ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE (analtica e preparativa)

PREPARO DO GEL DE AGAROSE (0,8%): 1. Para 100mL de gel, pesar 0,8g de agarose. 2. Adicionar 100mL de TAE 1X. 3. Fundir a soluo no microondas at homogeneizar (aproximadamente 1 min e 10 seg na potncia mxima evitar fervura). 4. Enquanto a soluo de gel esfria (morno), preparar o suporte de gel, selando as laterais com fita crepe ou na prpria cuba. 5. Acrescentar 4L de Brometo de Etdeo (10mg/mL) e misturar com agitao leve. Obs.: Brometo de Etdio mutagnico e deve ser manuseado com luvas. 6. Despejar a soluo de gel no suporte sem fazer bolhas. 7. Colocar o pente da espessura desejada no suporte. Obs.: Verificar o nmero e o volume das amostras para escolher o pente mais adequado. 8. Esperar a soluo solidificar. 9. Colocar o suporte com o gel na cuba de eletroforese. Adicionar tampo TAE 1X at cobrir a superfcie do gel. ANALTICA: 1. Extrair 3L da amostra de DNA. 2. Homogeinizar com 1L de tampo de corrida 5X (Loading Buffer). 3. Aplicar as amostras nos poos. 4. Reservar 2 poos para utilizao de um padro de corrida (Ladder-1Kb). 5. Ajustar a voltagem de acordo com o tempo de corrida desejado (mdia utilizada 80V). 6. Analisar o gel sob radiao ultravioleta (Alpha Imager). 7. Tirar foto dos resultados obtidos. PREPARATIVA: 1. Adicionar tampo de corrida ao material a ser purificado (diluio de 5X). 2. Aplicar as amostras nos poos, pulando um poo entre cada amostra para evitar contaminao. Para volumes maiores, montar o gel com o pente de
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dentes largos ou unir os dentes do pente com fita adesiva antes de colocar o pente no gel ainda lquido (morno). 3. Aplicar em outro poo o padro de tamanho molecular (Ladder-1kb). 4. Ajustar a voltagem de acordo com o tempo de corrida desejado (mdia utilizada 80V). 5. Vizualizar as bandas no gel utilizando a luz ultravioleta manual no comprimento de onda longo. 6. Cortar a banda desejada utilizando bisturi limpo e coloc-la em um tubo de microcentrfuga previamente pesado. 7. Seguir protocolo de Purificao de DNA a partir de Gel.

SOLUES:
Tampo de corrida: soluo TAE 1X ( Tampo Tris-Acetate - Tris 40mM, Ac. Acetico 20mM,EDTA 1mM) diluir a soluo estoque 50x em gua Milli-Q. TAE 50X (Soluo estoque) Trizma-Base cido actico glacial EDTA 0.5M pH 8.0 gua q.s.p. Tampo de amostra 5X ( Loading Buffer ) Glicerol (50%) Azul de Bromofenol (0.125%) Xileno Cianol (0.125%) TE pH8,0 q.s.p. Padro de tamanho molecular ( Ladder-1kb)
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p/ 1L 242,0g 57,1mL 100,0mL 1000,0mL

p/ 50mL 25,0mL 0,0625g 0,0625g 50,0mL

(0,1g/L)

Ladder 1kb (Gibco BRL - 1g/L) Tampo (Tris 10mM pH7,5, NaCl 50mM, EDTA 0,1mM) Loading Buffer 5X Brometo de etdeo (10mg/mL) Brometo de etdeo gua Milli-Q q.s.p. 1g 400L

100L

500L

100mL

Agitar durante 16 horas, guardar a 4 C. obs.: concentrao no gel: 5g/mL

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