Quim. Nova, Vol. 32, No.

1, 214-222, 2009 O estadO da arte da crOmatOgrafia lquida de ultra eficincia

Reviso

liane maldaner e isabel cristina sales fontes Jardim* Departamento de Qumica Analtica, Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13084-971 Campinas SP, Brasil Recebido em 8/4/08; aceito em 14/7/08; publicado na web 5/12/08

THE STATE OF ART OF ULTRA PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY. Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) retains the same principles as High Performance Liquid Chromatography (HPLC), but uses 1-2.1 mm i.d. columns with sub-2 m particles. It is considered the newest advance in analytical separation science. The use of these small particles with mobile phases at high linear velocities increases resolution and detectability and decreases analysis time. Thus, the analyses are faster, the solvent volume is smaller, the efficiency is higher and the detectability is 2-3 times higher when compared with HPLC analysis.

Keywords: ultra performance liquid chromatography; sub-2 m particles; fast analysis.

intrOduO Desde o incio da cromatografia lquida (CL), em 1950, at os dias atuais, muitos avanos foram alcanados e todos eles foram impulsionados pelo desenvolvimento contnuo de novas partculas de fases estacionrias (FE) que fossem capazes de gerar colunas mais seletivas, eficientes e estveis qumica e mecanicamente. Nos ltimos 40 anos, a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) tem sido a tcnica analtica mais desenvolvida, difundida e empregada em laboratrios de anlise de indstrias qumicas e farmacuticas, em reas mdicas e em muitos outros campos da cincia e at em rgos governamentais. Associada a essa expanso, na ltima dcada, o desenvolvimento da CLAE tem sido direcionado necessidade de anlises mais rpidas, porm sem o comprometimento do desempenho cromatogrfico. Para isso, a reduo do tamanho das partculas da FE e das colunas foi a alternativa mais atrativa, porm ficou limitada por um perodo por causa da elevada presso resultante desta concomitante reduo, que no compatvel com os sistemas cromatogrficos convencionais. Entretanto, o uso de partculas menores que 2 m se tornou possvel recentemente, com o desenvolvimento da cromatografia lquida de ultra eficincia (CLUE). desenVOlVimentO da crOmatOgrafia lquida aO lOngO da sua Histria O desenvolvimento da CL, desde o seu incio em 1950, quando se usavam colunas recheadas com partculas irregulares de 100-200 m que alcanavam eficincias de apenas 200 pratos/15 cm, at hoje, est voltado para a tecnologia das partculas de recheio, associado busca de melhor desempenho cromatogrfico, melhor reprodutibilidade e anlises mais rpidas sem perda de eficincia e de resoluo. Como forma de elucidar a trajetria da evoluo desta tcnica, que atualmente emprega, com sucesso, partculas de FE menores que 2 m, os seus avanos esto detalhados no breve histrico1,2 descrito a seguir. Ao redor dos anos 60, foram introduzidas as colunas recheadas com partculas peliculares rgidas de 40-50 m, mecanicamente resistentes e, dessa forma, prprias para serem usadas com presso.
*e-mail: icsfj@iqm.unicamp.br

Estas partculas ofereciam maiores eficincias, 1000 pratos/15 cm, devido taxa rpida de transferncia de massa resultante da camada porosa fina das partculas peliculares, porm, apresentavam baixa rea superficial e, conseqentemente, baixa capacidade de amostra. A transio para partculas porosas menores, com dimetros em torno de 10 m, ocorreu por volta dos anos 70, com a finalidade de contornar as desvantagens apresentadas pelas partculas de dimetro maior e pelas peliculares. As colunas recheadas com partculas de 10 m apresentaram um ganho em eficincia, 6000 pratos/15 cm, quando comparadas s existentes at ento. Entretanto, a reprodutibilidade do enchimento destas colunas com partculas menores e irregulares tornou-se um desafio, at serem desenvolvidas as partculas esfricas. A partir dos anos 80, com a introduo das partculas esfricas, o desenvolvimento voltou-se basicamente para a reduo do dimetro das partculas de FE. As primeiras partculas esfricas desenvolvidas possuam dimetros de 5 m e apresentavam eficincia de 12000 pratos/15 cm e, 10 anos mais tarde, foram introduzidas as partculas esfricas de 3-3,5 m que alcanavam eficincias significativamente maiores que as anteriores, em torno de 22000 pratos/15 cm. Com isso, as anlises tornaram-se 30-50% mais rpidas e eficincias mais elevadas foram alcanadas, uma vez que estas partculas permitem enchimentos mais reprodutveis e formam um leito cromatogrfico mais homogneo e compacto. Em 1996, foram introduzidas as partculas esfricas no porosas de 1,5 m, com as quais foram obtidas colunas com eficincias de 30000 pratos/15 cm. Alm da alta eficincia, estas partculas oferecem menor resistncia transferncia de massa, facilitando o uso de uma faixa ampla de vazes de fase mvel, sem perda de desempenho cromatogrfico e so mais resistentes e estveis s altas presses e temperaturas. Entretanto, devido rea superficial baixa, estas partculas resultam em menor capacidade de amostra que as partculas porosas e, por causa do tamanho pequeno, proporcionam tempos de reteno menores. Dessa forma, estes materiais so geralmente empregados para separao de macromolculas como, por exemplo, as protenas que tm difuso lenta na fase mvel. Somente aps 50 anos de desenvolvimento, surgiram as partculas esfricas porosas de 2,5 m, com as quais so obtidas colunas com altas eficincias (25000 pratos/15 cm), os enchimentos so reprodutveis e as anlises so mais rpidas devido concomitante diminuio dos tamanhos das colunas. Poucos anos mais tarde, surgiram as

