Cincia Rural, Santa Maria, v.31, n.5, p.

799-804, 2001

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ISSN 0103-8478

VARIABILIDADE ISOENZIMTICA EM PROGNIES DE BITIPOS APOMTICOS DE PASPALUM DILATATUM (POACEAE)

ISOENZYMATIC VARIABILITY IN SIB SEEDLINGS OF APOMICTIC BIOTYPES OF PASPALUM DILATATUM (POACEAE)

Luciane Gauer1 Maria Helena Albarus1 Suzana Cavalli-Molina2

RESUMO Paspalum dilatatum, espcie de alto valor forrageiro, apresenta uma ampla variedade de bitipos, tendo formas sexuais e apomticas. Os bitipos P. dilatatum anteras roxas e Torres so descritos como tendo reproduo assexual por apomixia, concluso esta baseada apenas em anlises citolgicas do saco embrionrio. O presente trabalho teve como objetivo confirmar o modo de reproduo destes dois bitipos, analisando a ocorrncia de variabilidade entre plntulas-irms e entre endospermas, atravs de eletroforese de isoenzimas. Os sistemas de IDH, ME, PGM, SOD e GOT no foram informativos por no apresentarem polimorfismo intra-especfico ou dentro de cada bitipo. Para o sistema das AMI, observou-se grande variao isoenzimtica entre os endospermas de sementes de uma mesma linhagem, com ausncia de variao entre as plntulas-irms, o que poderia sugerir a ocorrncia de pseudogamia. Entretanto, para os sistemas das MDH e PER foi observado a ocorrncia de variabilidade na prognie de plantas individuais, o que pode ser indicativo de segregao gnica e sugerir a ocorrncia de reproduo sexual. Palavras-chave: Paspalum dilatatum, apomixia, isoenzimas, testes de prognie. SUMMARY Paspalum dilatatum is a plant species of high forage value with a wide range of biotypes, with sexual and apomictic types. Purple-anthered and Torres biotypes are described as apomictic based only on cytological analysis of embrionary sac. The present research aimed at analyzing the occurrence of variability among sib seedlings and endosperms of these biotypes through gel electrophoresis. Enzymatic systems of GOT, IDH, ME, PGM, and SOD were not informative because they did not show intra-specific or intra-biotype polymorphism. AMY revealed large isoenzymatic variation among endosperms from the same strain but without variation among sib seedlings. This could suggest occurrence of pseudogamy. However, for
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MDH and PER, the occurrence of variability among sib seedlings was observed, which can be indicative of genic segregation and suggests the occurrence of sexual reproduction. Key words: Paspalum dilatatum, apomixis, isoenzymes, progeny tests.

INTRODUO O gnero Paspalum ocupa um lugar de destaque entre as gramneas brasileiras por reunir o maior nmero de espcies nativas e o maior nmero de espcies com alto valor forrageiro (VALLS, 1987), constituindo importante alimento para o gado. Tambm apresenta papel relevante na conservao do solo, principalmente em zonas litorneas. Suas sementes servem de alimento para um grande nmero de pssaros e utilizado no fabrico do papel (PRESTES et al., 1976). O gnero Paspalum apresenta um total de 20 grupos taxonmicos (BARRETO, 1974), dos quais o grupo Dilatata de grande interesse para a rea subtropical, onde convivem bitipos sexuais e apomticos de trs espcies: P. dilatatum, P. urvillei e P. pauciciliatum (VALLS & POZZOBON, 1987). A espcie P. dilatatum, objeto de estudo deste trabalho, apresenta grande importncia forrageira, principalmente em solos midos no sul do Brasil (MORAES-FERNANDES, 1971), apresentando uma ampla variedade de bitipos. Estes bitipos distinguem-se pelo nvel de ploidia, modo de reproduo, caractersticas morfolgicas e

Bilogo, Mestre em Gentica. Bilogo, Doutor em Cincias (Gentica), Professor Adjunto, Departamento de Gentica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, CP 15053, 91501-970, Porto Alegre, RS. E-mail: suzana.molina@ufrgs.br. Autor para correspondncia.
Recebido para publicao em 31.10.00. Aprovado em 07.03.01

