DETERMINACION DE COLIBACTERIAS Debido a que un gran nmero de enfermedades son transmitidas por va fecal-oral utilizando como vehculo los

alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcione como indicador de contaminacin fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patgenos intestinales y debe de ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente. El grupo coliforme es casi exclusivo de la materia fecal, pero tambin pueden multiplicarse fuera del intestino. Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no slo sobreviven, sino que se multiplican. En productos alimenticios que han recibido un tratamiento trmico se utilizan como indicadores de malas prcticas sanitarias. La demostracin y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo lquidos y slidos con caractersticas selectivas y diferenciales.

Escherichia coli: Es un bacilo que existe como comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli patgenas que provocan enfermedades diarreicas. Escherichia coli enterotoxignica ETEC: Es reconocida como el agente causal de la diarrea del viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Escherichia coli enteropatgena ECEP: Es causa importante de diarrea en los lactantes. La ECEP se adhiere a las clulas de la mucosa del intestino delgado. La infeccin por ECEP provoca diarrea acuosa. Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua contaminada y productos crnicos. Escherichia coli enteroinvasiva EIEC: Este microorganismo se encuentra estrechamente relacionado con el gneroShigella, produce una enfermedad similar a la shigelosis. Escherichia coli enterohemorrgica EHEC: Tiene su efecto citotxico sobre las clulas Vero. Se ha asociado con colitis hemorrgica y con el sndrome urmico hemoltico. La

causa ms comn de esta infeccin es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada. La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a 35C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinacin consta de dos fases: 1. La fase presuntiva: es en la que el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. 2. La fase confirmativa: en sta se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES Para anlisis de alimentos 1 matraz de 250 mL con 90.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solucin amortiguadora de fosfatosa

2 tubos de 16 x 150 mm con 9.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solucin amortiguadora de fosfatosa 15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio concentracin sencilla o caldo lactosado concentracin sencilla con campana de Durhama 15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de Durhamb. 15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC o EC-MUG con campana de Durhamb.

2 cajas Petri con agar para mtodos estndard 2 cajas Petri con agar Mac Conkeyc

6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe 3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIMe 3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de citrato de Simmons, o caldo citrato de Kosere. SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES Frascos gotero con reactivo de Erlich o Kovace Frascos gotero con indicador rojo de metiloe Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1e Frascos gotero con solucin de hidrxido de potasio al 40 % VP2e

Colorantes para tincin de gram MATERIAL Y EQUIPO Mechero

Propipeta

Gradilla

Balanza granataria

Stomacher Bolsas para stomacher Lmpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm) Lentes de seguridad Pipetas de 10.0 mL estriles con tapn de algodn Pipetas de 1.0 mL estriles con tapn de algodn Pipetas Pasteur estriles Asa bacteriolgica Portaobjetos Microscopio ptico

Termmetro calibrado Bao de agua a 44.5 0,1C Incubadora a 35 2,0 Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180C Autoclave PROCEDIMIENTO Preparacin de la muestra. 1. Moler 10.0 gramos de la muestra en un picador 2 veces o con cubiertos estriles y mezclar. 2. Adicionar el alimento a 90.0 mL de agua peptonada al 0.1 %, licuar y dejar en reposo de 2-3 minutos. 3. Realizar diluciones hasta 10- 3 g/mL con agua peptonada al 0.1 %. En caso de trabajar con muestras congeladas, descongelarlas previamente entre 2 y 5 C. Prueba presuntiva. 1. Aadir 1.0 mL de la dilucin 10- 1 g/mL a cada uno de 3 tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio. 2. Aadir 1.0 mL de las diluciones 10- 2 g/mL y 10- 3 g/mL a dos series de 3 tubos cada una con caldo lauril sulfato de sodio. 3. Incubar a 35-37C durante 24-48 h. 4. Los tubos despus de la incubacin, se registrarn como positivos si presentan crecimiento y produccin de gas. Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales 1. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva a otro tubo de 16 x 150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de Durham. 2. Agitar los tubos para su homogeneizacin. 3. Incubar a 35 2C durante 24 a 48 h. 4. Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe crecimiento y produccin de gas, despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h. 5. Consultar las tablas de NMP que se encuentran en el anexo para conocer el nmero ms probable de organismos coliformes totales por mL. Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.

1. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC conteniendo campana de Durham. 2. Agitar los tubos para su homogeneizacin. 3. Incubar a 44.5 0.1C en incubadora o un bao de agua durante 24 a 48 h. 4. Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe turbidez y produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h. 5. Consultar la tabla de NMP (ANEXO) para conocer el nmero ms probable de organismos coliformes fecales por mL. *Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de Enterobacter aerogenescomo control negativo e incubar con las muestras. Prueba confirmatoria de Escherichia coli. 1. Confirmar la presencia de Escherichia coli en por lo menos el 10% de las pruebas con resultados positivos de coliformes fecales; sembrar en placas de agar McConkey a partir de los tubos que demostraron la presencia de gas en la prueba confirmativa. 2. Incubar las placas a 35 0.5C durante 24 2 h., observar las colonias tpicas fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitacin de sales biliares. 3. Hacer tincin de Gram para observacin de la morfologa de las bacterias. 4. Seleccionar 1 o ms colonias aisladas para realizar pruebas IMViC. *Todos los cultivos que: 5. Fermenten la lactosa con produccin de gas dentro de las 48 h. a 35C. 6. Sean bacilos o cocobacilos Gram-negativos no esporulados 7. Se obtenga las siguientes combinaciones para el IMVIC: Biotipo 1(++--) o Biotipo 2 (-+-) son consideradas como Escherichia coli. 8. Calcular el NMP de E. coli basndose en la proporcin de los tubos positivos de caldo EC. *Otro mtodo rpido para la identificacin de Escherichia Coli es: Uso de Las APIS: Para conocer si E. Coli se encuentra en el medio se recomienda realizar la prueba del sistema en tiras (API) estaspruebas se comercializan en Kits (R. Granados, C. Villaverde 2002); los medios deshidratados se encuentran contenidos en microtubos mediante una suspensin bacteriana y luego se cultivan Mas tarde se incuban y en este proceso de metabolismo del microorganismo genera cambios en el medio de cultivo que se aprecia con uncambio de color de este o al aadir reactivos (Madigan M. t. et al 1999). Estos cambios se interpretan mediante tablas de lectura o mediante ordenadores. Despus de la utilizacin de este mtodo el kit debe destruirse o incinerarse. CONCLUSIN La presencia de colibacterias en alimentos es signo de que no se estn ejecutando medidas higinicas en algn proceso de elaboracin de ellos, lo cual causa enfermedades severas en la poblacin. Algunas recomendaciones para evitar estas

enfermedades son usar equipos limpios, realizar buenas prcticas de higiene as como
una buena coccin de los alimentos, ya que por ser una enterobacteria a altas temperaturas se elimina.

BIBLIOGRAFIA: http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Colif-totfecales-Ecoli-NMP_6529.pdf http://www.monografias.com/trabajos89/deteccion-escherichia-coliusando-metodos-rapidos/deteccion-escherichia-coli-usando-metodosrapidos.shtml