Vol. 32, No. 1

O estado da arte da cromatografia lquida de ultra eficincia

215

partculas esfricas porosas de 1,7 m que, comparadas s partculas de 5 ou 3 m, permitem melhores resolues e altas eficincias, 30000 pratos/15 cm, porm, necessitam de uma instrumentao mais sofisticada para serem empregadas com o mximo de desempenho cromatogrfico.1-4 Os desenvolvimentos significativos alcanados na ltima dcada foram conseqncia do uso intenso da CLAE no mundo todo, como uma tcnica de anlise de rotina em laboratrios e, dessa forma, a busca por anlises mais rpidas e com bom desempenho cromatogrfico tornou-se evidente e necessria. A alternativa mais simples, para diminuir o tempo de anlise, seria o uso de colunas mais curtas associadas a vazes mais elevadas de fase mvel (FM). Com isso, as anlises e os tempos de reequilbrio da coluna seriam mais rpidos e as presses seriam compatveis com os sistemas convencionais de CLAE, devido ao menor comprimento da coluna. Esta alternativa foi aplicada, empregando-se partculas de FE de 3-3,5 m, mas mesmo assim as separaes apresentavam menor desempenho cromatogrfico e perda de resoluo.4-6 Outra estratgia foi o uso das colunas monolticas,1,7,8 que so um meio contnuo de separao, comumente em formato cilndrico, altamente poroso e preparadas a partir de slica ou de material polimrico. A estrutura caracterizada por apresentar macroporos (2 m) e mesoporos (13 nm) que conferem aos monolitos eficincias similares s alcanadas com colunas recheadas com partculas de 3-3,5 m, porm, oferecem uma permeabilidade maior que os materiais particulados e, dessa forma, podem ser usadas vazes mais altas sem aumento da presso no sistema cromatogrfico e sem perda de eficincia, devido rpida taxa de transferncia de massa. Entretanto, o uso das colunas monolticas est limitado s colunas comercialmente disponveis, que so de um nico fabricante, Merck, e apresentam dimetros internos de 4,6 e 3,0 mm, no sendo to compatveis com o espectrmetro de massas (EM), alm de consumirem maiores quantidades de solventes e possurem estabilidade qumica limitada em uma estreita faixa de pH (2-8). A busca por anlises rpidas deu incio cromatografia lquida de alta temperatura (CLAT)1,5 que emprega colunas convencionais de CLAE, porm, as anlises so realizadas em temperaturas maiores que 60 C. O uso de altas temperaturas diminui a viscosidade da fase mvel e, conseqentemente, gera menores presses no sistema cromatogrfico, permitindo o uso de vazes de FM mais elevadas. Com isso so alcanadas maiores eficincias, maiores velocidades de transferncia de massa e menores tempos de anlise. Entretanto, esta tcnica apresenta muitas desvantagens, entre elas, poucos materiais de recheio so estveis a altas temperaturas, possibilidade de degradao dos compostos analisados e dificuldade de aquecimento e resfriamento da fase mvel, que restringem o seu uso em anlises de rotina. Recentemente, o uso de partculas menores que 2 m, em sistemas cromatogrficos com presses convencionais, 40 MPa (6000 psi), tem diminudo bastante o tempo de anlise, porm, o mximo desempenho cromatogrfico tem sido limitado pela presso. Para contornar o obstculo da presso e fazer uso das partculas menores que 2 m, com o mximo de desempenho cromatogrfico, tornando as anlises at 20 vezes mais rpidas, sistemas capazes de trabalhar em altas presses, 100 MPa (15000 psi), foram desenvolvidos e esse avano da cromatografia lquida foi denominado de cromatografia lquida de ultra eficincia (CLUE). influncia dO tamanHO das Partculas em crOmatOgrafia lquida Como mostrado, o crescimento do emprego da cromatografia lquida deve-se evoluo dos materiais de recheio, que permitiram separaes cada vez melhores. A base dessa evoluo governada

pela equao de van Deemter,2,3,9-11 que descreve a relao entre eficincia, expressa pela altura de prato (H, m), velocidade linear da fase mvel (, mm/s) e tamanho da partcula (dp): (1)

onde DM = coeficiente de difuso do analito e A, B e C so constantes. O termo A refere-se ao alargamento dos picos devido aos diferentes caminhos seguidos pelas molculas do analito. Esse termo pode ser minimizado usando-se colunas de tamanho reduzido, com dimetros internos menores, com enchimentos eficientes e partculas uniformes. O termo B est relacionado difuso longitudinal ou difuso do soluto na FM e este termo pode ser minimizado com o uso de altas velocidades lineares da FM. O termo C descreve a transferncia de massa do analito entre a FM e a FE. O mnimo da curva de van Deemter representa a vazo tima para se obter a eficincia mxima da coluna. Isto um compromisso entre os termos B e C. Os termos A e C so influenciados pelo tamanho das partculas. As partculas menores tendem a reduzir a altura do prato e, dessa forma, so obtidas colunas com um nmero de pratos maior, ou seja, mais eficientes. As partculas pequenas tendem a permitir trocas do soluto na FM e nos poros das partculas mais rapidamente devido a menor profundidade dos poros. Assim, o soluto gasta um tempo menor entre a FM e a FE, eluindo em picos estreitos. Uma vantagem do uso de partculas menores que 2 m que a eficincia da coluna pode ser mantida com a diminuio do seu comprimento. Uma coluna menor permite separaes mais rpidas, uma vez que o tempo de separao proporcional ao comprimento da coluna. Alm disso, uma coluna menor, comparada a uma maior, empregando-se a mesma vazo de fase mvel, gasta uma menor quantidade de solvente, de amostra e de FE. Na Figura 1, esto apresentadas as curvas de van Deemter,1,2,12-14 para partculas de 10, 5, 3 e 2 m, que mostram que as partculas 2 m podem ser usadas para separaes rpidas e ultra rpidas, uma vez que as eficincias so mantidas com uso de colunas curtas e com altas velocidades lineares de FM.

Figura 1. Curva de van Deemter para partculas de 10, 5, 3 e 2 m. Adaptada da ref. 1

O uso de colunas recheadas com essas partculas 2 m requer a otimizao de outros parmetros experimentais. A diminuio do tamanho da partcula provoca um aumento na presso do sistema, conforme a Equao 2:6,15 (2)

216

Maldaner e Jardim

Quim. Nova

onde P = presso, = resistncia vazo, L = comprimento da coluna (mm), = viscosidade da FM (mPa/s), = velocidade linear (mm/s) e dp = tamanho da partcula (m). Dessa forma, se o tamanho da partcula for reduzido pela metade, tem-se um aumento da presso por um fator de 4. Porm, como o uso das partculas menores est associado ao emprego de colunas mais curtas, esse aumento na presso passa a ser menor que 4 vezes, mas, mesmo assim, no compatvel com um sistema convencional de CLAE. Outros fatores que precisam ser otimizados so o volume extra coluna e o tempo de residncia dos gradientes, tempo que a FM leva para percorrer o sistema cromatogrfico desde a sada do misturador at o topo da coluna, como forma de minimizar o alargamento do pico cromatogrfico e obter a mxima eficincia da coluna. crOmatOgrafia lquida assOciada aO usO de altas Presses A primeira citao relacionada ao uso de altas presses, denominada cromatografia lquida de ultra alta eficincia (CLUAE), foi a de Bidlingmeyer et al.,16 em 1969, que empregaram partculas menores que 2 m, em uma coluna longa e de dimetro interno grande. Entretanto, os resultados obtidos foram irreprodutveis devido a problemas no enchimento. Os primeiros trabalhos relevantes usando presses acima de 410 MPa (60000 psi) foram realizados por Jorgenson e colaboradores17 e Lee e colaboradores,18 por volta de 1997, nos quais usaram colunas capilares de slica fundida (30 m x 52 cm) e partculas no porosas de 1-1,5 m que resultaram em eficincias de 140000-190000 pratos. Esta tcnica foi empregada na separao de benzodiazepnicos, de compostos farmacuticos e de herbicidas. Entretanto, a dificuldade em adaptar um sistema de injeo apto a fazer a introduo da amostra em um sistema a alta presso fez com que essa tcnica ficasse restrita aos laboratrios acadmicos que possussem sistemas de CLUAE de fabricao prpria.10,12,19 O potencial de separao apresentado pelo CLUAE impulsionou as pesquisas para o desenvolvimento de um sistema adequado para trabalhar com altas presses, porm, usando partculas de slica porosas ( 2 m) e colunas analticas de CLAE, o que deu origem cromatografia lquida de ultra eficincia (CLUE). crOmatOgrafia liquida de ultra eficincia (clue) A CLUE o avano mais recente das tcnicas de separao, baseia-se nos mesmos princpios da cromatografia lquida de alta eficincia e utiliza fases estacionrias com partculas menores que 2 m. O uso destas partculas juntamente com as altas velocidades lineares da FM aumentam a resoluo e a detectabilidade e diminuem o tempo das anlises.13,14,20-27 Para tornar isto possvel, uma vez que a atual tecnologia de instrumentao (bombas, injetores e detectores) disponvel para a CLAE no projetada para trabalhar em altas presses, um novo equipamento que pode operar em presses acima de 100 MPa foi introduzido e adaptado s necessidades atuais, em 2004 pela Waters Corporation. Este primeiro equipamento comercial capaz de operar em presses acima de 100 MPa (15000 psi) foi denominado pela Waters Corporation de AcquityTM ultra performance liquid chromatography system (UPLCTM).14,20 Logo em seguida, outros dois fabricantes, a Jasco e a Agilent, lanaram seus instrumentos de CLUE, o Xtrem LC (X-LC), tambm com capacidade de trabalhar em presses acima de 100 MPa e o 1200 Series Rapid Resolution LC system capaz de trabalhar em presses acima de 60 MPa (9000 psi),1,14,20 respectivamente.

