Marcadores moleculares: Qu son, cmo se obtienen y para qu valen

M. Gonzalo Claros Daz

Desde la prehistoria, el hombre ha seleccionado y mejorado especies vegetales, animales y microbianas basndose en el fenotipo. Las mejoras genticas eran posible gracias a la variabilidad gentica, a la heredabilidad del carcter que se quera aislar, a la eficacia e intensidad de la seleccin aplicada, y al tiempo necesario para realizar un ciclo de seleccin. Sin embargo, quedan muchos aspectos desconocidos, como son el nmero y efecto de los genes implicados en la expresin de un carcter, la localizacin de estos genes, y su funcin fisiolgica. Por otra parte, la taxonoma siempre ha estudiado caractersticas morfolgicas, lo cual requiere observaciones muy exhaustivas de los organismos en diferentes estadios de desarrollo. Los criterios utilizados carecen muy a menudo de definicin y objetividad y, en cualquier caso, son marcadores ambiguos debido a las influencias ambientales. Afortunadamente la aparicin de los marcadores moleculares est ayudando a eliminar tanto los inconvenientes de una seleccin basada en el anlisis exclusivo del fenotipo, como la identificacin de especies y variedades de una forma ms rigurosa y repetitiva. Los marcadores moleculares son biomolculas que se pueden relacionar con un rasgo gentico. Las biomolculas que pueden ser marcadores moleculares son las protenas (antgenos e isoenzimas) y el DNA (genes conocidos o fragmentos de secuencia y funcin desconocida). Cuando varios marcadores moleculares se asocian inequvocamente con un rasgo gentico, se dice que forman un QTL (loci de rasgos cuantitativos o cuantificables). Un marcador molecularmonomrfico es invariable en todos los organimos estudiados, pero cuando presenta diferencias en el peso molecular, actividad enzimtica, estructura, o sitios de restriccin, se dice que es polimrfico. A veces el grado de variacin es tal que se denominan hipervariable. Los primeros marcadores desarrollados a finales de los 70 se basaron en la identificacin de protenas e isoenzimas por electroforesis en geles de almidn o poliacrilamida. Con ellos se abri el conocimiento de la estructura y heterogeneidad gentica entre diferentes especies, variedades, y poblaciones de distinto origen geogrfico. Pero esta tcnica tena una lmitacin muy importante: no era capaz de detectar suficiente polimorfismo entre variedades o especies

prximas debido a que las protenas son el resultado de la expresin gnica, que puede ser distinta de unos tejidos a otros, de una etapa de desarrollo a otra, de un medio ambiente a otro, y de una poca del ao a otra. Los avances de la tecnologa del DNA recombinante han permitido el desarrollo de los marcadores moleculares basados en el DNA, consiguiendo estabilidad en la identificacin de especies y variedades. El nmero de tcnicas descritas es cada vez ms numeroso, por lo que vamos a reunirlas en 3 categoras: RFLP, MAAP y STS. Pero antes conviene saber lo que es una PCR (reaccin en cadena de la polimerasa), descrita en 1988. La PCR es una de las tcnicas esenciales para la preparacin de huellas dactilares, si bien no vale para elaborar marcadores por s sola. La reaccin bsica de la PCR comienza con la desnaturalizacin del DNA molde para separar las cadenas, contina con el alineamiento de un par de oligonucletidos con su DNA molde, y termina con la polimerizacin para sintetizar un nuevo DNA entre los dos oligonucletidos. De aqu se vuelve a la desnaturalizacin para comenzar un nuevo ciclo. Hoy en da todo el proceso esta completamente automatizado en un aparato llamado ?termociclador?, y existe una batera de enzimas y condiciones que permiten polimerizar hasta 35 kpb sin errores, aunque las condiciones normales amplifican sin problemas fragmentos de 3 a 6 kpb de longitud. RFLP (Polimorfismo en el tamao de los fragmentos de restriccin). Esta tcnica, desarrollada a finales de los 70, se basa en la deteccin de fragmentos de DNA de distinto peso molecular (por digestin con la misma enzima de restriccin) en diferentes organismos. Los fragmentos ms fciles de analizar son los ?pequeos? derivados de la digestin del genoma de las mitocondrias o los cloroplastos, puesto que delecciones, sustituciones o mutaciones pueden alterar significativamente el patrn de bandas identificable por electroforesis en geles de agarosa, donde migran de acuerdo con su peso molecular. En cambio, para molculas de DNA de mayor tamao, como el DNA cromosmico, el patrn de bandas es tan complejo que es necesario utilizar sondas especficas para visualizar slo ciertos fragmentos mediante la tcnica de Southern Blot. Las sondas de DNA para esta tcnica suelen corresponder a genes previamente conocidos, aunque a veces se usan DNA preparados a partir de amplificaciones inespecficas. Aunque la RFLP evala slo un tipo de polimorfismo en cada ensayo, el resultado es muy preciso. Los primeros mapas genmicos basados en la distribucin fsica de los genes en vez de la frecuencia de entrecruzamiento se hicieron utilizando esta tcnica. Cuando se emplea la PCR en lugar de sondas radiactivas para visualizar los polimorfismos, se le denomina PCR-RFLP MAAP (Mltiples perfiles arbitrarios de amplificacin) Trmino genrico acuado en 1994 con el que se designan las tcnicas que

