Laboratorul 3 Determinarea activitii invertazei Invertaza (-fructozidaza) este o enzim din clasa hidrolazelor, care catalizeaz hidroliza zaharozei

cu formare de glucoz i fructoz (zahr invertit), atacnd legtura glicozidic din partea moleculei de fructoz.
CH2OH CH2OH H H OH OH HOCH2 H O H H OH H CH2OH H OH H OH OH O O H + H2O H OH H H OH O H H OH

OH H -Glucopiranoz CH2OH H + O OH CH2OH -fructofuranoz H

Invertaza se gsete n special n drojdii. Are temperatura optim de activitate 52C iar pH-ul 4,5. Principiul metodei Metoda se bazeaz pe dozarea glucidelor reductoare care se formeaz ca urmare a aciunii invertazei asupra unei soluii de zaharoz cu concentraia cunoscut. Reactivi zaharoz, soluie 2% tamponat la pH 4,5 cu acid acetic; acetat de sodiu 0,2 M; reactivi pentru determinarea glucidelor reductoare prin metoda Schoorl; toluen.

Obinerea preparatului enzimatic Sursa clasic de obinere a preparatelor de invertaz este drojdia de bere i drojdia de panificaie. Deoarece invertaza este o enzim intracelular care nu difuzeaz prin membran, pentru extracia ei se procedeaz astfel: 10 g drojdie se mojareaz cu nisip timp de 10-15 minute pentru a distruge pereii celulari. Se adaug 30 ml ap distilat i 0,5 ml toluen n calitate de antiseptic. Amestecul se termostateaz timp de 2 ore la 35-37C n vederea autolizei celulelor care nu s-au distrus prin mojarare. Se mojareaz din nou, se aduce la 100 ml cu ap distilat i apoi se centrifugheaz ntreaga prob la 4000 ture/min, timp de 20 minute. Soluia obinut conine invertaz activ care se poate pstra 3-4 zile la frigider. Modul de lucru Se pipeteaz ntr-un balon Erlenmeyer 1 ml preparat enzimatic de invertaz. n alt balon se pipeteaz 1 ml preparat enzimatic supus n prealabil fierberii pentru inactivarea enzimei (proba martor). Se adaug n ambele baloane cte 10 ml soluie de zaharoz 2%, se omogenizeaz dup care acestea se termostateaz timp de 30 minute la temperatur de 37C, pentru desfurarea reaciei enzimatice. Dup trecerea acestui timp, se adaug n ambele baloane cte 9 ml ap (pentru ca volumul final s fie de 20 ml), se omogenizeaz bine i se determin glucidele reductoare prin metoda Schoorl folosind n acest scop cte 5 ml din fiecare prob.

n proba cu invertaz inactivat se determin glucidele reductoare preexistente n sistem (proba martor). n proba cu invertaz activ se dozeaz glucidele reductoare preexistente i glucidele reductoare formate n urma aciunii enzimei. Modul de calcul Se face diferena ntre volumul de tiosulfat de sodiu 0,1 N folosit la titrarea probei cu enzim inactivat (proba martor) i volumul folosit la titrarea probei cu enzim activ. n funcie de aceast diferen se ia din tabelul Schoorl cantitatea de zahr invertit (z I, n mg) care corespunde zaharozei hidrolizate din 5 ml prob luat n analiz. Activitatea invertazei se exprim n: 1) Cantitatea de zahr invertit care rezult prin hidroliza a 100 g zaharoz de ctre 1 ml sau 1 g preparat enzimatic, n condiiile de lucru date: 100 zi d ,n care: A= 2c t c- cantitatea de preparat enzimatic, n ml sau g; zI cantitatea de zahr invertit produs de enzim, n g; d diluia; t timpul de termostatare, n minute. 2) Micromoli de zaharoz hidrolizat ntr-un minut de 1 ml preparat enzimatic, sau 1 g drojdie sau alt surs, n condiiile de lucru date: 0,95 zi d ,n care: A= 342 10 6 c t c- cantitatea de preparat enzimatic, n ml sau g; zI cantitatea de zahr invertit produs de enzim, n g; d diluia; t timpul de termostatare, n minute; 0,95 factor de transformare a zahrului invertit n zaharoz; 34210-6 1 micromol zaharoz.