As modificaes requeridas em um sistema de CLUE so: capacidade de trabalhar a presses muito altas (100 MPa), volumes internos muito menores (conexes, ala de amostragem, cela do detector, bombas), celas do detector sem disperso e com alta taxa de aquisio, melhoramento no sistema de controle e de dados, colunas resistentes para trabalharem a altas presses e com baixo volume morto, injetores com preciso na faixa de volumes pequenos. sistema de gerenciamentO de fase mVel Para se obter o mximo de aproveitamento das vantagens proporcionadas pelo tamanho reduzido das partculas e a fim de se alcanar elevada capacidade de separao em CLUE, uma instrumentao capaz de trabalhar em altas presses necessria. A presso necessria, considerando a vazo tima para alcanar o mximo de eficincia, empregando uma coluna de 15 cm recheada com partculas de FE de 1,7 m, fica ao redor de 15000 psi. Dessa forma, so requeridas bombas capazes de impulsionar a fase mvel de forma suave e reprodutvel nestas altas presses, para compensar a compressibilidade do solvente, e que sejam capazes de operar tanto no modo de eluio isocrtico como por gradiente.6,12,14,20 Em um sistema de CLUE, devido compressibilidade do solvente a altas presses, o fluxo deve ser impulsionado de forma rpida e o sistema deve ter baixos volumes para se obter um bom desempenho. Dessa forma, o equipamento de CLUE possui um sistema binrio de solventes, com duas bombas individuais em srie para propiciar gradientes a altas presses. Nas sadas das bombas, o filtro e o misturador (50 L) esto acoplados em um mesmo dispositivo, para diminuir o volume do sistema e fornecer uma mistura adequada. O sistema tem um volume total de aproximadamente 150 L. A vantagem de se fazer as misturas dos solventes a altas presses a obteno de um baixo volume do sistema, uma vez que o tempo de residncia da fase mvel menor.14,20,28 sistema de inJeO da amOstra As vlvulas de injeo convencionais, tanto as manuais quanto as automticas, no so projetadas e nem so rgidas o suficiente para operar em presses extremas. Para proteger a entrada da coluna das flutuaes resultantes do emprego das altas presses, o processo de injeo deve ser feito em um curto intervalo de tempo e com um fluxo relativamente livre de pulso. Dessa forma, a injeo da amostra realizada de forma automtica e o amostrador possui controle de temperatura de 4-40 C.13,14 O volume de injeo de amostra deve ser reduzido para evitar o espalhamento da amostra e, conseqentemente, o alargamento do pico cromatogrfico. Para isto, os equipamentos de CLUE possuem uma faixa de volume de injeo de apenas 0,1-50 L.13,20 necessrio tambm um ciclo rpido para a injeo da amostra, para se obter o mximo de aproveitamento da velocidade oferecida pelo CLUE, uma vez que requerida a separao de uma grande quantidade de compostos por unidade de tempo. Geralmente, nos sistemas de CLUE, o tempo de injeo da amostra sem a etapa da lavagem de 25 s, enquanto que com duas etapas de lavagem esse tempo passa para 60 s. O processo de lavagem em duas etapas pode ser realizado utilizando dois solventes diferentes, geralmente, de polaridades distintas para a completa limpeza da agulha, como forma de reduzir o efeito de memria, ou seja, o arraste da amostra injetada em uma anlise posterior e para aumentar a detectabilidade.1,13,20,28,29 Outra forma de anular o efeito de memria, alm de reduzir os problemas de entupimento da agulha e diminuir a disperso da amostra dentro da agulha de amostragem usar agulhas do tipo needle-in-needle, ou seja, tem-se uma agulha dentro de outra agulha,

Vol. 32, No. 1

O estado da arte da cromatografia lquida de ultra eficincia

217

sendo a agulha interna de PEEK (politer ter cetona) e a externa de ao inoxidvel.13,20 A agulha de ao inoxidvel utilizada para perfurar o septo e a agulha de PEEK empregada para sugar a amostra, uma vez que a adsoro da amostra no PEEK menor que no ao inoxidvel. cOlunas e fases estaciOnrias O emprego de partculas 2 m como material de recheio das colunas cromatogrficas aumenta a resistncia ao fluxo da FM,6,14 de modo que estas colunas devem operar em presses mais altas. Alm disso, as maiores eficincias destas colunas so alcanadas com o uso de altas velocidades lineares de FM, o que tambm contribui para o aumento da presso no sistema cromatogrfico, podendo atingir presses maiores que 100 MPa. Dessa forma, alm de desenvolver FE resistentes, principalmente, ao uso de altas presses, mudanas nos tubos das colunas e no processo de enchimento tambm foram necessrias. Em termos de instrumentao,13,20,30 foi necessria a reduo do dimetro interno do tubo da coluna, de 3,0-4,6 mm das convencionalmente usadas para partculas de 3-5 m, para um dimetro interno de 1,0-2,1 mm para as partculas 2 m, a fim de minimizar o efeito do aquecimento dos solventes da fase mvel, que ocorre quando so usadas altas presses. Este aquecimento pode provocar um gradiente de temperatura ao longo da corrida, gerando uma vazo de FM no uniforme, o que pode prejudicar as separaes tornando-as irreprodutveis. Foi necessrio tambm o desenvolvimento de novos filtros de coluna, com porosidade menor que 2 m para reter as partculas das FE, capazes de resistirem s altas presses e a um grande nmero de injees, sem apresentarem problemas de entupimento, uma vez que a porosidade extremamente reduzida.1,14 Para tornar o sistema de enchimento prprio para o recheio de colunas curtas e com FE da ordem de 2 m foi necessria a ampliao da faixa de presso mxima que pode ser aplicada, que passou de 100 MPa (15000 psi) dos sistemas de enchimento comumente utilizados para colunas com partculas de 3-5 m para 134 MPa (20000 psi) para as partculas 2 m. Esta etapa considerada crtica, devido dificuldade encontrada na reprodutibilidade do enchimento das colunas com partculas com este tamanho.20,30 Em relao s FE utilizadas em cromatografia lquida de forma geral, muitos avanos j aconteceram, como descrito ao longo do texto, porm as FE prprias para serem empregadas em CLUE ainda so alvo de desenvolvimento, devido ao nvel de excelncia exigido por estes sistemas. As partculas de slica nua, existentes at ento, no possuam a resistncia mecnica ou a eficincia necessria que as separaes em CLUE demandam. As partculas a serem empregadas em CLUE devem apresentar, como um dos primeiros requisitos, maior resistncia fsica ou mecnica, porm, esta caracterstica no pode estar associada diminuio de capacidade de amostra, como o caso das partculas no porosas, menores que 2 m. recomendvel tambm, que as novas partculas sejam estveis a uma grande faixa de pH e que as interaes indesejveis com os compostos analisados sejam minimizadas.14,20,30 Estas caractersticas, porm, no so somente desejveis quando se trata de CLUE e sim em qualquer modalidade da cromatografia lquida. tiPOs de cOlunas de clue Atualmente, vrios fabricantes2,5,6,30 tm desenvolvido colunas com dimenses adequadas para CLUE, conforme mostra a Tabela 1, porm apenas as colunas do tipo AcquityTM UPLC BEH, fabricadas

