Ensayos microbiolgicos - 1 LAC- A1

ENSAYOS MICROBIOLGICOS
Prctica n25: Pruebas bioqumicas ms comunes para la identificacin de bacterias.

Irene lvarez Bravo

Ensayos microbiolgicos - 1 LAC- A1

UNIDAD PRCTICA 25: PRUEBAS BIOQUMICAS MS COMUNAS PARA LA IDENTIFICACIN DE BACTERIAS

FUNDAMENTOS. 1. INTRODUCCIN.
Los microorganismos no presentan una variedad de aspectos anatmicos definidos, y por tanto la identificacin de las bacterias se realiza no solo a base a sus caractersticas morfolgicas, sino tambin en funcin de sus caractersticas de cultivo, fisiologa, comportamiento bioqumico, serologa, etc. Ya hemos realizado algunas tinciones que nos informan de la morfologa, tincin de gram, etc., as como el aspecto de los cultivos en medios de laboratorio (forma y pigmentacin de las colonias, etc.).Para identificar las pruebas bioqumicas que en general nos van a poner de manifiesto la capacidad que poseen dichas bacterias para utilizar o transformar ciertas sustancias, produciendo cambios y compuestos que puedan ser detectados de una forma fcil. Nosotros vamos a realizar en el laboratorio algunas de esas pruebas bioqumicas, teniendo presente que es fundamental partir de un cultivo puro. Para una identificacin correcta de los microorganismos debemos consultar algn manual de identificacin.

OBJETIVOS
1. Determinar la capacidad metablica o actividad bioqumica de un microorganismo frente a diferentes sustratos. 2. Utilizar los resultados obtenidos para identificar al posible microorganismo de acuerdo con el sistema correspondiente.

MATERIALES
-Cultivos jvenes (24 a 48 horas) -Tubos de ensayo -Placas Petri -Medios de cultivos correspondientes -Asa de siembre -Hilo de siembra -Reactivos correspondientes -Portaobjetos

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PROCEDIMIENTO Prueba de la oxidasa

Investiga la presencia de la enzima citocromo oxidasa Reactivo: cloruro de tetrametil-p-fenilndiamina.

TCNICA
Se coloca una gota del reactivo sobre papel de filtro y se extiende el cultivo con un asa de platino, palillo de dientes o pipeta Pasteur. La reaccin positiva viene indicada por la aparicin de un color prpura intenso, casi negro en 10 segundos. En caso de que la prueba sea negativa el papel permanece incoloro. Tambin existen unas tiras reactivas comerciales de cambian de color al aadir un inoculo del cultivo puro y segn el tono de color que tome la tira determina la presencia de oxidasa.

Prueba de la catalasa
Investiga la presencia de la enzima catalasa. Reactivo: agua oxigenada 3%.

TCNICA
Se deposita sobre un portaobjetos una gota de agua oxigenada, se emulsiona dentro de la gota una colonia extrada con asa de platino a partir de un cultivo de 24 horas. La presencia de catalasa se pone de manifiesto por un desprendimiento de burbujas.

Prueba O/F
Pone de manifiesto la propiedad de determinados microorganismos de actuar sobre los hidratos de carbono por va oxidativa o fermentativa, las bacterias que no presentan esta actividad sobre los glcidos dan esta prueba negativa. La fermentacin u oxidacin O/F del glcido se puede ver en dos tubos glucosados, uno abierto (aerobio) y otro cerrado con aceite de parafina (anaerobio).

Medio: Hugh y Leifson (medio basal para OF)

TCNICA
Se preparan dos tubos de este medio y se regeneran al bao-mara hirviendo. Se siembra en picadura, se aade parafina estril a un tubo y se llevan a incubar a 37 C. Si la va es oxidativa, solamente el tubo abierto vira ligeramente en la parte superior a amarillo y nunca con produccin

Ensayos microbiolgicos - 1 LAC- A1 de gases. Si la va es fermentativa hay un viraje intenso a amarillo que comienza en la parte inferior de los tubos con o sin produccin de gases.

Prueba de Kligler
Se observa: 1. La desintegracin de los aminocidos azufrados 2. La fermentacin de la lactosa 3. La fermetacion de la glucosa

Medio: Agar Kligler.

TCNICA
Se preparan tubos ligeramente inclinados y se siembran por estras en la superficie y por picadura. La lectura se efecta tras 16 a 24 horas de incubacin a 37 C - Precipitado negro indica SH2(+) - Viraje a amarillo en la parte inferior indica glucosa positiva - Burbujas o ruptura del medio indica gases (+) - Un viraje amarillo en la parte superior indica lactosa (+)

Prueba de reduccin de nitratos

Investiga la reduccin de nitratos a nitritos o a N2

Medio: indol-nitrito Reactivo: cido sulfnilico y alfa- naftilamina.

TCNICA
A un cultivo de 48 horas en el medio con nitrato se le aade 0,5 mL de cada reactivo. Se observa al cabo de unos minutos una coloracin rosa o roja en presencia de nitritos. Si los nitritos se han reducido a N2 o si no ha habido reduccin de los nitratos, se aade una pequea cantidad de polvo de zinc y la aparicin de la coloracin roja (debido a la reduccin de los nitratos por el zinc) confirma que la bacteria no ha sido capaz de reducir los nitratos.

Prueba del indol

Investiga la presencia de la enzima triptofanasa de las bacterias cultivadas.

Medio: indol-nitrito Reactivo: Kovacs.

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TCNICA
Se siembra la bacteria en un tubo con medio indol-nitrito y se incuba a 37C durante 48 horas. Se aade el reactivo de Kovacs y se agita. En el caso de que la prueba sea positiva se observa en la parte superior (alcohlica) un anillo rojo.