Laboratoru 4 Determinarea activitii enzimelor pectolitice Enzimele pectolitice acioneaz asupra substanelor pectice i pot fi clasificate n dou grupe: - enzime saponifiante-pectin-esteraza (PE)sau pectin-metil-esteraza (PME); - enzime depolimerizante sau pectin- glicozidaze (PG) (poligalacturonaze). Pectin esterazele (PE) sau pectin-metil-esteraza (PME) hidrolizeaz esterul metilic al acidului galacturonic prezent n structura substanelor pectice cu formare de acid poligalacturonic i alcool metilic. Pectin- glicozidazele sau poligalacturonaze (PG) care hidrolizeaz legturile -(1-4) glicozidice n prezena apei producnd fragmentarea macromoleculelor substratului i scderea vscozitii acestuia se denumesc endo-pectin-glicozidaze sau endo-poligalacturonaze. Cele care elibereaz acid galacturonic molecul cu molecul de la captul lanurilor pectinice poart denumirea de exo-pectin-glicozidaze sau exo-poligalacturonaze. Endo-poli-galacturonaza care uneori se mai numete i pectinaz, catalizeaz hidroliza legturilor glicozidice (1-4) existente n substanele pectice ntre resturile de acid galacturonic care nu au gruprile carboxilice metoxilate. Enzimele menionate mai sus acioneaz asupra acidului poligalacturonic metoxilat liber (pectin sau acid pectinic) sau nu (acid poligalacturonic sau acid pectic) n punctele figurate n structura urmtoare: PE- pectin-esteraza sau pectin- metil-esteraza; Endo-PG: endo-poligalacturonaza sau endo-pectin glicozidaza; Exo-PG :exo-poligalacturonaza sau exo-pectin-glicozidaza. Preparatele enzimatice pectolitice se obin, n majoritatea cazurilor, din mucegaiuri i sunt comercializate sub denumirea de: aspergol, pectinol, filtragol, etc. n industria alimentar se utilizeaz n vinificaie, n industria sucurilor de fructe, etc. Astfel, n vinificaie enzimele pectolitice se folosesc pentru creterea randamentului de extracie i pentru clarificarea mustului sau vinului. Ele mai sunt denumite i enzime de filtrare datorit aptitudinii lor de a ameliora viteza de filtrare a musturilor i vinurilor. n acelai scop se utilizeaz i n industria sucurilor de fructe. - Determinarea activitii endo-poligalacturonazei Principiul metodei Activitatea endo-poligalacturonazelor se determin cel mai frecvent prin urmrirea scderii vscozitii unei soluii de pectin sau acid poligalacturonic.
PE

COOH O H HO H OH H H OH exo-PG O H

CO O CH3 O H O OH H H OH

COOH O H H OH H H OH O H

COOH O H OH H H OH O H

CO O CH3 O H O OH H H OH

COOH O H H OH H H OH O

endo-PG

Reactivi -Hidroxid de sodiu 5%; -Soluie tampon cu pH=4: acid citric 0,1 M amestec cu Na2HPO4 0,2 M; -Pectin 1%: 1g pectin se umezete cu 2 ml etanol ntr-un mojar; se adaug apoi treptat sub mojarare continu 30-35 ml ap distilat i pictur cu pictur hidroxid de sodiu 5% pn la pH=4. Se trece cantitativ coninutul mojarului ntr-un balon cotat de 100 ml, folosind 50 ml soluie tampon cu pH=4. Se aduce la semn cu ap distilat i se omogenizeaz. -Acid poligalacturonic 1% se prepar ca i pectina 1%.

Modul de lucru ntr-un vscozimetru Oswald plasat ntr-o baie termostat la temperatur de 30C, se introduc 9 ml substrat (pectin sau acid poligalacturonic) i se menine timp de 10 15 minute (pentru ca substratul s ajung la temperatur de 30C). Se adaug 1 ml extract enzimatic (diluat corespunztor pentru o scdere a vscozitii cu aproximativ 50% n timp de 10-15 minute), se amestec prin barbotare de aer, se aduce la nivelul superior al poriunii marcate i se cronometreaz imediat timpul de scurgere ntre cele dou repere ale vscozimetrului. Operaia se repet la intervale scurte de timp pn cnd timpul de scurgere al amestecului ntre cele dou repere este egal cu 50 % (T50) fa de timpul de scurgere al probei martor. Proba martor se efectueaz n aceleai condiii folosind 1 ml de preparat enzimatic inactivat prin fierbere. Timpul de scurgere al probei martor se consider 100% (T100). Modul de calcul n condiiile artate, numrul invers al timpului (1/T)de scdere a vscozitii cu 50% (notat T50) este direct proporional cu activitatea enzimei care se exprim n uniti. O unitate de endo-poligalacturonaz este cantitatea de enzim care n condiiile menionate (9 ml substrat 1% i 1 ml preparat enzimatic, la pH= 4 i temperatur 30C) determin reducerea vscozitii pectinei sau acidului poligalacturonic, cu 50% n timp de 10 minute (T50=10, respectiv 1/T=0,1). Pentru exprimarea direct n uniti de endo-poligalacturonaz=1/T50, activitatea se calculeaz n uniti pentru 1 ml extract enzimatic nediluat sau 1 gram preparat enzimatic uscat. Determinarea activitii exo-poligalacturonazei Principiul metodei Determinarea activitii exo-poligalacturonazei se realizeaz prin urmrirea creterii puterii reductoare a sistemului de reacie care conine pectin sau acid poligalacturonic (substrat) i enzime pectolitice. n urma aciunii acestor enzime asupra substratului se elibereaz molecule de acid galacturonic, produs de reacia care mrete puterea reductoare a amestecului enzim-substrat. Acidul galacturonic eliberat se dozeaz iodometric n mediu slab alcalin de carbonat de sodiu.
CHO HC OH HO CH + I2 + 2 Na2CO3 HO CH HC OH COOH Acid galacturonic COONa HC OH HO CH + 2 NaI + 2 CO2 + H2O HO CH HC OH COONa Sarea de sodiu a acidului galactozaharic

Excesul de iod se titreaz cu o soluie de tiosulfat de sodiu n mediu acid.

I2 + Na2S 2O3 2 NaI + Na2S 4O6

Reactivi: -pectin sau acid poligalacturonic 1%, soluii preparate ca la metoda precedent; -carbonat de sodiu 1M; -acid sulfuric 2M; -tiosulfat de sodiu 0,1N; -amidon 1%.

Modul de lucru ntr-un flacon iodometric se pipeteaz 10 ml substrat pectin sau acid poligalacturonic 1% pn la pH 4) i 9 ml ap distilat. Amestecul se menine la termostat la 30C timp de 10 minute, apoi se adaug 1 ml extract enzimatic i se omogenizeaz bine. Imediat se iau 5 ml din amestec i se introduc n alt flacon iodometric care conine 1ml carbonat de sodiu 1 ml ( proba martor, respectiv timpul zero de aciune al enzimei). Cei 15 ml de amestec enzim substrat se pun n termostat la 30C. Dup 15, 30 i 45 minut se iau din aceast prob cte 5 ml care se introduc n flacoane iodometrice ce conin cte 1 ml carbonat de sodiu 1 M. Proba martor i cele trei probe prelevate dup 15, 30 i 45 minute sunt tratate astfel: se adaug cte 5 ml soluie de iod 0,1N i se in 20 minute la temperatura camerei pentru reacie. Dup expirarea timpului, se adaug 2,5 ml acid sulfuric 2M, iar excesul de iod se titreaz cu tiosulfat de sodiu, 0,1N n prezen de amidon ca indicator. Modul de calcul Se face diferena dintre volumul de tiosulfat de sodiu folosit pentru titrarea probei martor i volumul de tiosulfat de sodiu folosit pentru titrarea probelor n care a acionat enzima timp de 15, 30 i respectiv 45 minute. Aceste valori corespund moleculelor de acid galacturonic eliberate de enzim n timpul respectiv. Pentru a urmri activitatea enzimei n timp, se realizeaz o curb n care se trece pe abscis timpul de aciune al enzimei, iar pe ordonat diferena de volume.

Laboratorul 5 DETERMINAREA ACTIVITII ENZIMELOR PROTEOLITICE Generaliti Enzimele proteolitice peptidhidrolaze, peptidaze) fac parte din clasa hidrolazelor i catalizeaz scindarea hidrolitic a legturilor peptidice din proteide, polipeptide i peptide. n funcie de regiunea din molecula compuilor amintii la nivelul crei acioneaz, se subdivid n endo i exopeptidaze. Unele din ele acioneaz n tractul gastrointestinal fiind denumite enzime digestive (pepsina, tripsina, chimotripsina, carboxipeptidaza, aminopeptidaza etc.). Endopeptidazele (proteinaze, proteaze) catalizeaz scindarea hidorlitic a legturilor peptidice din interiorul catenelor polipeptidice a proteinelor cu mas molecular mare, producnd catene polipeptidice cu mas molecular mai mic. Reprezentani mai importani ai acestor enzime sunt: de origine vegetal papaina, ficina, bromelina; de origine animal pepsina, renina, tripsina, chimotripsina, catepsinele i de origine microbian - produse de diferite specii de Bacillus, Aspergillus, Penicillium etc. Exopeptidazele catalizeaz scindarea hidrolitic legturilor peptidice de la extremitile catenelor oligo sau polipeptidice conducnd n general la eliberarea de aminoacizi. Acioneaz asupra produilor de hidroliz ai endopeptidazelor sa chiar asupra unor proteine nc nehidrolizate. Sunt metalproteine (conin Zn2+, Mg2+ sau Mn2+) secretate de mucoasa intestinal sau sunt prezent n diferite esuturi. Reprezentani ai acestor enzime sunt: aminopeptidazele i carboxipeptidazele. Aminopeptidazele catalizeaz desfacerea hidrolitic a aminoacizilor de la capetele Nterminale ale lanurilor peptidice. Sunt exopeptidaze produse de mucoasa intestinal a mamiferelor i particip la digestia proteinelor. Sunt produse de asemenea de o serie de microorganisme i alturi de carboxipeptidaze sunt folosite pentru reducerea gustului amar al hidrolizatelor proteice ( ex. n cazul hidrolizatelor de cazein). Cea mai bine studiat este leucin-aminopeptidaza (EC 3.4.1.1.) care prezint o larg specificitate de substrat. Carboxipeptidaza scindeaz hidrolitic legturile peptidice de la extremitatea lanurilor polipeptidice care posed un aminoacid terminal cu gruparea carboxilic liber, elibernd acest aminoacid (C-terminal). n urma aciunii acestor enzime rezult oligopeptide i aminoacizi Sunt secretate de pancreas sub form inactiv de procarboxipeptidaze, care prin intervenia tripsinei (n intestin) se transform n carboxipeptidaze active. Sunt metal enzime care conin Zn2+. Principiul metodei Metoda se bazeaz pe determinarea produilor de hidroliz rezultai n urma aciunii preparatului enzimatic asupra unui substrat (cazein, hemoglobin sau alt protein). Produii de hidroliz pot fi dozai prin metoda titrimetric (metoda Srensen) sau colorimetric ( cu reactiv Folin-Ciocolteu, ninhidrin). Metoda titrimetric Aminoacizii eliberai n urma aciunii enzimelor proteolitice asupra substratului se dozeaz prin metoda Srensen). Reactivi: soluie de cazein 2%. Se cntresc la balana tehnic 20 g cazein i se solubilizeaz n 200 ml carbonat de sodiu 0,5% prin nclzire la 70C. Se ajusteaz apoi soluia la pH 7 cu o soluie de acid clorhidric 0,1N. Dup rcirea complet, soluia se trece cantitativ ntr-un balon cotat de 1000 ml, se aduce la semn cu ap distilat i se omogenizeaz bine. soluie de carbonat de sodiu 0,5%;

soluie de acid clorhidric 0,1N; soluie neutralizat de formol 40%; soluie de hidroxid de sodiu 0,01N; soluie alcoolic de fenolftalein 1%; extract enzimatic.

Modul de lucru Se iau ntr-un balon Erlenmeyer 10 ml soluie de cazein 25%, 10 ml ap distilat i 5 ml extract enzimatic. Dup omogenizare se preleveaz imediat 10 ml din amestecul de reactiv (proba martor) se adaug 5 ml formol neutralizat, 3 picturi fenolftalein i se titreaz cu hidroxid de sodiu 0,01N pn la coloraia slab roz. Amestecul rmas se termostateaz la temperatura de 37-40C timp de o or. Dup termostatare se iau 10 ml amestec, se adaug 5 ml formol neutralizat, 3 picturi fenolftalein i se titreaz cu o soluie de hidroxid de sodiu 0,01N pn la coloraia slab-roz. Modul de calcul Fcnd diferena dintre volumul de hidroxid de sodiu folosit pentru titrarea probei termostatate ( Ve) i volumul de hidroxid de sodiu folosit la titrarea probei netermostatate (Vm) obinem volumul de hidroxid de sodiu care corespunde aminoacizilor eliberai de enzim. Activitatea enzimelor proteolitice se exprim convenional prin: 1) cantitatea de glicocol eliberat de enzim n timp de o or din 100 g cazein, de ctre 1 ml extract enzimatic sau 1 g preparat enzimatic n condiiile de lucru date. (V Vm ) t 100 d A= e 2 C 2) micromoli glicocol eliberai de 1 ml extract enzimatic sau 1g preparat enzimatic n timp de 1 minut n condiiile de lucru date (Ve Vm ) t A= d , n care: C 75 10 -6 60 t - titrul soluiei de NaOH 0,1N n raport cu glicocolul, gl; d diluia efectuat; C cantitatea de preparat enzimatic luat n analiz, n ml sau g; 75 10-6 1 micromol glicocol; 60 timpul de termostatare n minute; 2 concentraia procentual a substratului.

Determinarea activitii lipazei Lipaza face parte din clasa hidrolazelor, grupa esterazelor; ele catalizeaz descompunerea legturilor esterice dintre glicerin i acizii grai din lipide, dup schema: CH2 OH C 2 OOC R1 H R COOH
CH OOC R2 CH2 OOC R3 + 3 H2O CH OH CH2 OH
1

+ R2 COOH
R3 COOH

Lipazele sunt foarte rspndite n natur. n organismul animal ele se gsesc n: sucul pancreatic, snge, stomac, plmni, rinichi i n toate esuturile grase. n regnul vegetal ele se localizeaz mai ale n semine. Cantiti mari de lipaze conin seminele plantelor oleaginoase ( ricin, soia, floarea-soarelui etc.). Lipazele au fost identificate i la microorganisme ( Aspergillus niger). Lipazele de diferite proveniene acioneaz la pH-uri optime diferite, pH-ul optim al lipazei pancreatice este de 7,5-7,8 al celei stomacale 1,8-2,5, iar la lipazei vegetale este de 4,7-5,0. Principiul metodei Activitatea lipazei se determin prin msurarea creterii aciditii unor lipide ca urmare a aciunii unui preparat enzimatic obinut din semine oleaginoase. Substratul ideal pentru studiul activitii lipazei dintr-un material oarecare sunt lipidele provenite din acelai material. Totui, n calitate de substrat al activitii lipazei se pot folosi i alte lipide de diferite proveniene. Reactivi necesari: tampon acetat, pH = 4,7; ulei rafinat; hidroxid de sodiu sau potasiu, soluie 0,01N; fenolftalein, soluie alcoolic 1%; alcool etilic 96%; eter de petrol. Obinerea preparatului enzimatic ntr-un vas de sticl prevzut cu dop, se amestec o parte semine de ricin sau soia fin mrunite, cu dou pri eter. Se las pentru extracia uleiului timp de 2-3 ore agitnd periodic. Se separ eterul i se introduc din nou 5 pri eter peste produsul parial degresat. Se mai extrage proba nc o or, dup care se separ eterul i se usuc produsul degresat, ntr-o etuv cu ventilator la temperatura de 30C. Seminele degresate conin lipaz activ. Modul de lucru ntr-un mojar se introduc 0,2 g semine de ricin sau soia degresate care se amestec cu 3 ml ulei rafinat . Se adaug 2 ml soluie tampon pH= 4,7 i se introduce mojarul ntr-un termostat, la 30C, timp de 30 minute. Dup aceasta se trece cantitativ coninutul mojarului ntr-un Erlenmeyer, splnd mojarul cu 15 ml alcool 96% (vol) i 15 ml eter de petrol. Se titreaz apoi acizii grai din prob cu KOH sau NaOH 0,01N n prezena fenolftaleinei ca indicator. n paralel se face i o prob martor care difer de proba de analizat prin faptul c nu se mai ine la termostat i se titreaz imediat cu KOH sau NaOH 0,01N.