pela Waters, preenchem todos os requisitos necessrios para trabalhar na condio de mximo desempenho da CLUE. O diferencial das colunas AcquityTM UPLC BEH das demais o emprego de partculas hbridas (orgnicas e inorgnicas) que so mais resistentes mecanicamente que as partculas de slica pura.2 tabela 1. Fabricantes, denominao e tamanho das partculas das colunas cromatogrficas desenvolvidas para CLUE Fabricante Waters Agilent Thermo Electron Bischoff Altech Macherey Nagel Shimadzu Interchim Sepax YMC Coluna AcquityTM UPLC BEH Zorbax Hypersil GOLD ProntoPEARL Platinum HPLC Nucleodur Pathfinder TSKgel Super-ODS GP Series YMC ultra-fast Tamanho da partcula (m) 1,7 1,8 1,9 1,8 1,5 1,8 1,5 2,0 2,0 2,0

A tecnologia envolvida na obteno dessas partculas ser descrita e discutida, tendo como base as colunas do tipo Zorbax e AcquityTM UPLC BEH, com o objetivo de mostrar os desenvolvimentos mais recentes no que diz respeito s fases estacionrias para CLUE. colunas Zorbax O desenvolvimento das FE das colunas Zorbax com tamanho de partculas reduzido baseou-se na busca de melhor estabilidade qumica em condies mais agressivas de FM, uma vez que a faixa de pH da slica est limitada entre 2 e 8, de melhor estabilidade fsica e de maior tempo de vida til. As colunas Zorbax Eclipse Extra Densely Bonded (XDB) consistem de uma FE de 1,8 m do tipo C18, C8 ou fenil que duplamente capeada (Figura 2 A), o que reduz o nmero de silanis livres para um valor quase nulo, podendo ser usadas em uma faixa de pH de 2-9. Essas FE so convenientes para a separao de compostos neutros, bsicos e cidos.2,31 O processo de capeamento consiste em uma reao de silanizao com um reagente organossilano de tamanho reduzido, aps a qual se tem uma reduo do nmero de silanis residuais. Outro tipo de coluna disponvel a Zorbax StableBond (SB) que preparada a partir de silanos monofuncionais com cadeias C3, C8, C18, fenil e CN e de grupos volumosos que protegem estericamente as ligaes siloxano (Figura 2 B). Para as FE do tipo C18 os grupos protetores podem ser diisobutil ou diisopropil, enquanto que para as FE dos tipos C8, C3, fenil e CN so empregados os grupos diisopropil. Estas FE estericamente protegidas fornecem maior estabilidade e aumentam o tempo de vida e a reprodutibilidade destas FE quando so usadas FM cidas, uma vez que elas resistem a uma faixa de pH de 1-6 e so compatveis com FM com elevada quantidade de gua.2,31 colunas acquitytm O desenvolvimento das colunas AcquityTM foi direcionado s peculiaridades impostas pela CLUE, como a preparao de partculas de FE especiais. Para atender este requisito, foram desenvolvidas as partculas hbridas, produzidas pela reao de bis(trietoxissililetano) e

218

Maldaner e Jardim

Quim. Nova

Figura 4. Microscopia das partculas de slica: (A) pura de 5 m e (B) hbrida de segunda gerao de 1,7 m. Adaptada da Waters Corporation

Figura 2. Estruturas das fases estacionrias: (A) Zorbax Eclipse eXtra Densely Bonded C8 e (B) Zorbax StableBond. Adaptada da ref. 31

tetraetoxissilano, que d origem a uma partcula de slica com pontes de etano inseridas na sua estrutura (polietoxissilano), denominada de slica hbrida de segunda gerao (Figura 3). Estas partculas so muito diferentes das partculas tradicionais de slica, porque as modificaes tm resultado em adio de carbono (grupos etil) nas ligaes siloxano, semelhante ao que ocorre no processo de capeamento.

cadeias de C8 so menos hidrofbicas e, conseqentemente, oferecem menor reteno. Ambas as fases estacionrias encontram-se capeadas; Shield RP18 - a denominao dada s colunas recheadas com FE que possuem grupos carbamatos embutidos, que conferem uma reteno diferenciada para os compostos doadores de hidrognio. Estas FE so capeadas com trimetilsilano; C6 Fenil - so recheadas com FE do tipo fenil que conferem uma seletividade especfica para compostos aromticos ou outros compostos com eltrons . Estas tambm so FE capeadas. Poucos estudos foram realizados para avaliar a estabilidade destas novas colunas para CLUE. As colunas AcquityTM foram avaliadas por King et al.32 e por Grumbach et al.,30 quanto resistncia mecnica a altas presses e estabilidade qumica, usando uma FM tamponada com metilpirrolidina a pH 11,3, respectivamente. Os resultados obtidos mostraram, respectivamente, que a estabilidade dessas colunas foi de 4000 e de 1000 injees. Kaufmann e Butcher33 verificaram o aparecimento de picos duplos, com o uso de presses entre 73-82 MPa (11000-13000 psi), e associaram o problema ao entupimento dos filtros, ocasionado durante o enchimento das colunas. Dessa forma, difcil avaliar a estabilidade de uma coluna, uma vez que so muitos os fatores envolvidos, como, solventes e pH da FM, presses utilizadas, complexidade da amostra injetada, temperatura de anlise, entre outros. Porm, todos os trabalhos publicados mostram que as colunas apresentam boa estabilidade nas condies utilizadas. sistema de detecO Com o uso das partculas 2 m so obtidos picos cromatogrficos com largura a meia altura menores que 1 s, exigindo, dessa maneira, mudanas significativas nos detectores. De forma geral, para manter a exatido e a reprodutibilidade no processo de aquisio dos dados, tanto os detectores pticos, UV-VIS e arranjo de diodos (DAD), como os espectrmetros de massas precisam ser capazes de operar com altas taxas de amostragem, para adquirir um nmero de pontos suficientes para a construo do pico cromatogrfico. Teoricamente, a detectabilidade de um sistema de CLUE, comparada com a de um de CLAE, cerca de 2-3 vezes maior, dependendo do tipo de detector usado.1,12,14 Mudanas mais significativas ocorreram nos detectores pticos convencionais (UV e DAD) que so projetados para equipamentos de CLAE, nos quais so injetadas maiores quantidades de amostra e o tempo de anlise mais longo, quando comparado com o de CLUE. Assim, esses detectores necessitam de diminuio do volume da cela do detector e um longo caminho ptico, para manter a concentrao e o sinal e uma baixa disperso da amostra, a fim de se obter alta detectabilidade. As dimenses de volume da cela e o comprimento do caminho ptico, desses detectores, so de aproximadamente 500 nL e 10 mm, respectivamente.13,14,20

