Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik LAPORAN RESMI PENENTUAN JUMLAH SEL MIKROORGANISME

I.

Tujuan Tujuan dari percobaan penentuan jumlah sel mikroorganisme adalah : 1. Mempelajari cara menghitung jumlah sel mikroorganisme menggunakan metode turbidimetri. 2. Mempelajari cara menghitung jumlah sel mikroorganisme menggunakan metode counting chamber.

II.

Hasil Percobaan

II.1 Metode Turbidimetri Berat fermipan = 1 gram Faktor Pengenceran 1:1 1:2 1:4 1:8 1 :16 %T 0,10 0,13 0,20 0,53 1,63 Optical Density 3,000 2,886 2,699 2,276 1,788

II.2 Metode Counting Chamber Berat fermipan = 1 gram 1. Pengenceran 10.000x RUN 1. 2. 3. KOTAK A 39 40 37 B 40 52 50 C 40 37 38 D 51 46 49 E 63 60 58 TOTAL 240 235 232
JUMLAH SEL KOTAK

48 47 46.4 141,4

Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

Jumlah sel ragi rata-rata

= 141,4 3 = 47,13 sel/kotak

Jumlah sel ragi

= 47,13

sel kotak x 25 = 1178,25 sel/mm2 2 mm kotak 1 sel x 10 2 mm mm

= 1178,25

= 11782,5 sel/mm3

Jadi jumlah sel ragi pada pengenceran 10.000 x = 11782,5

sel mm 3 x 1000 mm 3 cm

= 1,178 x 107 sel/ml sampel

2. Pengenceran 100.000x RUN 1. 2. 3. KOTAK A 4 2 3 B 5 5 6 C 4 5 3 D 5 6 7 E 6 7 4 TOTAL 24 26 23

JUMLAH SEL KOTAK

4,8 5,2 4,6 14,6

Jumlah sel ragi rata-rata

= 14,6 3 = 4,867 sel/kotak

Jumlah sel ragi

= 4,867

sel kotak x 25 = 121,675 sel/mm2 kotak mm2 1 sel x 10 2 mm mm

= 121,675

= 1216,75 sel/mm3
Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

Jadi jumlah sel ragi pada pengenceran 100.000 x = 1216,75

sel mm 3 x 1000 mm 3 cm

= 1,21675 x 106 sel/ml sampel

3. Pengenceran 1.000.000 x RUN 1. 2. 3. KOTAK A 0 0 0 B 1 0 1 C 2 1 2 D 0 0 1 E 1 1 0 TOTAL 4 2 4

JUMLAH SEL KOTAK

0,8 0,4 0,8 2

Jumlah sel ragi rata-rata

2 3

= 0,67 sel/kotak

Jumlah sel ragi

= 0,67

sel kotak x 25 = 16,67 sel/mm2 kotak mm2

1 sel x 10 2 mm mm

= 16,67

= 166,7 sel/mm3 Jadi jumlah sel ragi pada pengenceran 1.000.000 x = 166,7
sel mm 3 x 1000 mm 3 cm

= 1,667 x 105 sel/ml sampel

Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik III. Pembahasan

Tujuan dari percobaan ini adalah pengukuran kuantitatif populasi mikroba. Massa sel dapat ditentukan dengan beberapa metode. Metode yang paling umum digunakan adalah pengukuran kekeruhan suspensi sel. Pada percobaan kali ini, kita menggunakan dua metode, yaitu metode turbidimetri dan metode counting chamber. III.1 Metode Turbidimetri Percobaan ini bertujuan untuk menghitung jumlah sel mikroorganisme dengan metode turbidimetri. Metode ini menggunakan alat spektrofotometer. Spektrofotometer yang digunakan untuk metode turbidimetri ini adalah spectronic-21. Pada saat akan melakukan percobaan ini, terlebih dahulu menyalakan alat spektrofotometer selama kurang lebih 15 menit agar alat tersebut mencapai kesetimbangan thermal dan kondisinya stabil sehingga data yang diperoleh lebih akurat. Panjang gelombang diatur pada 686 nm. Selanjutnya mengatur sehingga jarum menunjukkan skala serapan (A) pada tak hingga dan %T pada angka 0 dengan tujuan menghapuskan arus gelap yang disebabkan oleh cahaya bocor. Cahaya bocor adalah radiasi panjang gelombang tak tentu yang dipantulkan dalam monokromator yang dapat menemukan jalan keluar. (Day, R.A. dan Underwood. 1994. Hal:406) Prosedur pertama yang dilakukan adalah melakukan pengenceran terhadap suspensi ragi. Ragi biasanya mengandung mikroorganisme yang melakukan fermentasi dan media biakan bagi mikroorganisme tersebut. Pada percobaan, ragi yang digunakan adalah fermipan dan mikroorganisme yang terdapat di dalamnya adalah Sacharomyces cereviciae. Kemudian Pengenceran dilakukan dengan melarutkan 1 gram fermipan dengan 10 ml aquades. Setelah itu mengocok larutan hingga homogen. Lalu mengisi dengan aquades semua tabung reaksi yang sebelunya datandai dengan label, yaitu 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, dan 1:16 sebanyak 4 ml, kecuali tabung reaksi 1:1. Setelah itu mengambil 4 ml dari larutan 10 ml yang telah diencerkan tadi, kemudian memasukkan ke dalam tabung reaksi 1:1 dan 1:2, lalu mengocoknya hingga homogen. Setelah itu memindahkan 4 ml larutan dari

Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

tabung reaksi 1:2 ke dalam tabung reaksi 1:4 lalu mengocoknya hingga homogen. Dan begitu seterusnya hingga tabung reaksi 1:16. (Day, R.A. dan Underwood. 1994. Hal:406) Langkah selanjutnya adalah melakukan kalibrasi terhadap masing-masing sampel pengenceran. Kalibrasi ini menggunakan aquades dikarenakan pelarut yang digunakan adalah aquades. Kemudian mengatur jarum hingga menunjuk skala serapan (A) pada 0 dan %T pada angka 100. Setelah itu melakukan pengukuran persen transmitan (%T) untuk kelima tabung menggunakan spektrofotometer. Kuvet yang akan digunakan harus dibersihkan terlebih dahulu dengan menggunakan tisu agar saat pengukuran tidak terjadi kesalahan karena terhalang air dan kotoran lainnya. Adanya sidik jari pada permukaan kuvet dapat mempengaruhi pembacaan. Dari nilai %T yang diperoleh, maka dapat dihitung besarnya Optical Density (OD) dengan menggunakan persamaan : OD = 2 - log %T Optical density (OD) adalah jumlah cahaya yang diteruskan dan diserap oleh sel dalam suatu larutan. Semakin banyak mikroorganisme dalam suatu larutan (pekat), maka kekeruhan dari larutan juga akan semakin tinggi. Sehingga nilai persen transmitan (%T) akan semakin kecil (nilai OD nya semakin besar). Dari hasil perhitungan yang diperoleh, maka dapat dibuat grafik hubungan antara Optical Density (OD) dengan pengenceran (dillution). Grafik yang diperoleh berupa garis linear yang berbentuk diagonal ke arah kanan. Dari grafik dapat dilihat bahwa semakin keruh larutannya, maka nilai OD nya semakin besar. Hal ini menunjukkan bahwa di dalam larutan yang keruh terdapat lebih banyak sel mikroorganisme sehingga semakin besar jumlah cahaya yang diteruskan dan diserap oleh sel dalam larutan.

Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

3.5 3 2.5 Optical Density (OD) 2 1.5 1 0.5 0 1:16 1:8 1:4 Pengenceran (Dillution) 1:2 1:1 y = 0.3034x + 1.6196

Grafik III.1.1 Grafik Turbidimetri OD vs Dillution

III.2 Metode Counting Chamber Percobaan ini memiliki tujuan yang sama dengan turbidimetri, yaitu menghitung jumlah sel mikroorganisme. Metode counting chamber ini merupakan cara cepat dalam menentukan jumlah sel mikroorganisme. Pertama-tama yang dilakukan adalah menimbang fermipan sebanyak 1 gram, yang kemudian melarutkan dengan aquades hingga 10 ml. Kemudian menyiapkan 6 tabung reaksi dan memberi label pada masing-masing tabung reaksi untuk setiap pengenceran 10 x, 100 x, 1.000 x, 10.000 x, 100.000 x, dan 1.000.000 x. Kemudian, mengisi masing-masing tabung dengan 9 ml aquades untuk proses pengenceran. Mengambil fermipan yang telah diencerkan pada tabung 10 x dan menuangkan ke tabung reaksi 100 x, demikian seterusnya hingga tabung reaksi 1.000.000 x. Semakin encer larutan maka akan semakin sedikit pula jumlah sel mikroorganisme yang terdapat dalam larutan tersebut. Setiap pengenceran, suspensi diaduk hingga homogen. Hal ini dilakukan untuk menghindari jumlah sel yang hanya mengelompok pada satu titik saja sehingga nantinya akan sulit menghitung jumlah sel dari Sacharomyces cereviciae yang

Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

terdapat di dalam fermipan. Perhitungan pun menjadi tidak akurat karena sel mikroorganisme tersebar kurang merata. Pada metode ini, percobaan menggunakan hemasitometer yang memiliki luas 1/25 mm2 dan lebarnya 1/100 mm tiap satu kotaknya. Hemositometer adalah alat yang digunakan untuk menghitung jumlah sel mikroba pada sspensi, alat ini ditemukan oleh Louis-Charles Malassez dan terdiri dari sebuah slide mikroskop kaca tebal dengan lekukan persegi panjang yang menciptakan sebuah kamar. Setelah itu meneteskan suspensi pada pengenceran 10.000x pada salah satu sisi hemositometer kemudian menutupnya dengan deck glass, tidak boleh ada gelembung pada proses ini, karena akan membingungkan pada saat menghitung jumlah mikroba, lalu menghitung jumlah selnya dengan menggunakan mikroskop pada perbesaran 25x. Pada perbesaran ini, jumlah sel sudah dapat terlihat. Sebelum menghitung jumlah sel, yang dilakukan terlebih dahulu adalah menentukan letak kotak A, B, C, D, dan E pada hemositometer tersebut. Penentuan letak tersebut bebas, namun letak kotak tersebut harus sama seterusnya pada pengamatan dan perhitungan selanjutnya. Setelah pengamatan, dapat dihitung jumlah sel bakteri pada titik A , B, C, D, dan E. Pengamatan dilakukan sebanyak 3 kali kemudian menjumlahkan semua merata-ratakannya. Dari hasil perhitungan, maka diperoleh jumlah sel mikroorganisme dalam sel/ml sampel. Hal yang yang sama dilakukan untuk menghitung jumlah sel mikroorganisme pada pengenceran 100.000x dan 1.000.000x. Dari hasil perhitungan, diperoleh jumlah sel mikroorganisme pada pengenceran 10.000x sebanyak 1,178 x 107 sel/ml sampel.Pada pengenceran 100.000x sebanyak 1,12675 x 106 sel/ml sampel dan untuk pengenceran 1.000.000x sebanyak 1,667 x 105 sel/ml sampel. Namun ada beberapa hal yang harus diperhatikan, misalnya sel yang sudah mati tidak dapat dibedakan dengan sel yang masih hidup, sel-sel yang kecil sulit untuk diamati pada mikroskop, sulit untuk memperoleh hasil dengan ketelitian yang tinggi, serta metode ini tidak cocok digunakan untuk kerapatan rendah. Jika suspensi sel hanya terdapat 106 sel/mm, hanya sedikit sekali yang dapat terlihat pada mikroskop.
Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik III.3 Membuat Kurva Kalibrasi Jumlah Sel Mikroorganisme vs OD

Diperoleh jumlah sel mikroorganisme pada pengenceran 10.000x, 100.000x, dan 1.000.000x pada metode counting chamber, dengan menjumlahkan kemudian merata-ratakannya akan diperoleh data untuk turbidimetri pada 1:1, yaitu : 11780000 + 1216750 + 166700 3 = 4387816,667

Yang kemudian dapat diperoleh hasil perhitungan pada tabel berikut : Faktor Pengenceran 1:1 1:2 1:4 1:8 1 : 16 Optical Density (OD) 3,000 2,886 2,699 2,276 1,788 Jumlah Sel pada Fermipan 4387816,667 2193908,333 1096954,167 548477,083 274238,542

Dari data-data tersebut, maka dapat diperoleh grafik hubungan antara jumlah sel mikroorganisme dengan OD.
5000000 4500000 4000000 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 0 0.5 1 1.5

y = 3E+06x - 5E+06

Optical Density (OD)

2.5

3.5

Jumlah Sel Grafik III.3.1 Grafik Jumlah Sel vs OD

Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik

14000000 12000000 10000000 8000000

Jumlah Sel

6000000 4000000 2000000 0 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000

y = -7.448x + 7E+06

Dillution
Grafik III.2.2 Grafik Jumlah Sel vs Dillution Berdasarkan hasil percobaan, semakin besar nilai OD, maka semakin besar jumlah cahaya yang dihamburkan dan diserap oleh sel dalam suatu larutan. Hal ini membuktikan bahwa di dalam larutan tersebut terdapat sel mikroorganisme dalam jumlah yang besar. Dari grafik III.3.1 persoalan untuk larutan fermipan dapat dicari. Berdasarkan hasil pengamatan, %T larutan fermipan adalah 93%. Sehingga ODnya adalah 2,032. Persamaan : y = 3.106 x 5.106 y = 3.106 (2,032) 5.106 y = 1,096 x 106 sel/ml sampel

Jadi larutan fermipan 1,096 x 106 sel/ml sampel.

mengandung Saccharomyces cerevisiae sebanyak

IV. Jawaban Pertanyaan 1. Apakah hubungan antara OD dengan jumlah sel pada kultur Saudara? Jawab : Dari kultur pada percobaan, kuadrat OD berbanding lurus dengan jumlah sel.

Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS

Laporan Resmi Praktikum Mikrobiologi Teknik 2. Apakah yang diperlukan untuk membuat suatu hubungan perhitungan jumlah sel dengan metode I (dillution) dan metode II (turbidimetri)? Jawab : Perbandingan faktor pengenceran yang sama antara perhitungan jumlah sel dengan metode I (dillution) dan metode II (turbidimetri).

10

V.

Kesimpulan

1. Dari data perhitungan didapatkan hubungan antara OD dan junlah sel : Optical Density (OD) 3,000 2,886 2,699 2,276 1,788 Jumlah Sel pada Fermipan 4387816,667 2193908,333 1096954,167 548477,083 274238,542

2. Jumlah sel Saccharomyces cerevisiae pada larutan fermipan adalah 1,096 x 106 sel/ml sampel.

Daftar Pustaka Day, R.A. dan Underwood. 1994. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta : Erlangga. Kenny Astarina, Dhevie. Jurnal Efek Fraksi Alkaloid Daun Jarong. UNAIR : Surabaya Murhadi. 1996. Jurnal Studi Pertumbuhan Isolat Bakteri. UNILA : Lampung

Laboratorium Mikrobiologi Teknik Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS