GAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS)

PRINCPIO gar SS possue componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sdio) que inibem microrganismos Gram positivos. A incorporao de lactose ao meio permite diferenciar se o microrganismo lactose positiva (bactrias que fermentam a lactose produzem cido que na presena do indicador vermelho neutro resultando na formao de colnias de cor rosa), e bactrias que no fermentam a lactose formam colnias transparentes. Tissulfato de sdio e o citrato frrico permitem a deteco de HS evidenciado por formao de colnias de cor negra no centro. UTILIDADE Selecionar e isolar espcies de Salmonella e Shigella, em amostras de fezes, alimentos e gua. FRMULA / PRODUTO Meio comercial: gar SS. PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer o meio at fundir o gar; No autoclavar; Resfriar at 50C e distribuir 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estreis; Deixar em temperatura ambiente at resfriar; Embalar as placas com plstico PVC transparente e guardar em geladeira de 4 a 8C. CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Salmonella typhimurium ATCC 14028. Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923. INOCULAO Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas; Se negativo aps 24 horas, reincubar por mais 24 horas.

INTERPRETAO Cor original do meio: vermelho alaranjado. Colnias com centro negro (HS) ou colnias incolores: suspeita de Salmonella. Colnias incolores: suspeita de Shigella spp. Colnias cor de rosa ou vermelho: suspeita de Escherichia coli ou Klebsiella spp. As bactrias no fermentadoras de lactose so incolores. As bactrias fermentadoras de lactose aparecem na cor rosa. CONSERVAO E VALIDADE Conservar embalado de 4 a 8C por 3 meses. RECOMENDAES Ausncia de crescimento ou crescimento escasso, reincubar a placa mais 24 horas. No autoclavar, pois a alta temperatura degrada o acar contido no meio.

GAR MAC CONKEY

PRINCPIO O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente enterococos e estafilococos. A concentrao de sais de bile relativamente baixa em comparao com outros meios, por isso no to seletivo para Gram negativos como, por exemplo, o gar SS. UTILIDADE Isolar bacilos Gram negativos (enterobactrias e no fermentadores) e verificar a fermentao ou no da lactose. FRMULA /PRODUTO Meio comercial: gar MacConkey. PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Aquecer sob agitao at fundir o gar completamente;

Esterilizar em autoclave; Resfriar at 50C e distribuir 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estreis; Deixar em temperatura ambiente at resfriar; Embalar as placas com plstico PVC transparente e guardar em geladeira de 4 a 8C. CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Proteus mirabilis ATCC 12453 (no fermentador de lactose). Positivo: Escherichia coli ATCC 25922 (fermentador de lactose). Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923. INOCULAO Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas; Se negativo aps 24 horas, reincubar por mais 24 horas. INTERPRETAO Cor original do meio: rosa avermelhado. Crescimento de bacilos Gram negativos. Colnias cor de rosa: fermentadoras de lactose. Colnias incolores: no fermentadoras de lactose. No h crescimento de cocos Gram positivos. CONSERVAO E VALIDADE Conservar as placas embaladas de 4 a 8C por at 3 meses.

GAR SANGUE

PRINCPIO O meio de gar sangue, usando uma base rica como abaixo descrita, oferece timas condies de crescimento a maioria dos microrganismos. A conservao dos eritrcitos ntegros favorecem a formao de halos de hemlise ntidos, teis para a diferenciao de Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. UTILIDADE

Usado para o isolamento de microrganismos no fastidiosos. Verificao de hemlise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. Usado na prova de satelitismo (para identificao presuntiva de Haemophilus spp.). FRMULA / PRODUTO Meio comercial: Blood gar Base, Columbia gar Base, BHI gar, Mueller Hinton gar; Sangue desfibrinado de carneiro ou coelho: 5 ml para cada 100 ml de meio base. pH: 6,8 +/- 0,2 PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Esterilizar em autoclave; Esfriar a base +/- 50C; Adicionar 5 ml de sangue desfibrinado de carneiro para cada 100 ml de base; Homogeneizar delicadamente para no formar bolhas; Distribuir em placas de Petri de 90 mm de dimetro. CONTROLE DE QUALIDADE Hemlise beta hemoltica: Streptococcus pyogenes ATCC 19615 ou Staphylococcus aureus ATCC 25923. Hemlise alfa hemoltica: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae ATCC 6305. Hemlise gama (sem hemlise): Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou Staphylococcus epidermidis ATCC 12228. CONSERVAO E VALIDADE Conservar de 4 a 10C por 4 meses. INOCULAO Estriar a superfcie do meio, usando a tcnica de semeadura para isolamento; No final da semeadura, picar o meio com a ala para verificar hemlise em profundidade; Incubar 35C 24 horas. INTERPRETAO Cor original do meio: vermelho. Beta hemlise: presena de halo transparente ao redor das colnias semeadas (lise total dos eritrcitos). Alfa hemlise: presena de halo esverdeado ao redor das colnias semeadas (lise parcial dos eritrcitos). Gama hemlise (sem hemlise): ausncia de halo ao redor das colnias (eritrcitos permanecem ntegros). RECOMENDAES No usar sangue de carneiro vencido, pois o meio fica hemolisado ou com cor muito escura, dificultando o estudo de hemlise; No usar sangue humano, pois alguns microrganismos no apresentam hemlise;