Figura 3. Equao da reao qumica de sntese da slica hbrida de segunda gerao. Adaptada da ref. 30

A combinao de material orgnico e inorgnico gera partculas com dimetros de 1,7 m que possuem maior estabilidade mecnica, uma vez que as ligaes silcio-carbono so similares s ligaes silcio-oxignio; so resistentes em uma faixa extensa de pH (1-12) e esta maior estabilidade qumica conferida pelas pontes de carbono que esto inseridas na superfcie da slica; so estveis em temperaturas de at 60 C e fornecem uma boa simetria de pico, devido quantidade reduzida de silanis residuais.1,2,5,6,9,12-14,30 Cabe ressaltar ainda que estas partculas conferem um aumento na resoluo dos picos cromatogrficos, devido s altas eficincias fornecidas por estas colunas. Alm disso, as partculas hbridas de 1,7 m14,20,30 so obtidas em uma distribuio estreita de tamanho de partculas, que pode ser visualizada na Figura 4, o que alm de facilitar o processo de enchimento das colunas, gera um leito cromatogrfico mais homogneo e eficiente. Encontram-se disponveis comercialmente 4 colunas AcquityTM UPLC BEH,2,30 com diferentes caractersticas, que empregam partculas hbridas de segunda gerao de 1,7 m: C18 e C8 - so recheadas com FE contendo cadeias alquil ligadas superfcie da slica, de forma a oferecer melhor estabilidade hidroltica. As fases estacionrias com

Vol. 32, No. 1

O estado da arte da cromatografia lquida de ultra eficincia

219

A constante de tempo do detector deve ser suficientemente rpida ( 100 ms) devido s estreitas larguras de base dos picos (apenas poucos segundos) e s altas taxas de amostragem (> 20 Hz) e de aquisio dos dados (20-40 pontos/s) que so necessrias para adquirir dados suficientes em curto espao de tempo.13,14,20 caracteriZaO dO desemPenHO crOmatOgrficO das cOlunas de clue A cromatografia lquida de ultra eficincia, por ser uma tcnica bastante recente, ainda est em processo de avaliao por pesquisadores da rea e tambm pelos usurios da cromatografia lquida em diversos tipos de anlises, visando estabelecer as vantagens que esta nova modalidade oferece em relao cromatografia lquida de alta eficincia. Sob este ponto de vista, alguns trabalhos foram desenvolvidos, como o de Novkov et al.12 que desenvolveram um mtodo para analisar os compostos de uma formulao farmacutica de diclofenaco. Estas anlises foram realizadas por CLUE, empregando as colunas AcquityTM BEH C18 (50 x 2,1 mm, 1,7 m) e (100 x 2,1 mm, 1,7 m) e por CLAE, empregando as colunas Zorbax Eclipse XDB-C18 (75 x 4,6 mm, 3,5 m), Zorbax Eclipse SB-C18 (50 x 4,6 mm, 1,8 m), Purospher RP18e (125 x 4,0 mm, 5,0 m) e uma coluna monoltica Chromolith Performance RP-18e (100 x 4,6 mm). Do ponto de vista de reprodutibilidade do tempo de reteno e da rea dos picos cromatogrficos, as colunas Zorbax com partculas de 1,8 e 3,5 m apresentaram melhores resultados que as colunas AcquityTM e isto pode estar relacionado baixa preciso, devida ao uso parcial da agulha de injeo. Em relao simetria de pico, resoluo e eficincia, as colunas AcquityTM apresentaram resultados substancialmente melhores que os obtidos para as demais colunas. Os melhores resultados de tempo de anlise e de consumo de solvente foram obtidos com as colunas AcquityTM. Com a coluna AcquityTM (50 x 2,1 mm, 1,7 m) o tempo de anlise foi de 2,4 min e o consumo de FM, metanol:gua acidificada com cido fosfrico a pH 2,5 (65:35 v/v) a uma vazo de 0,45 mL/min, foi de 1,08 mL, enquanto que com a coluna Purospher (125 x 4,0 mm, 5,0 m) o tempo de anlise foi de 13 min e o consumo de FM (vazo de 0,7 mL/min) foi de 11,9 mL. Com as colunas Zorbax de 1,8 m o tempo de anlise foi similar aos obtidos com as colunas AcquityTM (3,5 min), e com a coluna monoltica foi obtido o menor tempo de anlise (1,8 min), porm todas estas colunas apresentaram um maior consumo de solvente em relao s colunas AcquityTM, por causa das maiores vazes de FM requeridas por estas colunas. Outra avaliao interessante apresentada neste trabalho refere-se ao uso das colunas convencionais de CLAE em CLUE. Para isso, as colunas Zorbax foram conectadas ao sistema de CLUE e as mesmas anlises foram realizadas. Os resultados mostraram que esta operao pode ser facilmente realizada, porm no apresenta vantagem significativa, devido necessidade do uso de vazes de FM menores que aquelas empregadas no sistema de CLAE. Dessa forma, o uso de colunas convencionais no sistema de CLUE no gera anlises mais rpidas, porm foi verificada uma melhora na simetria do pico cromatogrfico. Nguyen et al.6 compararam colunas recheadas com partculas 2 m, usando um sistema de CLUE, com colunas convencionais recheadas com partculas de 3,5 e 5 m, usando um sistema de CLAE, na anlise de uma mistura de 4 alquilparabenos. Os resultados destas comparaes mostraram que: (a) as colunas recheadas com partculas de 1,7 m apresentaram eficincias trs vezes maiores e as anlises foram oito vezes mais rpidas que as colunas recheadas com partculas de 5 m. Isto pode ser verificado visualizando a Figura 5, porm importante observar que a escala do eixo das abscissas (tempo de

anlise) foi expandida para a coluna AcquityTM; (b) o nmero de pratos por unidade de tempo (pratos/s), que um parmetro que descreve o compromisso entre alta eficincia e anlises rpidas, foi maior que 1000 pratos/s, que um valor muito bom, uma vez que so sugeridos valores entre 400-1000 pratos/s quando se emprega condies de CLUE e em torno de 100 pratos/s quando se emprega cromatografia lquida convencional; (c) os valores de resistncia ao fluxo de fase mvel apresentados pelas colunas recheadas com partculas de 1,7 m foram maiores que os valores apresentados pelas colunas recheadas com partculas de 1,9 m, sugerindo, dessa forma, que as colunas recheadas com partculas de 1,7 m possuem uma maior compactao do leito cromatogrfico e uma distribuio mais estreita de tamanho de partculas, uma vez que a permeabilidade e a resistncia ao fluxo no variam com a natureza das partculas do leito cromatogrfico, mas sim com os espaos entre as partculas e com a compactao do mesmo; (d) as colunas recheadas com as partculas 2 m apresentaram boa estabilidade durante algumas centenas de injees, enquanto que as colunas recheadas com as partculas de 5 m se mostraram estveis a um nmero bem maior de injees (500-1000). Esta diferena pode estar relacionada com a nova geometria das colunas de CLUE, as altas presses de enchimento e a pequena porosidade dos filtros, que podem entupir aps um grande nmero de injees. Com o mesmo intuito de comparao descrito acima, Villiers et al.9 realizaram um trabalho empregando colunas recheadas com partculas de 1,7 m em um sistema de CLUE e colunas recheadas com partculas de 3,5 e 5 m em um sistema de CLAE, na anlise de uma mistura de uracila, cafena, piridina, anilina, fenol, acetofenona e benzeno, geralmente usada para a avaliao do desempenho cromatogrfico de colunas convencionais de CLAE. Os resultados obtidos confirmam os conceitos introduzidos neste texto: (a) a velo-

