquades, diinkubasi 37oC selama 5 menit, ditambahkan air liur 200 l pada tabung U dan 200l aquades pada tabung B, dicampur dan diinkubasi selama 1 menit. Tabung U dan B ditambahkan 1 ml larutan iodium dan 4 ml aquades. dibaca serapan pada panjang gelombang 580 nm, dihitung serapan antara tabung B den tabung U. Dibuat kurva hubungan antara kadar substrat dengan kecepatan / aktivitas enzim, dihitung harga Km. Penetapan kadar digunakan alat spektrofotometer. Prinsip spektrofotometer adalah interaksi antara electron dari suatu senyawa dengan radiasi elektromagnetik (cahaya). Senyawa yang digunakan harus memiliki gugus kromofor dan gugus auksokrom.

C. HASIL DAN PERHITUNGAN 1. Uji Aktifitas -amilase saliva Tabung 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Warna awal (buffer fosfat + saliva) Bening Bening Bening Bening Bening Bening Bening Bening Bening Bening Bening Warna setelah ditambah larutan substrat (amilum) Bening + endapan Bening + endapan Bening + endapan Bening + endapan Kuning bening + endapan Kuning bening + endapan Kuning bening + endapan Kuning bening + endapan Kuning bening + endapan Kuning bening + endapan Ungu Warna setelah ditambah iodium Putih keruh Putih keruh Putih keruh Ungu bening Ungu tua Ungu tua Ungu tua Ungu tua Ungu tua Ungu tua Ungu tua

Tabung 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Warna awal (buffer fosfat + saliva) Bening Bening Bening Bening Bening Bening Bening Bening Bening Bening Bening

Warna setelah ditambah larutan substrat (amilum) Ungu bening Ungu bening Ungu bening Ungu bening Bening + endapan Bening + endapan Bening + endapan Bening + endapan Bening + endapan Bening + endapan Ungu

Warna akhir setelah ditambah iodium Ungu tua Ungu tua Ungu tua Ungu tua Kuning Kuning Kuning Kuning Kuning Kuning Ungu tua

2. Pengaruh Kadar Enzim Terhadap Aktifitas Enzim Pengenceran Saliva 10x 20x 40x 80x 160x Blangko Au 2,635 2,737 2,737 2,737 2,767 2,737 A/menit 0,102 0 0 0 -0,03 Tabung Reaksi 10x 20x 40x 80x 160x Blangko AU 2,683 2,737 2,737 2,767 2,737 2,799 A /menit 0,116 0,062 0,062 0,032 0,062 0 Warna Biru Biru Biru Biru Biru Biru

3. Pengaruh Suhu Terhadap Aktifitas Enzim

Suhu inkubasi (0C) 10 25 27 37 60 100

AB 2,6345 2,8718 2,5911 2,799 2,5709 2,5331

Au 2,479 2,3948 2,2412 2,5709 2,4362 2,5331

A/menit 0,1555 0,4771 0,3499 0,2281 0,1347 0

Suhu inkubasi (0C) 10 25 27 37 60 100

AB 25,911 25,516 26,345 25,709 25,709 25,331

Au 0,0291 22,412 26,345 24,662 24,662 25,531

A/menit 2,562/1 0,3104/1 0/1 0,1047/1 0,1047/1 0/1

4. Pengaruh pH Terhadap Aktifitas Enzim pH 2 4 6 7 8 10 AB 0,1101 0,1119 0,5680 0,5352 0,4797 0,5807 Au 0,1144 0,1182 0,1049 0,3921 0,4207 0,4440 A/menit - 0,0043/1 - 0,0063/1 0,4631/1 0,1431/1 0,059/1 0,1367/1 pH 2 4 6 7 8 10 AB 0,1144 0,1190 0,1100 0,1074 0,1360 0,1040 Au 0,1036 0,1016 0,0997 0,0999 0,100 0,1216 A/menit 0,0108 0,0174 0,0103 0,0075 0,036 -0,0176

5. Pengaruh Inhibitor Terhadap Aktifitas Enzim No 1 2 3 4 Tabung Tabung 1 Tabung 2 Tabung 3 Tabung 4 Buffer fosfat Extract Phaseolamin Saliva Larutan Larutan Amilum Iodium Warna Absorbansi 0,002 0,524 0,520 0,485