No adicionar o sangue na base do meio quente, pois as hemcias rompem-se, dificultando o estude de hemlise; Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biolgicos em geral costuma ser abundante, sempre que necessrio, isolar a colnia em estudo para os procedimentos de identificao, para no correr o risco de trabalhar com cepas misturadas.

GAR SABOURAUD

PRINCPIO Meio com nutrientes que favorece o crescimento de diversos fungos leve duriformes e filamentosos. UTILIDADE Cultivo e crescimento de espcies de Candidas e fungos filamentosos, particularmente associados a infeces superficiais. Caracterizao macroscpica do fungo filamentoso (colnia gigante). FRMULA / PRODUTO Meio comercial: Sabouraud Dextrose gar. PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante; Esterilizar em autoclave; Resfriar +/- 50C e distribuir em placas de 90 mm de dimetro ou 4 ml por tubo; Se distribuir em tubos, deixar solidificar com inclinao em forma de bico de flauta (ngulo de 45). pH: 5,6 +/- 0,1 CONTROLE DE QUALIDADE Crescimento bom a excelente: Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404. CONSERVAO E VALIDADE Conservar embalado de 4 a 8C por at 6 meses. INOCULAO Inocular sempre dois tubos ou placas; Se em placa: semear com a tcnica de semeadura quantitativa;

Se em tubo: semear na superfcie inclinada do meio; Incubar um dos meios semeados em temperatura ambiente e o outro Observar diariamente a presena ou no de crescimento; Incubar 40 dias.

37C;

INTERPRETAO Cor original do meio: amarelo claro opalescente. Aps o crescimento, deve-se seguir a identificao do microrganismo que cresceu. RECOMENDAES Recomenda-se o uso de meios em tubos, pois a incubao demorada resseca com facilidade o meio contido em placas. No usar meios vencidos e/ou ressecados. Para suspeitas de Histoplamasma capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis, semear em BHI gar.

GAR NUTRIENTE

PRINCPIO

O Nutriente gar um meio relativamente simples, de fcil preparao e barato, muito usado nos procedimentos do laboratrio de Microbiologia. UTILIDADE

nutriente gar tem vrias aplicaes no laboratrio de Microbiologia, e pode ser utilizado para anlise de gua, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas exames bacteriolgicos e isolamento de organismos para culturas puras. uso mais freqente para a conservao e manuteno de culturas em temperatura ambiente neste gar, como mtodo opcional para os laboratrios que

no dispem do mtodo da crioconservao (congelamento das cepas em freezer - 70C). Usado para observar esporulao de espcies de bacilos Gram positivos. FRMULA

PRODUTO

Produto: Nutriente gar Frmula: Extrato de carne 3 g Peptona 5 g gar gar 15 g gua destilada 1000 ml pH: 6,8 +/- 0,2

PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar os componentes;

Fundir; Distribuir 3 ml por tubo; Esterilizar em autoclave;

Aps retirar da autoclave, inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de "bico de flauta" (ngulo de 45). CONTROLE DE QUALIDADE

Crescimento bom a excelente: Escherichia coli ATCC 25922 Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 CONSERVAO E VALIDADE

Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses. INOCULAO

Estriar a superfcie inclinada do meio;

Incubar. INTERPRETAO

Cor original do meio: branco opalescente Positivo: Crescimento na superfcie do gar;

Negativo: Ausncia de crescimento. RECOMENDAES

Usar tubos com tampa de rosca para evitar ressecamento do gar. Repicar as cepas conservadas a cada 3 meses. Conservar as cepas aps o crescimento no meio em temperatura ambiente. Por ser um meio nutritivo, a ausncia de crescimento no dever ocorrer.