Figura 5. Cromatogramas obtidos na separao dos alquilparabenos (1 metilparabeno, 2 etilparabeno, 3 propilparabeno, 4 butilparabeno). (A) Coluna XTerra RP18 (4,6 x 150 mm, 5 m). Condies Cromatogrficas: FM: acetonitrila:gua (40:60 v/v), vazo da FM: 900 L/min, temperatura: 30 C, volume de injeo: 10 L e deteco por arranjo de diodos a 254 nm. (B) Coluna AcquityTM BEH C18, (2,1 x 50 mm, 1,7 m). Condies Cromatogrficas: FM: acetonitrila:gua (40:60 v/v), vazo da FM: 520 L/ min, temperatura: 30 C, volume de injeo: 1 L e deteco por arranjo de diodos a 254 nm. Adaptada da ref. 6

220

Maldaner e Jardim

Quim. Nova

cidade linear tima e a altura de prato obtida para a coluna recheada com partculas de 1,7 m foram respectivamente de 0,37 cm/s e 4,4 m, enquanto que os valores para a coluna recheada com partculas de 5 m foram de 0,17 cm/s e 9,4 m, comprovando experimentalmente que as partculas de dimetros menores fornecem maiores eficincias com o aumento das velocidades lineares de fase mvel; (b) a combinao da vazo tima com colunas mais curtas recheadas com partculas de 1,7 m proporcionou uma diminuio no tempo de anlise de 4,3 e 3,5 vezes, quando comparadas com as colunas recheadas com partculas de 5 e 3,5 m, respectivamente, sem diminuir a eficincia das colunas; (c) a avaliao da formao de gradiente de temperatura com o emprego de altas presses foi realizada analisando a perda de eficincia de colunas isoladas em espuma de poliestireno, simulando um meio adiabtico, e de colunas no isoladas, usando as vazes timas e as vazes que resultassem na presso limite do CLUE. Os resultados mostraram que existe uma perda na eficincia de aproximadamente 10% somente quando a coluna no est isolada e com a aplicao de vazes mais altas, mostrando que o gradiente de temperatura no tem muita influncia quando se utiliza a vazo tima de anlise. transferncia de mtOdOs de clae Para clue A possibilidade de transferncia de um mtodo j desenvolvido e protocolado empregando um sistema de CLAE para um de CLUE um aspecto muito importante a ser considerado, pois, muitas vezes, tem-se constitudo no fator limitante para difuso e uso da CLUE. Segundo os estudos de Veuthey e colaboradores,24,26 a transferncia de um mtodo de CLAE j desenvolvido para CLUE totalmente passvel, desde que determinados fatores sejam considerados. Estes fatores dependem do modo de eluio empregado no mtodo de separao j desenvolvido. Na transferncia de um mtodo de separao no modo de eluio isocrtica,24 o principal fator que influencia o volume extra coluna (do injetor, da cela do detector e das tubulaes), que provoca alargamento do pico cromatogrfico quando no existe compatibilidade entre o volume extra coluna do equipamento com o dimetro da coluna, ou seja, para se obter uma boa separao a razo entre o volume extra coluna e o volume total (extra coluna e da coluna) deve ser menor que 10%, tanto em CLAE quanto em CLUE. Alm disso, para a transferncia do mtodo ser eficiente a fase estacionria empregada deve ser similar do mtodo j existente. Os parmetros a serem otimizados so o volume de injeo e a vazo da fase mvel, que podem ser calculados pelas Equaes 3 e 4, respectivamente, ou pelo programa desenvolvido e disponibilizado pelos mesmos autores, denominado de HPLC calculator v.2.0.34 (3)

Na transferncia de um mtodo de separao no qual foi empregada eluio por gradiente,26 o fator principal a ser considerado o tempo de residncia da FM que resulta em variaes nos tempos de reteno, comprometendo a resoluo, sobretudo dos primeiros compostos eludos, quando no existe compatibilidade entre o tempo de residncia da FM com o dimetro da coluna. Dessa forma, a transferncia s vlida quando o tempo de residncia da FM desprezvel, ou seja, quando a razo entre o tempo de residncia da FM e o tempo de retardamento da FM constante. Alm disso, para a transferncia do mtodo ser eficiente a fase estacionria empregada deve ser similar usada no mtodo j existente e as composies inicial e final do gradiente devem permanecer constantes. Os parmetros a serem otimizados so o volume de injeo, a vazo da fase mvel, o tempo da etapa isocrtica do gradiente e o tempo do gradiente que podem ser calculados pelas Equaes 3, 4, 5 e 6, respectivamente, ou pelo HPLC calculator v.2.0.34 (5)

onde, t = tempo, Vm2 = volume de retardamento da FM a ser empregado e Vm1 = volume de retardamento da FM empregado no mtodo desenvolvido. (6)

onde, %B =- porcentagem de solvente orgnico e

O sucesso da transferncia dos mtodos, nos dois modos de eluio, pode ser facilmente visualizado nos dois exemplos a seguir. O primeiro referente transferncia de um mtodo desenvolvido empregando CLAE para a separao de uma mistura de rapidocana,24 usando eluio isocrtica, para CLUE (Figura 6). Comparando-se os cromatogramas apresentados na Figura 6, pode-se perceber que a transferncia do mtodo plausvel de ser realizada, e, alm disso, o tempo de anlise reduziu para 40 s, a resoluo permaneceu constante e a eficincia aumentou em torno de 10%. O segundo exemplo refere-se transferncia de um mtodo desenvolvido empregando CLAE para a separao de uma formulao farmacutica,26 no modo de eluio gradiente, para CLUE. Os cromatogramas apresentados na Figura 7 mostram que a transferncia de um mtodo por eluio gradiente tambm pode ser realizada e, alm disso, o tempo de anlise reduziu por um fator de 10, a detectabilidade no foi afetada, a resoluo diminuiu somente 10% para o par 3-4 (que so os compostos mais afetados pelo tempo de residncia da fase mvel) e o tempo de reequilbrio da coluna passou de 20 para 2 min. aPlicaes da clue As primeiras aplicaes empregando um CLUE foram realizadas com um sistema acoplado a um EM com analisador de tempo de vo em anlises de metabonomas e genomas.13 Atualmente, muitos trabalhos j foram realizados, empregando CLUE com os detectores pticos (UV e DAD) e acoplado espectrometria de massas, nas mais diversas reas. Vrios trabalhos envolvem a determinao de frmacos,21,25,27,35-41 por exemplo, Dongre et al.21 fizeram a validao de um mtodo para a determinao de primaquina e suas impurezas usando colunas recheadas com partculas de 1,7 m, em um CLUEUV, e colunas recheadas com partculas de 5 m, em um CLAE-UV.

onde, Vinj2 = volume de injeo a ser determinado, Vinj1 = volume de injeo do mtodo desenvolvido, dc2 = dimetro interno da coluna a ser empregada, dc1 = dimetro interno da coluna empregada no mtodo desenvolvido, L2 = comprimento da coluna a ser empregada e L1 = comprimento da coluna empregada no mtodo desenvolvido. (4)

onde, F2 = vazo da fase mvel a ser determinada, F1 = vazo da fase mvel do mtodo desenvolvido, dp1 = dimetro da partcula de FE empregada no mtodo desenvolvido e dp2 = dimetro da partcula de FE a ser empregada.

