Escuela de Bioqumica UACh BIOQ251 Luis Guzmn, Sergio Hernndez

Informe 4: Cromatografa en gel Objetivos Separar mediante cromatografa en gel, protenas que presentan distintas pesos moleculares. Comprender la importancia de esta tcnica para la purificacin de protenas.

Resultados Intensidad 1-10 Transparente Transparente Azul 10 Azul 9 Azul 8 Transparente Amarillo 8 Amarillo 9 Amarillo 10 Amarillo 7 Amarillo 6 Amarillo 5 Amarillo 4 Amarillo 3 Amarillo 2 Amarillo 1 Transparente Transparente Tabla 1. Fracciones eludas de muestra a 200 L Numero de Fraccin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Color Intensidad 1-10 Transparente Transparente Transparente Azul 10 Azul 9 Azul 8 Transparente Amarillo 8 Amarillo 9 Amarillo 10 Amarillo 7 Amarillo 6 Amarillo 5 Amarillo 4 Amarillo 3 Amarillo 2 Amarillo 1 Transparente Tabla 2. Fracciones eludas de muestra a 50 L Numero de Fraccin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Color

Figura 1. Representacin de las intensidades obtenidas por nmero de fracciones de muestras a 200 L de azul de dextrano con dicromato de potasio y a 50 L.

Discusin

Apndice

1- Qu puede concluir acerca de los resultados obtenidos en las dos cromatografas realizadas? En primer lugar, la separacin de azul de dextrano y dicromato de potasio se logro de manera eficiente, debido a la obtencin de dos colores en las fracciones, eluyendo en primera instancia el azul de dextrano y luego el dicromato de potasio, de color amarillo. La diferencia en sus pesos moleculares y debido a que el azul de dextrano no se encontraba en el rango de separacin por la columna de sephadex, ya que posee un peso molecular muy, permiti la purificacin de ambas protenas.

2- Qu puede concluir de las distintas fracciones que ha colectado? Podemos concluir que estas posean, a medida que iba aumentando la tonalidad en mismas, distintas cantidades de molculas, por ende distintos pesos moleculares hasta alcanzar la tonalidad ms oscura en ambos casos, lo que nos permite poder cuantificar mas tarde con un espectrofotmetro y calcular los respectivos pesos moleculares de estas sustancias. Sin embargo, en el presente practico inferamos la pronta elucin del azul de dextrano debido a su alto peso molecular, ya que el rango de separacin de la columna de Shephadex G-50, que iba desde 1000 a 30000 producira la pronta elucin del azul de 6 dextrano (que pesa alrededor de 2 x10 D) del dicromato de potasio (que pesa alrededor de 194.2 D), el que finalmente eluye mas tarde de color amarillo.

3- De acuerdo al resultado que Ud. obtuvo, Qu podra decir del peso molecular de ambos compuestos en forma comparativa?
Podemos concluir que el peso del dicromato de potasio se encontraba en el rango de separacin provisto por la columna de Sephadex G-50, y que el dextrano azul se encontraba afuera de este, debido a la pronta elucin por parte de este de la columna, y la posterior elucin del dicromato de potasio, que eluy de color amarillo.

4- Disee un mtodo experimental que le permita cuantificar las muestras eludas.

Luego de realizar la cromatografa de exclusin molecular, y haber separado cualitativamente las muestras eludas se procede a medir las absorbancias de las distintas soluciones en un espectrofotmetro utilizndose como blanco el solvente que las contiene, para de esta manera calcular la concentracin de estas, utilizando la ley de Lambert Beer, juntos con sus respectivos coeficientes de extincin molar obtenidos en la literatura.

5- Qu pasara si en esta misma columna aplica una mezcla de ovoalbmina y albmina (PM = 43.000 y 66.000, respectivamente)? Se separarn ambas protenas? Explique. Si la columna se encontrara en las condiciones utilizadas en el trabajo practico, ambas protenas eluirian rpidamente, ya que estas no se encuentran en el rango de separacin de la columna de Sephadex-50G, siendo sus respectivos pesos moleculares de 43000 para la ovoalbmina y de 66000 separadas de forma efectiva. para la albumina, por lo que estas no serian

6- Con respecto al prctico realizado, qu pasara si el largo de la columna es de 100 cm? Construya un grfico comparativo del resultado esperado.

El largo de la columna utilizada experimentalmente fue de 5 cm, la que permiti una buena separacin de tanto las muestra a 200 L como en la de 50 L. El aumento del largo de la columna a 100 cm permitir una mayor resolucin del proceso, debido a que el recorrido de las molculas es mucho mayor, por ende, las distancias entre las distintas molculas es mas amplia, provocando que el grado de fraccionamiento aumente, lo que podra producir un riesgo debido ala difusin de las partculas, obtenindose resultados alterados.