Modul de calcul Activitatea lipazei se exprim prin numrul de micromoli de acizi grai reprezentai de acid oleic, ce se formeaz n urma aciunii unui gram de preparat enzimatic ntr-un minut. (V V ) 0,00282 m , n care: 282 10 6 G t V volumul de hidroxid de sodiu 0,01N folosit la titrarea probei n care a acionat enzima (corespunztor acizilor grai eliberai de enzim i celor existeni n substrat), n ml; Vm volumul de hidroxid de sodiu 0,01N folosit la titrarea probei martor (corespunztor acizilor grai eliberai de enzim i a celor existeni n substrat), n ml; 0,00282 titrul hidroxidului de sodiu n raport cu acidul oleic; 282 10-6 1 micromol de acid oleic G - cantitatea de preparat enzimatic luat n analiz, n g sau ml; tmin timpul de termostatare n minute. A=

Laboratorul 6
ENZIME IMOBILIZATE

Enzimele imobilizate prezint un interes tiinific i tehnologic nu numai n domeniul cercetrii legate de industria alimentar, dar i n alte industrii biochimice, tiine farmaceutice i tiine medicale. Enzimele imobilizate au implicaii deosebite n procesele tehnologice i n domeniul analizelor. n analiza alimentelor, enzimele imobilizate pot aduce avantajele sensibilitii i specificitii analizei enzimatice. Enzimele imobilizate sunt importante n tiina alimentelor i fiziologia post-mortem i post-recoltare ca analoage ale enzimelor legate de particula celular. Folosirea preparatelor enzimatice imobilizate n industrie prezint urmtoarele avantaje: - utilizarea repetat a enzimelor ceea ce permite s se prelucreze o cantitate mai mare de substrat cu aceeai cantitate de enzim; - enzima nu rmne n produs; - posibilitatea utilizrii unor instalaii cu funcionare continu care permite automatizarea proceselor; - reacia se poate opri la momentul dorit printr-o simpl operaie mecanic, etc. Preparatele enzimatice imobilizate sunt constituite din enzime ataate chimic sau fizic unui suport (matrice) insolubil n ap, cu pstrarea proprietilor catalitice. Pentru imobilizarea enzimelor se folosesc metode fizice sau chimice. Metodele fizice se bazeaz pe imobilizarea enzimelor prin interaciuni fizice (electrostatice, legturi ionice, legturi de hidrogen). Prin legturi fizice se obin preparate imobilizate sub form de: - enzime adsorbite pe un suport insolubil n ap ( celuloz, crbune, schimbtori de ioni); - enzime nchise n structuri macromoleculare, formate prin polimerizarea unor materiale n prezena moleculei de enzim. Se formeaz o matrice de polimer n care sunt incluse molecule de enzim active; - celule de ultrafiltrare care conin enzima imobilizat, etc. Procedeele chimice constau n formarea de legturi covalente sau semicovalente ntre gruprile funcionale care nu sunt ns eseniale pentru manifestarea activitii catalitice i un suport activ chimic insolubil n ap. Imobilizarea amilazelor pe parafin Principiul metodei Preparatul enzimatic se imobilizeaz cu parafin i apoi se urmrete activitatea amilazei prin reacia de culoare cu iod. Reactivi necesari - soluie de iod 0,1N. Modul de lucru ntr-un pahar Berzelius de 100 ml se cntresc 4 g parafin i 1 g fin de mal. Paharul se introduce ntr-o baie cu ap la temperatura de 50-55C i se amestec cele dou componente prin agitare. Amestecul fluid se distribuie sub forma unui film pe o poriune din suprafaa paharului ( h= 2-3 cm). Dup rcirea i solidificarea peliculei, paharul se spal de 3-4 ori cu ap distilat rece. n paharul astfel pregtit se introduce msurnd cu pipeta un volum de soluie de amidon 0,5% astfel nct s ajung la nivelul filmului de pe suprafaa paharului. Se introduce paharul n termostat la 37C i din 15 n 15 minute se face proba de culoare cu iod combinnd o pictur de soluie de iod cu o pictur de substrat. Se noteaz durata pn cnd iodul nu mai produce o schimbare a culorii la combinarea cu o pictur de prob. Operaia se repet de 3-4 ori.

Modul de calcul Activitatea enzimatic se exprim prin cantitatea de amidon transformat de 1g fin de mal ntr-un minut. V 0,5 , n care: 100 t V volumul soluiei de amidon 0,5% introdus n pahar; t durata reaciei enzimatice, minute. Se determin activitatea enzimatic la fiecare trecere i datele se ntabeleaz: Trecerea Activitatea enzimatic I II II IV AE =