emplean oligonucletidos arbitrarios para generar huellas dactilares complejas. Entre estas tcnicas caben destacar:

RAPD (DNA polimrfico amplificado al azar): Es una de las tcnicas ms verstiles desde que se desarroll en el ao 1990. Se usa una coleccin de decanucletidos para amplificar por PCR reas especficas distribudas al azar por el genoma. Su pequeez y la baja temperatura de alineamiento (36C) aseguran que se unen a infinidad de secuencias en el genoma para conseguir amplificar muchos fragmentos de DNA. Estos fragmentos se pueden separar en geles de agarosa para obtener perfiles electroforticos que variarn segn el polimorfismo de los distintos individuos o grupos de individuos, y proporcionarn una huella dactilar caracterstica. Es muy cmoda, rpida, requiere poco DNA que adems no necesita estar muy puro, no presupone conocimientos previos sobre la secuencia, y se pueden distinguir rpida y simultneamente muchos organismos. Sus inconvenientes son que los fragmentos amplificados no suelen corresponder a DNA ligado a algn carcter, sino redundante, y que no da informacin sobre el nmero de copias que el DNA genmico contiene de la secuencia amplificada. Esta tecnologa ha sido utilizada para la catalogacin de frutos, seleccin de variedades, y diferenciacin de lneas clonales. Tambin se est utilizando para el anlisis de las variedades de apio, uva, limn y olivo. AP-PCR (PCR con oligonucletidos arbitrarios): La idea es similar a la de la RAPD, desarrollndose a la vez que sta, aunque se cambia el diseo de los oligonucletidos y el tipo de PCR. Los oligonucletidos han de ser largos (no menos de 20 nt), y la PCR consta dos de ciclos de baja astringencia (poco especficos) que permite la polimerizacin de una batera de fragmentos caractersticos de cada variedad. Esta fase va seguida de ciclos de alta astringencia para amplificar (visualizar) especficamente las bandas anteriores. Los fragmentos amplificados se pueden migrar en un gel de agarosa para observar las grandes diferencias entre especies, o bien se puede marcar radiactivamente y migrar en gel de poliacrilamida para obtener resultados mucho ms finos y precisos. Existe una variacin denominada DAF (Huellas dactilares por amplificacin de DNA) que utiliza oligonucletidos de 5 a 15 bases, pero las huellas proporcionadas suelen ser muy complejas y difciles de interpretar. AFLP (Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados): Esta tcnica se desarroll en 1995 y combina el uso de enzimas de restriccin y oligonucletidos para PCR, de manera que se obtienen marcadores moleculares muy especficos sin necesidad de conocer la secuencia con anterioridad. El DNA se corta con dos enzimas de restriccin, una de corte