Kuning bening

6. Pengaruh Kadar Subsrat Terhadap Aktifitas Enzim Kadar Amilum 2 1,75 1,5 1,25 1 0,75 0,5 0,25 0 A/menit 0,114 0,23 1,075 0,208 0,23 0,176 2,105 2,211 0 Kadar Substrat 0% 0,25% 0,5% 0,75% 1% 1,25% 1,5% 1,75% 2% A/menit 0,01 2,643 2,564 2,345 0,23 2,163 1,324 0,278 0,176

AU 2,799 2,683 1,838 2,591 2,683 2,591 0,632 0,424 0,07

AB 2,913 2,913 2,913 2,799 2,913 2,767 2,737 2,635 0,07

Warna Biru Biru Biru Biru Biru Biru Oranye Oranye Oranye

AB 0,098 2,767 2,767 2,872 2,913 2,913 2,913 2,913 2,913

AU 0,088 0,124 0,203 0,527 0,683 0,750 1,589 2,635 2,737

D. DISKUSI 1 Uji Aktifitas -Amilase Saliva Pada percobaan reaksi kualitatif untuk amylase saliva, hasil percobaan sebelum makan crackers gandum sesuai dengan literature yaitu berwarna kuning muda yang lama kelamaan menjadi bening. Namun pada saliva setelah makan, kerja enzim amylase belum sempurna sehingga masih ada amilum yang belum dipecah menjadi bentuk yang sederhana yang kemudian berikatan dengan iodine dan menghasilkan warna ungu. Pada percobaan colorless point dilakukan dengan pengenceran berkali-kali. Semakin banyak pengenceran

menunjukkan kadar saliva semakin berkurang dan kadar amilum yang meningkat. Ternyata pada tabung ke 4 sudah mengalami perubahan warna menjadi ungu. Itu artinya bahwa pada tabung ke 4 terjadi interaksi amilum yang lebih besar dengan iodine, sehingga perkiraan unit amylase dengan menggunakan rumus 2n yaitu 16. Normalnya terjadi perubahan warna itu pada tabung ke 7 sehingga unit amylase nya 128. Lain halnya dengan percobaan aktifitas amylase, disini terjadi kesalahan yang begitu fatal. Karena pada percobaan, tabung pertama sudah mengalami perubahan warna menjadi merah coklat. Seharusnya pada percobaan ini pada tabung pertama harus berawal dari warna ungu dahulu sampai akhirnya pada tabung terakhir berwarna merah kecoklatan. Jika pada tabung menunjukkan warna merah kecoklatan itu artinya kadar saliva tinggi dan kadar amilum sedikit pada larutan tersebut. Karena warna ungu terjadi apabila ada interaksi antara amilum dengan larutan iodin. Dengan menggunakan perhitungan Somogyi Units didapatkan hasilnya 2,25 samogyi unit/dl atau 4,16 mol/menit.L. Seharusnya hasil yang baik 3 samogyi unit/dl atau 5,55 mol/menit.L. Perbedaan tidak terlalu signifikan. 2. Pengaruh Kadar Enzim Terhadap Aktifitas Enzim Kadar enzim sangat berpengaruh terhadap aktifitas enzim. Semakin tinggi kadar enzim maka aktifitas enzim akan semakin meningkat, begitu pula sebaliknya. Jika kadar enzim berkurang maka aktifitas enzim akan semakin menurun. Pada percobaan ini menggunakan saliva yang diencerkan berkali-kali. Semakin banyak pengenceran saliva makan aktifitas enzim akan semakin berkurang. Hal itu karena kadar saliva berkurang, kadar amilum justru bertambah, dan nilai absorbansi akan semakin besar. Namun pada percobaan sebenarnya sudah sesuai dengan literature namun ada salah satu titik yang terjadi kesalahan pada masing-