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rea de distribuio. Entre os bitipos assexuais destaca-se P. dilatatum comum ou anteras roxas e P. dilatatum Torres. P. dilatatum comum possui anteras roxas, 50 cromossomos, sendo descrito na literatura como tendo reproduo assexual por apomixia obrigatria, do tipo aposporia, com ocorrncia de pseudogamia (BASHAW & FORBES Jr., 1958). Este bitipo representa uma forrageira amplamente adaptada s condies ecolgicas do sul da Amrica do Sul. Embora possua excelentes caractersticas forrageiras, apresenta alta suscetibilidade ao ataque do fungo Claviceps paspali, baixa viabilidade do poln e baixa qualidade de sementes (BASHAW & FORBES Jr., 1958). Esta ltima caracterstica a maior limitao para seu uso extensivo como forrageira cultivada. P. dilatatum Torres apresenta anteras amarelas com bordos roxos e possui 60 cromossomos. MORAESFERNANDES (1971) citou que seu modo de reproduo deve ser apomtico, sendo que, na anlise de vulos de um acesso deste bitipo, BURSON et al. (1991) encontraram somente sacos embrionrios apomticos apospricos com a ocorrncia de pseudogamia. A apomixia um mtodo geneticamente controlado de reproduo em plantas, em que o embrio desenvolve-se a partir de divises mitticas de clulas do vulo, ocorrendo a formao de sementes frteis, sem haver a unio do gameta feminino com o masculino como na reproduo sexual. Na apomixia do tipo aposprico, o embrio desenvolve-se a partir de alguma clula somtica do vulo, diferente da clula-me do megsporo, formando um saco embrionrio no-reduzido. Como o embrio aposprico se origina a partir de divises mitticas de uma clula somtica, ele possui exatamente o mesmo complemento cromossmico e constituio gentica da plantame. Devido a isto, a aposporia suprime a troca de genes, levando a heterozigose fixada. Em muitas formas de aposporia, ocorre a fecundao dos ncleos polares do saco embrionrio por um ncleo do gro de plen levando a formao do endosperma, sem ocorrer a fecundao da oosfera, fenmeno este denominado de pseudogamia (BASHAW, 1980). SAVIDAN (1987) indicou a necessidade de estudar melhor a natureza do modo de reproduo de cada espcie do gnero Paspalum, porque sua determinao foi baseada apenas em anlises citolgicas de sacos embrionrios. Embora observaes sobre a origem e o desenvolvimento da clula que origina o embrio sejam essenciais para identificar o mecanismo de reproduo, elas no indicam qual a freqncia de sementes sexuais e

assexuais formadas em apomticos facultativos. Esta informao s obtida pela observao da percentagem de plantas idnticas planta-me entre a descendncia. O interesse em se detectar algum nvel de sexualidade em plantas apomticas reside no fato de que a apomixia obrigatria no permite a realizao de programas convencionais de melhoramento gentico. E, no caso especfico dos bitipos estudados, isso seria particularmente interessante para a melhoria na produo da qualidade das sementes. No momento que so encontradas plantas sexuais com caractersticas agronmicas desejveis, elas podem servir como plantas femininas que recebero o plen de uma planta apomtica. Neste caso, ocorrer a segregao de indivduos sexuais e apomticos na F2 e, entre os apomticos, podero ser selecionadas as plantas com as caractersticas desejveis. A reproduo assexual se encarregar de manter tais caractersticas ao longo das geraes. A eletroforese de isoenzimas tem sido um importante instrumento na anlise do modo de reproduo de diversos organismos, por permitir analisar a ocorrncia de variabilidade gentica entre plntulas-irms. O propsito deste trabalho verificar a ocorrncia de variabilidade gentica entre indivduos irmos e/ou a ocorrncia de pseudogamia nos bitipos anteras roxas e Torres de P. dilatatum, atravs de eletroforese de isoenzimas. MATERIAL E MTODOS Foram analisadas plntulas-irms de 10 linhagens (plantas obtidas a partir de uma nica planta-me da natureza) de Paspalum dilatatum anteras roxas e 13 linhagens de P. dilatatum Torres (Tabela 1). As plntulas foram obtidas a partir da germinao de sementes de plantas coletadas em diferentes pontos dos estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina. As sementes foram desinfectadas com lquido de Dakin (soluo de hipoclorito de sdio com teor aproximado de 1% de cloro ativo), escarificadas com nitrato de potssio 0,2%, semeadas em placas de Petri e mantidas na presena permanente de luz e temperatura constante de 32C. Cada plntula foi congelada quando apresentava a primeira folha com aproximadamente 2,5cm de comprimento. Para os testes de prognie, foi analisada a ocorrncia de variabilidade entre plntulas irms (mdia de 16 plntulas por linhagem), atravs de seus padres isoenzimticos de oito sistemas: malato desidrogenase (MDH), superxido dismutase (SOD), enzima mlica (ME), isocitrato Cincia Rural, v. 31, n. 5, 2001.