GAR CLED

PRINCPIO Usado para isolamento e quantificao de microrganismos presentes em amostras urina. A deficincia de eletrlitos inibe o vu de cepas de Proteus. UTILIDADE Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras. FRMULA / PRODUTO 1. Meio comercial: gar Cled. PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante;

Esterilizar em autoclave;

Resfriar +/- 50C e distribuir de 20 a 25 ml em placas de Petri 90 mm estreis; Deixar em temperatura ambiente at resfriar. CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Lactose positiva: Escherichia coli ATCC 25922: crescimento moderado a denso, colnias mdias ou grandes amareladas, aps 48 horas de incubao. Lactose negativa: Proteus vulgaris ATCC 8427: crescimento moderado a denso, colnias azuis translcidas.

Negativo: ausncia de crescimento INOCULAO Verificar tcnica de semeadura quantitativa. INTERPRETAO Cor original do meio: azul claro.

Colnias lactose positiva: cor amarela.

Colnias lactose negativa: cor azul. Caractersticas de crescimento:

Escherichia coli: colnias opacas, amarelas com ligeira cor amarelo escuro no centro, com cerca de 1,25 mm de dimetro, as no fermentadoras de lactose colnias azuis

Espcies de Klebsiella: colnias muito mucosas, cor varivel de amarelo a branco azulado Espcies de Proteus: colnias azul translcidas, geralmente menor que Espcies de Salmonella: colnias planas, cor azul E.coli

Enterococcus faecalis: colnias amarelas, com cerca de 0,5 mm de dimetro Staphylococcus aureus: colnias amarelas, com cerca de 0,75 mm de dimetro Staphylococcus coagulase negativa: colnias amarelo palha e brancas Corynebacterium: colnias pequenas e cinza Lactobacilos: colnias pequenas e com superfcie rugosa

Pseudomonas aeruginosa: colnias verdes, com superfcie prateada e periferia rugosa CONSERVAO E VALIDADE Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses. RECOMENDAES Organismos que fermentam lactose baixam o pH e mudam a cor do meio de verde para amarelo, podendo assim verificar se o microrganismo lactose negativa ou positiva;

Espcies de Shigella no crescem em meios deficientes em eletrlitos.

CALDO BHI BRAIN HEART INFUSION

PRINCPIO um meio derivado de nutrientes de crebro e corao, peptona e dextrose.

A peptona e a infuso so fontes de nitrognio, carbono, enxofre e vitaminas. A dextose um carboidrato que os microrganismos utilizam para fermentao. UTILIDADE Meio para cultivo de estreptococcos, pneumococos, meningococos, enterobactrias, no fermentadores, leveduras e fungos.

Pode ser utilizado na preparao do inculo para teste de susceptibilidade aos antimicrobianos, para realizao de teste de coagulase em tubo, para teste de crescimento bacteriano a 42 e 44C e para teste de motilidade em lmina. FRMULA / PRODUTO Meio comercial: Caldo BHI (infuso de crebro e corao). PROCEDIMENTOS Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante;

Distribuir 3,0 ml em tubos com tampa de rosca; Esterilizar em autoclave;

Retirar os tubos da autoclave e deixar esfriar em temperatura ambiente. CONTROLE DE QUALIDADE Positivo: Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 e Candida albicans ATCC 10231.

Negativo: meio sem inocular. INOCULAO Com o auxlio de uma ala ou fio bacteriolgico, inocular a colnia ou o material a ser testado - realizar o teste com colnias puras de 18 a 24 horas;

Incubar a 35C 2 por 24 a 48 horas;

Para isolamento de fungos incubar por at 5 dias. INTERPRETAO Cor original do meio: amarelo claro, lmpido.

Positivo: presena de turvao = crescimento bacteriano.

Negativo: ausncia de turvao. CONSERVAO E VALIDADE Conservar de 4 a 10C por 6 meses. RECOMENDAES Para cultivo de anaerbios, acrescentar 0,1% de gar.

Para crescimento de Haemophilus e outros fastidiosos necessrio adio de suplementos a base de L-cistena, NAD (fator V) e hemina (fator X).