muy frecuente, y otra de corte poco frecuente. A los fragmentos se les ligan oligonucletidos de extremos compatibles con las enzimas usadas.y se amplifica por PCR. Jugando con la complementariedad del oligonucletido con el sitio de restriccin se puede disminuir o aumentar el nmero de bandas amplificadas. Una ventaja especial de esta tcnica es que es capaz de generar muchos marcadores moleculares en una sola reaccin. Por eso el resultado debe resolverse en un gel de poliacrilamida de alta resolucin, puesto que no se resolveran en agarosa. Esta tcnica ya se ha usado con xito en patatas y cebada. STS (Sitios etiquetados por la secuencia) o SSLP (Polimorfismo de longitud en las secuencias discretas) Desarrollada a partir de 1989, aprovecha las secuencias conocidas, nicas dentro del genoma, para amplificarlas por PCR. El polimorfismo se suele encontrar fcilmente cuando lo que se amplifican son intrones en lugar de exones. La ventaja principal es la velocidad con la que se pueden realizar los anlisis una vez que las parejas de oligonucletidos se han establecido claramente. Por tanto se combinan la rapidez de la RAPD con la especificidad de la RFLP. Por la manera en que se determinan los oligonucletidos y por la forma de analizar los polimorfismos, esta tcnica ha derivado en otras que enumeramos a continuacin: SSR (Repeticin de secuencias discretas), descrita en 1989. En los genomas existe un DNA ubicuo y abundante denominado "microsatlite" que consiste en mono-, di-, tri- y tetranucletidos repetidos en tndem. Este DNA, que es muy polimrfico, se ha utilizado como marcador molecular cuando la secuencia del motivo repetido se clona y secuencia para usarla en el anlisis de poblaciones. De esta manera se han estudiado con xito numerosos rboles, aunque en algunos se ha visto que los microsatlites son menos variables de lo que se esperaba. Otras siglas para designar esta tcnica son ISSR, IMA, ISA, IRA, y RAMP. EST (Sitios etiquetados por la expresin), descrita en 1991. Su particularidad proviene del hecho que los oligonucletidos se han deducido a partir de cDNA parcial o completamente secuenciado. Curiosamente el polimorfismo slo se observa claramente cuando los fragmentos amplificados se cortan con enzimas de restriccin, lo que hace que el mtodo sea realmente costoso en tiempo y dinero. CAPS (Secuencia polimrfica amplificada y cortada), descrita en 1993. Los fragmentos amplificados se someten a una restriccin enzimtica y se migra en un gel de agarosa. Las variaciones se detectan por presencia o ausencia de sitios de restriccin. Se pueden as localizar cambios finos en una zona especfica.

SCAR (Regiones amplificadas caracterizadas y secuenciadas), descrita en 1993. Esta tcnica aprovecha que las RAPD proporcionan principalmente fragmentos de DNA altamente repetido. Estos fragmentos de RAPD se clonan y secuencian para elaborar oligonucletidos especficos. Aunque permite el desarrollo rpido de marcadores moleculares, el grado de polimorfismo obtenido es bastante bajo. D/TGGE (Geles de electroforesis en gradiente desnaturalizante/trmico), descrita en 1987. Analiza el polimorfismo a travs de la estabilidad, a distintas condiciones Desnaturalizantes o Temperaturas, del DNA amplificado. Su principal problema reside en las dificultades tcnicas para manetener estables las condiciones experimentales. SSCP (Polimorfismo de conformaciones monocatenarias), descrita en 1989. Esta tcnica se basa en el anlisis del polimorfismo a travs de las diferencias conformacionales de fragmentos de DNA monocatenario. Las distintas conformaciones son detectables como un cambio de movilidad en geles de poliacrilamida no desnaturalizante. Es especialmente til cuando las reacciones de PCR producen bandas de DNA de gran tamao (en general superior a 1?5 kpb) o bien bandas de tamao muy prximo. Puede llegar a distinguir cambios de pocos nucletidos en una secuencia de ms de 1 kpb. Se est utilizando para caracterizar rboles de inters forestal.

Las aplicaciones de los marcadores moleculares son muy diversas y es de esperar que cada vez se les encuentren nuevos usos. Por ahora se vienen empleando en la diferenciacin de individuos, discriminacin entre clones, anlisis filogenticos y taxonmicos, mapeo de genomas, cuantificacin de variabilidad gnica intra e interespecfica, mejoras genticas, deteccin de infecciones o propensin a sufrirlas, localizacin de resistencia a enfermedades, y dispersin de especies. En internet se puede obtener informacin adicional en las pginas web:www.ndsu.nodak.edu/insctruct/mcclean/plsc431/markers/ y opbs.okstate.ed u/~melcher/MG/MG01.html. M. Gonzalo Claros Daz es Investigador Contratado en el Dpto. de Biologa Molecular y Bioqumica (Universidad de Mlaga)