masing percobaan. Pada percobaan pertama yaitu pada pengenceran 80x dan pada percobaan kedua terdapat kesalahan pada larutan blanko. 3. Pengaruh Suhu Terhadap Aktifitas Enzim Kecepatan reaksi enzimatik mencapai puncaknya pada suhu optimum sekitar 37C. Sebagian besar enzim menjadi tidak aktif pada pemanasan 60C karena terjadi denaturasi. Pada percobaan terdapat kesalahan pada titik 10C, 37C, dan 60C. Pada percobaan ini di dapatkan suhu optimal adalah 10C, sedangkan pada literatur sebenarnya suhu optimal adalah 37C, sehingga pada suhu 10C atau di bawah suhu optimum, enzim masih terinaktivasi. Pada suhu 60C seharusnya kurva telah mengalami penurunan, karena pada suhu lebih dari suhu optimal, enzim telah mengalami denaturasi sehingga kecepatan reaksi enzimatik menurun drastis. 4. Pengaruh pH Teradap Aktifitas Enzim Jika pH terlalu asam enzim akan terprotonisasi dan kehilangan muatan negative dan jika pH terlalu basa enzim akan terionisasi dan kehilangan muatan positif. Pada percobaan ini pH optimum yang di dapatkan adalah 6 sesuai dengan literature bahwa pH optimum pada amylase adalah 5,6-7,2. 5. Pengaruh Inhibitor Terhadap Aktifitas Enzim Semakin banyak inhibitor maka akan menurunkan aktifitas kerja enzim. Pada percobaan ini digunakan inhibitor dari Extract Phaseolamin yang bersifat non kompettif. Adanya inhibitor extract phaseolamin pada tabung 2 dan 3 membuat nilai absorbansi tinggi sehingga kecepatan reaksi enzimatik akan berkurang. Lain halnya pada tabung 4 yang tidak menggunakan inhibitor sehingga nilai absorbansinya lebih rendah dan kecepatan reaksi semakin meningkat. 6. Pengaruh Kadar Substrat Terhadap Aktifitas Enzim Semakin besar kadar substrat maka kecepatan enzim akan semakin meningkat. Pada percobaan ini terdapat banyak kesalahan pada beberapa titik kadar substrat yaitu pada kadar 0,25% ; 0,5% ; 1,25% ; 1,5% ; 2%. Seharusnya setiap penambahan kadar substrat menunjukkan nilai kecepatan enzim semakin meningkat bukan malah menurun. Pada percobaan ini tidak dapat dihitung nilai Km karena tidak dapat ditentukan kecepatan maksimalnya.

Dari percobaan diatas terdapat banyak sekali kesalahan. Berdasarkan literatur, nilai absorbansi yang baik adalah 0,2 0,8. Kesalahan-kesalahan tersebut terjadi kemungkinan pada saat pengambilan saliva dan pengambilan substrat amilum. Kemungkinan pada saat pengambilan tidak melakukan pengadukan, sehingga konsentrasi pada larutan tidak merata. Mungkin kesalahan tersebut terjadi karena waktu inkubasi yang tidak dijaga, sehingga telah banyak amilum dan amylase yang bereaksi.

E. KESIMPULAN Dari pecobaan diatas penulis menyimpulkan bahwa uji aktifitas enzim - amylase dalam hidrolisis pati dilakukan dengan menggunakan metode reaksi kualitatif untuk amilum-saliva, colorless point dan aktivitas amylase. Aktifitas enzim dapat dipengaruhi oleh beberapa factor antara lain kadar enzim, kadar substrat, pH, suhu, dan inhibitor.

F. REFERENSI 1. Murray, Robert, dkk. 2009. Enzim: Mekanisme Kerja (in) Wulandari, N, dkk(editor). Biokimia Harper. Ed.27..Buku Kedokteran EGC. Jakarta. 53 2. Maroharsono, Soeharsono. 2006. Biokimia 1. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. 91,114

3. Poedjiadi, Anna, dan Titin Supriyanti. 2006. Dasar-Dasar Biokimia. UI Press. Jakarta. 143,15 4. Johni Azmi. Penentuan Kondisi Optimum Fermentasi Aspergillus Oryzae Untuk Isolasi Enzim Amilase Pada Medium Pati Biji Nangka (Arthocarphus Heterophilus Lmk). Jurnal Biogenesis 2006; Vol. 2(2):55-58

5. Alva, S., Anupama, J. dkk. Production and characterization of fungal amylase enzyme isolated from Aspergillus sp. JGI 12 in solidstate culture. African Journal of Biotechnology. 2007; Vol. 6 (5), 576-581