Variabilidade isoenzimtica em prognies de bitipos apomticos de Paspalum dilatatum (Poaceae). Tabela 1 - Origem, nmero de plantas analisadas (N), indicao de variabilidade (S) ou no () dentro da prognie (Segr), para os sistemas enzimticos malato desidrogenase (MDH), amilase (AMI) e peroxidase (PER), das linhagens analisadas de P. dilatatum anteras roxas e Torres. Porto Alegre, RS, 2000. BITIPO LINHAGEM (1) V8067 A N T E R A S V8132 V8214 V11297 V11956 V12030 R O X A S V12031 V12049 MD274 MD403 ORIGEM MDH AMI(2) PER(2)

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Ubirici (SC) Bom Retiro (SC) Curitibanos (SC) Ponta Grossa (SC) Lages (SC) Lages (SC) Lages (SC) Lages (SC) Campo Belo (SC) Mafra (SC)

N Segr N Segr N Segr N Segr N Segr N Segr N Segr N Segr N Segr N Segr N Segr N Segr N Segr N Segr N Segr N Segr N Segr N Segr N Segr N Segr N Segr N Segr N Segr

9 S 12 S 17 S 9 S 10 S 17 S 9 23 9 S 17 S 24 S 12 S 31 S

50(e) S 7(e) S 8(f)2(e) 8(f)5(e) 8(f)8(e) 32(e) S 47(e) S 25(e) S 34(e) S 11(e) S 21(f)21(e) S 7(f)7(e) S 17(f)15(e) S

22(f) S 8(f)8(e) S 8(f)8(e) S S 8(f)4(e) S 8(f)8(e) S S 26(f) S 30(f) S 34(f)54(e) S S 18(f)6(e) 11(f)33(e) S 4(f)7(e) 7(f)6(e) S 8(f)7(e) S

V4019 V4020 V4032 V4441 V8120 T O R R E S V8262 V10113 V11103 V11146 V12000

Osrio (RS) Osrio (RS) Torres (RS) So Joaquim (SC) Alfredo Wagner (SC) Lages (SC) Laguna (SC) Balsa Nova (SC) Quatro Barros (SC) Alfredo Wagner (SC)

poliacrilamida, utilizando-se diferentes condies de migrao para cada sistema enzimtico. GOT: gel a 7% e tampes descritos por POULIK (1957); IDH: gel a 8% e tampes citados por COUSINEAU & DONNELLY (1992); ME: gel a 7% e tampes de SCANDALIOS (1969); PER: gel a 6% e 8% e tampes de SCANDALIOS (1969); MDH e SOD: gel a 7% e tampes de ROOSE & GOTTLIEB (1976); PGM: gel a 7% e tampes de SOLTIS et al. (1983); AMI: gel a 8% e tampes de SCANDALIOS (1969). As coloraes histoqumicas utilizadas foram feitas de acordo com os seguintes autores: GOT: VALLEJOS (1983), modificada; IDH: GASTONY & GOTTLIEB (1982); ME: SOLTIS et al. (1983); PER: GOTTLIEB (1973); MDH e SOD: BREWER (1970); PGM: SOLTIS et al. (1983); AMI: CHAO & SCANDALIOS (1972), modificada. O tecido analisado da plntula foi a primeira folha (para todos os sistemas enzimticos). Para AMI e PER, tambm foi analisado o endosperma. O padro eletrofortico da planta-me foi analisado em um pedao da ponta de uma folha jovem. A ocorrncia de variabilidade em cada prognie, tpica da reproduo sexual, foi inferida pela anlise de plntulas-irms e a ocorrncia de pseudogamia pela ocorrncia de variabilidade entre endospermas de sementes da mesma prognie. RESULTADOS E DISCUSSO