Vol. 32, No. 1

O estado da arte da cromatografia lquida de ultra eficincia

221

Figura 6. Cromatogramas ilustrativos da transferncia de um mtodo de separao no modo de eluio isocrtica, desenvolvido para CLAE (A) e transferido para CLUE (B) para a separao de uma mistura de rapidocana (1-metilparabeno, 2-2,6-dimetilanilina, 3-propilparabeno, 4-lidocana). (A) Condies Cromatogrficas: Coluna XTerra RP18 (150 x 4,6 mm, 5 m), FM: acetonitrila:tampo fosfato pH 7,2 (50:50 v/v), vazo da FM: 1000 L/ min, volume de injeo: 20 L, temperatura: 30 C e deteco UV a 230 nm. (B) Condies Cromatogrficas: Coluna AcquityTM BEH C18 (50 x 2,1 mm, 1,7 m), FM: acetonitrila:tampo fosfato pH 7,2 (50:50 v/v), vazo da FM: 610 L/min, volume de injeo: 1,4 L , temperatura: 30 C e deteco UV a 230 nm. Adaptada da ref. 24

Os resultados obtidos empregando o primeiro sistema em relao ao segundo foram superiores em trs pontos principais: tempo de anlise (14 vezes mais rpido), eficincia e detectabilidade (2 vezes maior). A detectabilidade foi medida pelos limites de deteco (LD) e de quantificao (LQ), sendo que os LQ esto apresentados na Figura 8, na qual se pode avaliar, com clareza, o aumento da detectabilidade com uso de colunas recheadas com partculas 2 m e CLUE, uma vez que as duas tcnicas empregaram o mesmo detector. A determinao de agrotxicos4,42,43 tambm vem sendo explorada com o emprego de CLUE, e algumas pesquisas j foram desenvolvidas, como a de Kovalczuk et al.,4 que determinaram 16 agrotxicos em mas por CLUE-EM-EM e CLAE-EM-EM. As duas tcnicas possibilitaram a determinao dos compostos, porm o mtodo desenvolvido para o CLUE-EM-EM consumiu uma menor quantidade de solvente, devido ao menor tempo de anlise e forneceu limites de quantificao menores que os obtidos por CLAE-EM-EM, para a maioria dos compostos. Os LQ empregando CLUE-EM-EM ficaram entre 0,5-8,0 g/kg e empregando CLAE-EM-EM ficaram entre 2,08,0 g/kg, dependendo do composto. Este aumento de detectabilidade proporcionado pelo uso do CLUE importante, uma vez que os limites mximos de resduos de agrotxicos exigidos pelas agncias reguladoras tm sido cada vez menores. Outra aplicao interessante realizada por Bendahl et al.44 foi a determinao de conservantes em cosmticos base de bromo (bronopol, bronidox e metildibromo glutaronitrila) por CLUE-PAI-EM, ou seja, CLUE acoplado a um plasma de argnio com acoplamento indutivo (PAI) em srie a um EM, que se mostrou uma tcnica analtica muito atrativa, por combinar uma tcnica de separao de alta eficincia com um detector muito sensvel e especfico a um elemento. Os resultados mostraram que o emprego de altas velocidades lineares

Figura 7. Cromatogramas ilustrativos da transferncia de um mtodo de separao no modo de eluio gradiente, desenvolvido para CLAE (A) e transferido para CLUE (B) para a separao de uma formulao farmacutica. (A) Condies Cromatogrficas: Coluna XBridge C18 (150 x 4,6 mm, 5 m), FM: A 0,01% de cido frmico em H2O e B 0,01% de cido frmico em acetonitrila:gua (50:50 v/v), vazo da FM: 1000 L/min, gradiente: T(A:B) = T0 (100:0), T30 (40:60), T31 (100:0), T45 (100:0), volume de injeo: 20 L, temperatura: 30 C e deteco UV. (B) Condies Cromatogrficas: Coluna AcquityTM BEH C18 (50 x 2,1 mm, 1,7 m), FM: A 0,01% de cido frmico em H2O e B 0,01% de cido frmico em acetonitrila:gua (50:50 v/v), vazo da FM: 610 L/min, gradiente: T (A:B) = T0 (100:0), T3,4 (40:60), T3,5 (100:0), T5,1 (100:0), volume de injeo: 1,4 L , temperatura: 30 C e deteco UV. Adaptada da ref. 26

Figura 8. Medida dos LQ para a impureza II da primaquina. Condies Cromatogrficas: (A) CLAE: FM: acetonitrila:gua acidificada com 0,01% de cido trifluoractico (25:75 v/v), vazo de FM: 1 mL/min, volume de injeo: 10 L, deteco UV a 265 nm e temperatura: 35 C. (B) CLUE: as mesmas condies que em (A) com exceo da vazo de FM: 0,5 mL/min e volume de injeo: 0,8 L. Adaptada da ref. 21

de fase mvel proporcionou um curto tempo de anlise, enquanto que o uso de velocidades lineares de fase mvel intermedirias proporcionou um aumento na detectabilidade. A maior rapidez nas anlises apresentou a vantagem de menor consumo de argnio. Alm dos trabalhos descritos acima, outros foram realizados empregando CLUE, como, por exemplo, determinao de lactonas,23 to-