Prueba del rojo de metilo

Bacterias (anaerobias, anaerobias facultativas) en medio glucosado, transforma la glucosa en cidos orgnicos, que van a disminuir el pH a menos de 5 al cabo de 48 horas de incubacin. Esta caracterstica se detecta con el viraje al rojo del indicador rojo de metilo. Las bacterias fermentadores de azucares pueden hacerlo mediante rutas diferentes, as algunas pueden seguir una ruta fermentativa cido-mixta.

Medio: medio glucosado ( Clark y Lubs) Reactivo: rojo de metilo

TCNICA
Se siembra la bacteria y se incuba a 37C durante 48 horas. Se aaden varias gotas de reactivo. Se observa en caso de RM(+) un viraje a rojo y en el caso de RM (-) hay una coloracin amarilla.

Prueba de Voges- Proskauer

Investiga la capacidad de fermentacin de glucosa por algunos microrganismos, conduciendo a formar acetil-metil-carbonil o acetona.

Medio: medio glucosado ( Clark y Lubs) Reactivo: alfa-naftol y KOH

TCNICA
A un cultivo de 48 horas de este medio glucosado se le aaden 0,5 mL de cada reactivo y se agita. Una coloracin rosa en menos de una hora indica VP(+).

Prueba de utilizacin de citratos

Determina si el microorganismo es capaz de utilizar los citratos como nica fuente de carbono.

Medio: agar de Simmons

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TCNICA
Se siembra en un tubo y se incuba a 37C durante 48 horas. Se aaden varias gotas de reactivo. La prueba es positiva si se observa el crecimiento acompaado de un viraje a color azul.

Prueba de la ureasa
Investiga presencia de una enzima en las bacterias capaz de hidrolizar la urea a carbonato amnico que se detecta por la alcalinizacin del medio.

Medio: agar de Christensen, al que se le aade urea al 20% esterilizada por filtracin.

TCNICA
Se preparan tubos con el medio, se siembra masivamente y se incuba a 48 horas a 37C. La aparicin de un color rosado debido a la alcalinizacin del medio indica que la prueba es positiva.

Prueba de hidrlisis de la gelatina

Investiga la presencia de la enzima gelatinasa en algunos microorganismos.

Medio: agar gelatina Reactivo: Frazier

TCNICA
Se siembra el microorganismo en agar gelatina y se incuba a 37C durante 48 horas. Para la lectura se aade reactivo Frazier y se da como positivo si aparece un halo transparente alrededor del cultivo y negativo en caso de que no aparezco dicho halo y quede opaco como el resto de la placa, seal de que la gelatina no ha sido hidrolizada.

Prueba de hidrlisis del almidn

Investiga la capacidad de hidrolisis del almidn de algunos microorganismos.

Medio: agar almidn Reactivo: solucin de lugol

TCNICA
Se preparan placas con este medio y se siembran tocando en varios puntos. Se incuban a 37C durante 48 horas. La aparicin de unas zonas de aclaramiento alrededor del crecimiento o de un halo transparente al adicionar el lugol indica que la prueba es positiva.

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RESULTADOS
Bacteria: klebsiella
Prueba Medio Reactivo T y tiempo Soporte medio Tiras reactivas Resultado

Oxidasa (OXI)

10 sg

POSITIVO. Color azul.

Presenta dos colores: rojo en la parte superior y amarillo en la parte inferior del tubo. Por tanto el resultado: gluc.+

Kligler (KIA)

Agar Kligler

16 24 horas 37 C

Tubo en pico de flauta

Reduccin NO3 A.N. + KNO3 Triptona+NaCl + Agua

-naftilamina Ac. Sulfanilico

48 horas, 37 Tubo inclinado NEGATIVO (rosa tras C aadir el zinc) Tubo NEGATIVO (no hay
anillo rojo en el medio)

Indol (IND)

Kovacs

Rojo-Metilo (RM) VogesProskauer (VP) Citratos (CIT)

Caldo RM-VP

Rojo metilo

Tubo

POSITIVO (Color rojo)

Caldo RM-VP

-naftol+ KOH

Tubo

POSITIVO (Color rosa)

Agar Simmons

Tubo inclinado El medio estaba

caducado por lo que el resultado de esta prueba es errneo.

Ureasa (URE)

Bactourea agar base

Almidn

Agar almidn

Lugol

Tubo inclinado POSITIVO (Color rojorosado) NEGATIVO ( no hay aparicin de un halo Placa
transparente tras aadir lugol)

Catalasa (CAT)

H2O2

Portaobjetos POSITIVO( Presencia

de burbujas de oxgeno al aadir agua oxigenada) Resultado errneo pues el tubo que manifiesta color amarillo ligeramente en la parte superior, va fermentativa, es el tubo con parafina (proceso anaerobio)

xidofermentativa O/F

Agar Hug y Leifson + el 10% de disoluc del azcar a ensayar al 10%

1 tubo abierto 48-72 horas 37 C

1 tubo cubierto con parafina.

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POSITIVO. Halo Hidrlisis de la Agar gelatina Frazier gelatina AN + 40g/l de gelatina 2 a 7 das 37 C Placa
transparente alrededor del crecimiento bacteriano

RESULTADO PRUEBA DE LA AMILASA (hidrlisis del almidn)- Bacteria: klebsiella

CONCLUSIONES
Esta prctica tiene una gran importancia pues con su realizacin aprendemos las pruebas bioqumicas que se le pueden determinar la capacidad metablica o actividad bioqumica de un microorganismo, adems de aprender una gran cantidad de pruebas para estas determinaciones , aprendemos tambin distintos medios de cultivo y la utilidad de cada uno de ellos.