Os sistemas enzimticos IDH, ME, SOD, PGM e GOT no apresentaram polimorfismo, tendo todas V12005 Alfredo Wagner (SC) as plantas analisadas mostrado padres eletroforticos idnticos, o que tornou V12021 Alfredo Wagner (SC) estes sistemas no informativos quanto ocorrncia de eventos sexuais de (1) reproduo nos dois bitipos nmero do coletor= V: Jos F. Montenegro Valls CENARGEN-EMBRAPA, MD: Miguel DallAgnol EMPASC. considerados apomticos, pois mesmo (2) (f)=primeira folha; (e)=endosperma. que ocorresse algum evento de reproduo sexual nestas plantas, este no seria detectado por eletroforese. desidrogenase (IDH), fosfoglicoisomerase (PGM), Para o sistema MDH, verificaram-se glutamato oxalacetato transaminase (GOT), basicamente trs padres eletroforticos distintos. peroxidase (PER) e amilase (AMI). A anlise Cada padro caracterizado pela presena de duas eletrofortica foi realizada em gis de ou trs bandas eletroforticas, possivelmente uma
V12003 Alfredo Wagner (SC)

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isoenzima principal e outra(s) secundria(s), que apresentam diferentes mobilidades eletroforticas em diferentes indivduos. Foi observada a ocorrncia de dois ou trs padres distintos na prognie de uma mesma planta-me, o que pode ser indicativo de segregao gnica (Figura 1A e Tabela 1). Entretanto, no foi detectada a ocorrncia de nenhum padro que correspondesse a um gentipo heterozigoto, com duas ou trs bandas principais (ou mais por se tratar de poliplides). Isto pode indicar que a segregao no est ocorrendo no loco estrutural de MDH, que possuiria interao allica de co-dominncia, mas num loco modificador onde os alelos apresentariam interao de dominncia x recessividade, e o padro eletrofortico do gentipo dominante seria o mesmo que o do heterozigoto. A presena de um alelo especfico neste gene modificador causaria alteraes ps-sntese na molcula enzimtica, alterando assim sua mobilidade eletrofortica. As folhas da planta adulta no apresentaram atividade para MDH. A atividade amilsica na primeira folha foi baixa, com um total de trs bandas detectadas. O padro obtido foi constante, no havendo variao nem entre, nem dentro das prognies. Para o endosperma, observaram-se 19 bandas, a maioria delas com boa resoluo e forte atividade. Entretanto, devido a complexidade dos padres (sistema com grande nmero de bandas e organismos poliplides), no foi possvel determinar o controle gentico das isoenzimas de AMI. Independente da determinao do controle gentico, a presente anlise detectou grande variabilidade entre endospermas de sementes da

Figura 1 - Padres isoenzimticos de diferentes linhagens dos bitipos anteras roxas e Torres de P. dilatatum, mostrando a ocorrncia de variabilidade. A, padres de MDH de 4 indivduos irmos da linhagem V12005 (bitipo Torres), B, padres de AMI de 8 endospermas da linhagem V8067 (anteras roxas), C, padres de PER de 6 plntulas-irms da linhagem MD403 (anteras roxas). Porto Alegre, RS, 2000.