222

Maldaner e Jardim

Quim. Nova

xinas marinhas,45 cianobactrias,46 drogas veterinrias,47 saponinas,12,48 enzimas49 e metabonomas,50 o que comprova que a cromatografia lquida de ultra eficincia vem sendo avaliada e empregada em diversas reas. cOnclusO A cromatografia lquida de ultra eficincia uma tcnica bastante recente, que j est sendo utilizada em anlises de rotina em diversas reas. Esta rpida difuso est relacionada principalmente disponibilidade da instrumentao totalmente desenvolvida e adequada para as necessidades do emprego de partculas 2 m e altas presses e de materiais de recheio, como as partculas hbridas, que possuem desempenho cromatogrfico superior s partculas de slica pura. Com base nos desenvolvimentos recentes, no resta dvida que as anlises realizadas utilizando-se CLUE so muito mais rpidas, na ordem de poucos minutos, que o consumo de solventes bem menor, que as eficincias alcanadas so mais elevadas, que a detectabilidade de 2-3 vezes maior, quando comparadas s anlises realizadas utilizando-se CLAE. Alm disso, a transferncia de um mtodo j desenvolvido por CLAE para CLUE pode ser facilmente realizada, deixando de ser um fator limitante para o emprego da CLUE. Apesar de todas estas vantagens, poucos estudos foram realizados para avaliar o tempo de vida das colunas que so submetidas a condies extremas de presso e o custo de manuteno de um equipamento que possui uma srie de particularidades e opera em altas presses. Alm disso, a tecnologia das colunas de CLUE, que sejam capazes de gerar o mximo desempenho cromatogrfico, requer novos desenvolvimentos neste campo. agradecimentOs Os autores agradecem FAPESP e ao CNPq pelo apoio financeiro. referncias
1. Nguyen, D. T. T.; Guillarme, D.; Rudaz, S.; Veuthey, J. L.; J. Sep. Sci. 2006, 29, 1836. 2. Majors, R. E.; LCGC North Am. 2005, 23, 1248. 3. Neue, U.D.; Kele, M.; J. Chromatogr., A 2007, 1149, 236. 4. Kovalczuk, T.; Jech, M.; Poustka, J.; Hajslov, J.; Anal. Chim. Acta 2006, 577, 8. 5. Guillarme, D.; Nguyen, D. T. T.; Rudaz, S.; Veuthey, J. L.; J. Chromatogr., A 2007, 1149, 20. 6. Nguyen, D. T. T.; Guillarme, D.; Rudaz, S.; Veuthey, J. L.; J. Chromatogr., A 2006, 1128, 105. 7. Ikegami, T.; Tanaka, N.; Curr. Opin. Chem. Biol. 2004, 8, 527. 8. Wu, R.; Hu, L.; Wang, F.; Ye, M.; Zou, H.; J. Chromatogr., A 2008, no prelo. 9. Villiers, A.; Lestremau, F.; Szucs, R.; Glbart, S.; David, F.; Sandra, P.; J. Chromatogr., A 2006, 1127, 60. 10. Wren, S. A. C.; Tchelitcheff, P.; J. Chromatogr., A 2006, 1119, 140. 11. Billen, J.; Guillarme, D.; Rudaz, S.; Veuthey, J. L.; Ritchie, H.; Grady, B.; Desmet, G.; J. Chromatogr., A 2007, 1161, 224. 12. Novkov, L.; Solichov, D.; Solich, P.; J. Sep. Sci. 2006, 29, 2433. 13. Novkov, L.; Matysov, L.; Solich, P.; Talanta 2006, 68, 908. 14. Swartz, M. E.; J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2005, 28, 1253. 15. Nguyen, D. T. T.; Guillarme, D.; Heinisch, S.; Barrioulet, M. P.; Rocca, J. L.; Rudaz, S.; Veuthey, J. L.; J. Chromatogr., A 2007, 1167, 76. 16. Bidlingmeyer, B. A.; Hooker, R. P.; Lochmuller, C. H.; Rogers, L. B.; Sep. Sci. 1969, 4, 439.

17. Jerkovich, A. D.; Mellors, J. S.; Jorgenson, J. W.; LCGC Eur. 2003, 16, 20. 18. Wu, N.; Lippert, J. A.; Lee, M. L.; J. Chromatogr., A 2001, 911, 1. 19. Dong, M. W.; LCGC North Am. 2007, 25, 656. 20. Swartz, M. E.; LCGC North Am. Suppl. S 2005, Suppl. S, 8. 21. Dongre, V. G.; Karmuse, P. P.; Rao, P. P.; Kumar, A.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2008, 46, 236. 22. Guan, J.; Lai, C. M.; Li, S. P.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2007, 44, 996. 23. Englmann, M.; Fekete, A.; Kuttler, C.; Frommberger, M.; Li, X.; Gebefugi, I.; Fekete, J.; Kopplin, P. S.; J. Chromatogr., A 2007, 1160, 184. 24. Guillarme, D.; Nguyen, D. T. T.; Rudaz, S.; Veuthey, J. L.; Eur. J. Pharm. Biopharm. 2007, 66, 475. 25. Pedraglio, S.; Rozio, M. G.; Misiano, P.; Reali, V.; Dondio, G.; Bigogno, C.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2007, 44, 665. 26. Guillarme, D.; Nguyen, D. T. T.; Rudaz, S.; Veuthey, J. L.; Eur. J. Pharm. Biopharm. 2008, 68, 430. 27. Apollonio, L. G.; Pianca, D. J.; Whittall, I. R.; Maher, W. A.; Kyd, J. M.; J. Chromatogr., B: : Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2006, 836, 111. 28. Chervet, J. P.; Ursem, M.; Anal. Chem. 1996, 68, 1507. 29. Vissers, J. P. C.; Ru, A. H.; Ursem, M.; Chervet, J. P.; J. Chromatogr., A 1996, 746, 1. 30. Grumbach, E. S.; Wheat, T. E.; Kele, M.; Mazzeo, J. R.; LCGC Eur. Suppl. S 2005, 44. 31. Novkov, L.; Solich, P.; J. Chromatogr., A 2005, 1088, 24. 32. King, S.; Stoffolano, P. J.; Robinson, E.; Eichhold, T. E.; Hoke, S. H.; Barker, T. R.; Richardson, E. C.; Wehmeyer, K. R.; LCGC North Am. Suppl. S 2005, 36. 33. Kaufmann, A.; Butcher, P.; Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005, 19, 3694. 34. HPLC calculator v.2.0, http://www.unige.ch/sciences/pharm/fanal/lcap/ divers/downloads.php, acessada em Fevereiro 2008. 35. Hordern, B. K.; Dinsdale, R. M.; Guwy, A. J.; Talanta 2008, 74, 1299. 36. Storbeck, K. H.; Kolar, N. W.; Sander, M.; Swart, A. C.; Anal. Biochem. 2008, 372, 11. 37. Hordern, B. K., Dinsdale, R. M.; Guwy, A. J.; J. Chromatogr., A 2007, 1161, 132. 38. Chen, L.; Qin, F.; Ma, Y.; Li, F.; J. Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2007, 855, 255. 39. Farr, M.; Kuster, M.; Brix, R.; Ruibio, F.; Alda, M. J. L.; Barcel, D.; J. Chromatogr., A 2007, 1160 166. 40. Hsieh, Y.; Duncan, C. J. G.; Lee, S.; Liu, M.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2007, 44, 492. 41. Li, R.; Dong, L.; Huang, J.; Anal. Chim. Acta 2007, 546, 167. 42. Leandro, C. C.; Hancock, P.; Fussell, R. J.; Keely, B. J.; J. Chromatogr., A 2006, 1103, 94. 43. Leandro, C. C.; Hancock, P.; Fussell, R. J.; Keely, B. J.; J. Chromatogr., A 2007, 1144, 161. 44. Bendahl, L.; Hansen, S. H; Gammelgaard, B.; Sturup, S.; Nielsen, C.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2007, 44, 648. 45. Fux, E.; McMillan, D.; Bire, R.; Hess, P.; J. Chromatogr., A 2007, 1157, 273. 46. Wang, J.; Pang, X.; Ge, F.; Ma, Z.; Toxicon 2007, 49, 1120. 47. Kaufmann, A.; Butcher, P.; Maden, K.; Widmer, M.; Anal. Chim. Acta 2007, 586, 13. 48. Wang, X.; Zhao, T.; Gao, X.; Dan, M.; Zhou, M.; Jia, W.; Anal. Chim. Acta 2007, 594, 265. 49. Yang, F. Q.; Guan, J.; Li, S.;P.; Talanta 2007, 73, 269. 50. Lenz, E. M.; Williams, R. E.; Sidaway, J.; Smith, B. W.; Plumb, R. S.; Johnson, K. A.; Shockcor, J.; Stumpf, C. L.; Granger, J. H.; Wilson, I. D.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2007, 44, 845.