LWENSTEIN JENSEN

PRINCPIO A base do meio constituda por ovos integrais, o que permite amplo crescimento das micobactrias e o crescimento satisfatrio para o teste de niacina (que positivo para Mycobacterium tuberculosis). UTILIDADE Isolamento primrio das micobactrias. FRMULA / PRODUTO Meio comercial: Meio TB para Bacilos de Koch Seg. Lwenstein Jensen ou Lwenstein Medium Base

Ovos de galinha frescos Meio base - frmula: Fosfato monopotssico 1,2 g

Sulfato de magnsio 0,12 g Citrato de magnsio 0,3 g L-asparagina 1,8 g Fcula de batata 15,0 g Glicerol 6,0 ml Ovos totais 500 ml

Soluo de Verde de malaquita a 2% 10 ml Soluo de Verde de malaquita 2% - Frmula:

Verde de malaquita 2 g

gua destilada 100 ml PROCEDIMENTOS Preparao dos ovos: Escovar os ovos, um a um, com escova de cerdas macias;

Deixar os ovos submersos em gua e detergente comum, durante 30 minutos;

Enxaguar com gua corrente cuidadosamente um a um; Deixar os ovos submersos em lcool etlico a 70% durante 30 minutos; Retirar os ovos cuidadosamente e secar com pano estril;

Reservar os ovos. Soluo de Verde de malaquita a 2%: Pesar o verde de malaquita e adicionar a gua;

Homogeneizar bem at dissolver o corante; Esterilizar em vapor fluente durante 30 minutos;

Reservar a soluo. Meio comercial: Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante;

Adicionar o glicerol e aquecer o meio, agitando constantemente at ferver; Esterilizar em autoclave; Resfriar a base 45 - 50C;

Quebrar os ovos, um a um, cuidadosamente em copo de bquer estril e transferir, um a um, para uma proveta estril de 500 ml; Completar a proveta com ovos at completar 500 ml; Transferir os ovos para um copo de liqidificador estril - se no tiver liqidificador prprio para laboratrio, transferir os ovos para um balo de 1000 ml contendo prolas de vidro de tamanho mdio, ambos estreis;

Homogeneizar os ovos;

Passar os ovos para o balo que contm a base fria, filtrando em funil e gaze estril; Adicionar o verde de malaquita; Homogeneizar bem;

Deixar repousar durante 30 minutos para as bolhas da superfcie estourarem; Distribuir 10 a 12 ml por tubo de rosca estril; Colocar os tubos no coagulador inclinados com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45) durante 50 minutos a 85C - se no tiver coagulador, pode-se coagular os ovos em banho de areia 85C colocado em estufa de esterilizao, tambm por 50 minutos, tendo o cuidado de verificar a temperatura constantemente. Meio no comercial: Diluir a L-asparagina em pouca gua e dissolver aquecendo lentamente no bico de Bunsen;

Acrescentar os demais componentes, exceto os ovos e o verde de malaquita; Esterilizar em autoclave; Seguir os passos 4 ao 14 listados acima. CONTROLE DE QUALIDADE

Esterilizao: colocar todos os tubos em estufa;

Crescimento bom a excelente: Mycobacterium tuberculosis ATCC 25618 Mycobacterium avium ATCC 25291 CONSERVAO E VALIDADE Conservar entre 4 a 8C por 3 meses. INOCULAO Para materiais biolgicos de stios contaminados, fazer descontaminao prvia pelas tcnicas desejadas (Petroff, NALC, Lauril sulfato de sdio, Corper & Stoner modificado);

Semear 5 gotas ou mais, cobrindo bem a superfcie do meio;

Manter os tubos inclinados com a tampa semi aberta at secar bem o inculo; Depois de seco o inculo, rosquear os tubos e incubar 60 dias 35C; Semanalmente, abrir as tampas prximo ao bico de Bunsen para ventilar os cultivos e observar a presena ou no de crescimento. INTERPRETAO Cor original do meio: verde claro

Positivo: Crescimento de colnias amarelas

Negativo: ausncia de crescimento. RECOMENDAES Como um meio rico em protenas, bactrias proteolticas contaminam o meio, liqefazendo-o, para isto, deve-se fazer uma leitura com 24 horas de incubao para tirar as culturas que possam ter contaminado;

No usar ovos velhos;

No quebrar mais que um ovo por vez, pois pode ter algum estragado e contaminar os demais; Manter sempre mais que um bquer estril para o caso de haver algum ovo estragado; No liberar culturas negativas com tempo inferior a 60 dias de incubao, pois as micobactrias desenvolvem-se lentamente; Fazer um esfregao do crescimento e corar pela tcnica de Ziehl para confirmar ser um Bacilo lcool cido Resistente, pois alguns contaminantes podem crescer com pigmento amarelo.

BRILLIANT GREEN AGAR

UTILIZAO PRETENDIDA O agar verde Brilliant Green Agar um meio altamente selectivo, usado para o isolamento de outras salmonelas que no as S. Typhi, existentes nas fezes e noutros materiais. PRINCIPIO E EXPLICAO DO PROCEDIMENTO Mtodo microbiolgico O uso do agar verde brilhante para o isolamento das salmonelas foi descrito pela primeira vez por Kristensen et al. Mais tarde, Kauffmann modificou o meio. Verificou-se que o meio permitia a inoculao de inculos pesados em contextos clnicos e no clnicos. Este facto mencionado na Farmacopeia dos Estados Unidos da Amrica para o teste de limite microbiano, bem como na Farmacopeia Europeia, e utilizado na anlise de produtos lcteos e em manuais de microbiologia clnica.

No agar verde Brilliant Green Agar o extracto de levedura e duas peptonas fornecem os nutrientes; a lactose e a sacarose, juntamente com o vermelho de fenol, fornecem um sistema de diferenciao que exclui os fermentadores da lactose e/ou sacarose (ex: E. Coli), enquanto que as salmonelas no produzem cido a partir destes acares. O agar Brilliant Green o agente selectivo que inibe a flora de acompanhamento. REAGENTES Frmula* por Litro de gua Purificada Brilliant Green Agar Extracto de levedura 3,0 g

Bacto Proteose Peptone (peptona proteose) 10,0 Lactose 10,0 Sacarose 10,0 Cloreto de sdio 5,0

Vermelho de fenol 0,08 Agar 20,0 Brilliant Green 12,5 mg

pH 6,9 0,2 *Ajustada e/ou suplementada conforme necessrio para cumprir os critrios do desempenho. PRECAUES Apenas para uso profissional .

No utilizar as placas que apresentem sinais de contaminao microbiana, descolorao, secura, fissuras ou outros sinais de deteriorao. Consultar as INSTRUES GERAIS DE UTILIZAO para informao sobre os procedimentos de manuseamento assptico, os riscos biolgicos e os procedimentos de eliminao do produto usado. ARMAZENAMENTO E PRAZO DE VALIDADE Aps recepo das placas, conservar no escuro a uma temperatura entre 2 e 8C, dentro do invlucro original at ao momento da utilizao. Evitar congelar e aquecer excessivamente. As placas podem ser inoculadas at ao prazo de validade (ver a etiqueta da embalagem) e incubadas durante o tempo de incubao recomendado.

As placas so fornecidas em pilhas de 10 placas e, quando uma destas pilhas aberta, as respectivas placas tero de ser utilizadas no prazo mximo de uma semana, se forem conservadas em local limpo a uma temperatura entre 2 e 8C.

CONTROLO DE QUALIDADE PELO UTILIZADOR Inocular amostras representativas com as seguintes estirpes (para mais detalhes, consultar as INSTRUES GERAIS DE UTILIZAO). Incubar as placas em condies aerbias, a uma temperatura de 35 a 37C, durante 18 a 48 horas.

PROCEDIMENTO Materiais fornecidos BD Brilliant Green Agar (placas Stacker de 90 mm). Microbiologicamente controlados. Materiais no fornecidos Meios de cultura auxiliares, reagentes e equipamento de laboratrio conforme necessrio. Tipos de amostra Amostras de fezes de doentes com suspeita de estarem infectados com Salmonela (ver tambm CARACTERSTICAS DE DESEMPENHO E LIMITAES DO PROCEDIMENTO), ou materiais de animais ou alimentares. Procedimento do teste Espalhar a amostra directamente ou inocular o meio com uma pequena quantidade de crescimento de um meio de enriquecimento lquido, como o Tetrationato. Devem ser includos, tambm, um ou dois meios menos selectivos, especialmente quando a populao existente no material baixa. Espalhar para diluio e incubar as placas em condies de aerobiose, a uma temperatura de 35 a 37C, durante 42 a 48 horas. Ler as placas aps 18 a 24 horas e aps 42 a 48 horas. Resultados A aparncia tpica dos organismos existentes no agar verde BD Brilliant Green Agar a seguinte:

CARACTERSTICAS DE DESEMPENHO E LIMITAES DO PROCEDIMENTO O agar verde BD Brilliant Green Agar um meio altamente selectivo, usado para o isolamento de salmonelas e que permite o isolamento destes organismos mesmo em materiais fortemente contaminados, incluindo as fezes.

Devem ser inoculados com a amostra / material meios menos selectivos para o isolamento de Salmonelas e tambm uma placa de agar MacConkey.

Embora algumas estirpes cresam, o agar BD Brilliant Green Agar no apropriado para o isolamento de Salmonella Typhi e S. Paratyphi. Embora possam ser realizados alguns testes de diagnstico directamente neste meio, necessria a realizao de testes bioqumicos e serolgicos para uma completa identificao.