mesma linhagem (Figura 1B e Tabela 1). A ocorrncia de variabilidade nos endospermas associada ausncia de variabilidade nas plntulasirms da mesma linhagem, sugere a ocorrncia de pseudogamia, ou seja, apesar da oosfera no ser fecundada pelo ncleo do gro de plen, os ncleos polares do saco embrionrio so fecundados para formar o endosperma. Deste modo, no h variao entre plntulas, mas h variao entre os endospermas de sementes irms. Entretanto, a ausncia de variabilidade entre plntulas-irms associada presena de variao no endosperma no indica obrigatoriamente a no ocorrncia de nenhum evento sexual. Isto pode ser devido falta de polimorfismo nos poucos locos de AMI ativos na folha. Para o sistema PER foram detectadas 24 bandas eletroforticas, ocorrendo grande variao entre plntulas-irms, tanto para o bitipo anteras roxas como para o bitipo Torres (Figura 1C e Tabela 1). As diferenas entre plntulas-irms foram tanto em nvel quantitativo, ou seja, diferenas na intensidade de uma mesma banda entre diferentes indivduos, quanto em nvel qualitativo, caracterizada pela presena e ausncia de bandas, bem como pela substituio de uma banda por outra em indivduos distintos de uma mesma prognie, o que pode estar refletindo a ocorrncia de segregao gnica. Estes resultados sugerem a ocorrncia de eventos de reproduo sexual nos dois bitipos analisados de P. dilatatum. No endosperma, a atividade peroxidsica foi menor, com um total de 12 bandas. Variao entre endospermas da mesma linhagem tambm foi encontrada. Tambm em PER, a complexidade dos padres obtidos no permitiu determinar o controle gentico das bandas analisadas e, consequentemente, no foi possvel confirmar a origem desta variabilidade. O fato de ter sido encontrada variao isoenzimtica entre os endospermas de certas linhagens, para AMI, enquanto que para a primeira folha foi observado um padro constante, poderia sugerir a ocorrncia de apomixia com pseudogamia. Entretanto, a ocorrncia de variao isoenzimtica entre indivduos irmos, para os sistemas MDH e PER, enfraquece esta hiptese e fornece evidncias da ocorrncia de eventos sexuais de reproduo. Considerando que a variabilidade encontrada nos bitipos anteras roxas e Torres realmente devida reproduo sexual (evidncias mostradas na presente anlise), haveria uma elevada taxa de sexualidade para os mesmos. Em P. dilatatum anteras roxas, 100% das prognies analisadas para MDH e/ou PER apresentaram variao, e no bitipo Torres, 89%. Devido ao fato Cincia Rural, v. 31, n. 5, 2001.

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dos bitipos anteras roxas e Torres de P. dilatatum serem descritos como apomticos, sendo o primeiro considerado apomtico obrigatrio, no seria esperado encontrar variabilidade em suas prognies. Entretanto, no presente trabalho foi detectada variabilidade entre plntulas-irms, embora no tenha sido possvel definir sua origem. Poder-se-ia relacionar a ocorrncia de variabilidade isoenzimtica nestas plntulas com modificaes na expresso gnica devido a variaes ambientais. Entretanto, todo o experimento foi realizado em condies controladas em que todas as sementes foram armazenadas da mesma maneira e as condies de germinao e congelamento foram as mais semelhantes possveis, a fim de evitar qualquer variao ambiental. Esta variabilidade pode ser proveniente de outros processos, alm da reproduo sexual, como mutao gnica e eventos de transposio. A mutao gnica, contudo, um evento cuja taxa de ocorrncia baixa e certamente no originaria toda a variabilidade encontrada nas prognies dos bitipos estudados. Diferentemente, eventos de transposio podem causar um alta freqncia de mutaes instveis. Por anlises eletroforticas no h como comprovar a presena de transposons, pois estes no causam um padro eletrofortico caracterstico. Pode-se, entretanto, presumir sua presena quando ocorre segregao no-mendeliana. Entretanto, no foi possvel determinar o controle gentico das bandas analisadas e nem o tipo de segregao que est ocorrendo. Portanto, um fato concreto e indiscutvel a presena de uma grande variabilidade isoenzimtica entre plntulas-irms, no sendo possvel, entretanto, concluir indubitavelmente se esta variabilidade pode ser atribuda ocorrncia de reproduo sexual ou a outros fatores. Isso indica a necessidade de estudos mais aprofundados a fim de confirmar o modo de reproduo destes dois bitipos de P. dilatatum. CONCLUSES Anlises isoenzimticas mostraram ocorrncia de variabilidade entre indivduos irmos dos bitipos anteras roxas e Torres de P. dilatatum. Estes resultados sugerem a ocorrncia de reproduo sexual nestes bitipos descritos como apomticos. Entretanto, os resultados obtidos no permitem confirmar indubitavelmente a origem desta variabilidade encontrada. AGRADECIMENTOS
FINEP pelo apoio financeiro. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq) pelas bolsas concedidas. Ao Dr. Jos Francisco Montenegro

Valls, CENARGEN-EMBRAPA, por seu auxlio nas expedies de coleta e pela identificao taxonmica das plantas estudadas.

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