Universidad Santo Tomas REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

PCR para el gen beta globina de ADN genmico. Luis Colihuinca Llancapan Resumen

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La reaccin en cadena de la polimerasa ms comnmente conocida como PCR (Polymerase Chain Reaction) es una de las tcnicas de biologa molecular ms ampliamente utilizada en varios campos de las ciencias, tanto en investigacin y desarrollo como en diagnstico. En este informe se realizo una PCR para el gen de la beta globina, que codifica para la cadena beta de la hemoglobina.
Palabras claves: PCR, gen beta globina, Taq DNA polimerasa, Oligonucletidos cebadores, Amplicones.

Introduccin
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) fue creada por Kary B. Mullis en 1983. En sus 25 aos de evolucin ha contribuido de manera significativa en los procesos investigativos bsicos y de diagnstico en gran cantidad de patologas. . La reaccin de PCR consta por lo regular, de unos 30 ciclos repetidos conformados cada uno de tres pasos: el primero denaturacin consiste en la ruptura de los puentes de hidrgenos del DNA para desnaturalizarlo, para lo cual se incuba a una temperatura de alrededor de 95C, por 1 minuto. Este paso expone las bases nitrogenadas del ADN blanco. En un segundo ocurre la hibridacin o anneling de las cadenas desnaturalizadas del DNA blanco con los denominados cebadores o iniciadores, a una temperatura que facilita el apareamiento de las bases nitrogenadas complementaria a ambas clases de ADNs. Esta temperatura depende de la temperatura de fusin (Tm) de los iniciadores, la cual puede
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ser calculada, pero generalmente oscila entre 50 y 60C. El tercer paso se efecta a 72C, temperatura a la cual la polimerasa extiende la longitud de los cebadores, aadiendo los diferentes nucletidos que estn libres en el orden correcto de apareamiento segn la secuencia de nucletidos de la hebra de ADN molde. Para llevar a cabo el procedimiento de una PCR es necesario mezclar en un tubo el ADN que contiene la secuencia que se va a amplificar, los cebadores que se alinearan a la cadena simple del DNA, la mezcla de los desoxirribonucleosidos trifosfatos (dNTPs) en cantidades suficiente. El tampn de reaccin para la ADN polimerasa, agua ultra pura para completar el volumen final de reaccin y finalmente el ingrediente crucial para la reaccin, la enzima ADN polimerasa termoestable. En este laboratorio se amplificara por PCR el gen de la beta globina. El componente proteico de la hemoglobina est formado por 4 subunidades, 2 cadenas alfa y 2 cadenas
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beta del tipo de las globinas, el gen para la beta globina est localizado sobre el cromosoma 11, p 15.5 y tiene 475 variantes alelicos, Este es un miembro de la familia de los genes de la globina, que es un grupo involucrado en el transporte del oxigeno. Otros miembros de la familia de este gen incluyen a alfa, gamma, delta y epsilon y zeta genes de globina. Estos genes son regulares y se presentan en un tiempo especfico durante el desarrollo de la vida del ser humano

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Materiales y procedimientos
Muestra: Se utiliz muestras de ADN genmico (fig. 1) - Micropipetas de 0,1-20ul, de 20-200ul y 200-1000ul. - Puntas de micropipetas estriles con filtros. - Tubos eppendorf libres de DNA/RNAasas. -Cmara de electroforesis horizontal. -Peines para las bandejas. -Bandeja para la preparacin del gel. -Fuente de poder. -1 matraz de Erlenmeyer de 100ml estril. -Guantes de ltex sin talcos. -Guantes para calor. Reactivos. - Primer F beta globina - Primer R beta globina -Taq polimerasa -dNTPs -MgCl -Agarosa grado molecular -TAE 1X -Red gel - buffer de carga - buffer de reaccin enzimtica. -Agua Destilada libre de DNA/RNAsas.

Figura 1. Equipo y materiales para llevar a cabo una PCR.

Procedimiento 1- se realizo el clculo de los

volmenes que se necesitan a partir de las soluciones stock.

Reactivo H2O libre de DNA/RNAasa MgCl dNTPs Primer F Beta globina Primer R Beta globina ADN molde Taq polimerasa Buffer de Rx Vol. Final

Concentracin

Volumen 33,5ul

50mM 10uM 10Um

1ul 4ul 2ul 2ul 2ul 0,5ul 5ul 50ul

5 U/ul

2.-En un tubo eppendorf libre de DNA/RNAasas de 0.2 ml agregar los componentes del mix de PCR, cuidando de no formar burbujas. NOTA: La Taq polimerasa se agrego al final justo antes de colocar el eppendorf en el termociclador. 3.-Se coloco el tubo en el termociclador, se cerr la tapa, se eligi el programa y se dio comienzo a la PCR.

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4.-Aproximadamente 30 minutos antes de que la corrida de PCR terminara, se preparo el gel para la electroforesis.

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8. Se aadi la agarosa suavemente y con mucho cuidado al molde y se espero a que solidificar. Preparacin de muestras de ADN para cargar al gel. En un trozo de parafilm se coloco 1 gotas de 5ul de buffer de carga. Se tomo con una punta nueva 10ul de la muestras de ADN amplificado y se deposito sobre la gota de buffer de carga. Se mezclo con la misma punta y se depositaron 10ul en el gel de agarosa. Se repiti lo mismo con las otras muestras de PCR amplificado. Tapar conectar la cmara a la fuente de poder.
Figura 3. Cmara de electroforesis con las muestras corriendo.

Figura 2. Termociclador para PCR.

Preparacin gel de agarosa al 2% 1. Se realizo un gel de agarosa a una concentracin de 2%. Para la cmara de electroforesis pequea pesar 0.4 gr. de agarosa para 20 ml de buffer de corrida. 2. Poner los 20 ml de buffer de corrida en un matraz y agregar los 0.2 gr de agarosa. 3. Disolver la agarosa por agitacin suave y posterior incubacin a 100C en microondas por unos segundos. 4. Se sac el matraz del microondas con mucho cuidado y se agito suavemente. La agarosa debe estar totalmente disuelta y verse una solucin transparente, de no ser as se debe volver a incubar unos segundos ms. (Paso peligroso, mxima precaucin) 5. Se deja enfriar la agarosa hasta aproximadamente 50 C y se agrega 2 l de Red Gel concentrado 10.000X. 6. Se mezcl hasta que estuvo bien homogenizado. 7. Mientras se enfra la agarosa, se prepar el molde para verter la solucin. Se sellan con masking tape los extremos abiertos del molde y se coloca el peine.

1. Se tap la cmara con cuidado y se conecto los cables (rojo con rojo y negro con negro). El electrodo negro debe ir al lado donde se cargan las muestras. 2. los cables se conectaron a la fuente de poder con sta APAGADA. 3. Se ajusta la fuente de poder a 80 volts. 4. Luego se encendi la fuente de poder

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Visualizacin del gel de agarosa 1. Se coloc el gel en el transiluminador y se observ las bandas que se ven por la excitacin de la sonda intercalante Red Gel. 2. Finalmente se fotografi el gel. Resultados Los resultados obtenidos al final del laboratorio, se pudo visualizar y fotografiar el gel y se pudo observar de la siguiente manera en la cmara del transilumonador.

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Finalmente se observa una tercera banda que correspondera a los dmeros de primer. En cierta medida las bandas no estn lo suficientemente marcadas, lo cual podra deberse a que la amplificacin de la PCR se realizo en 25 ciclos y no en 30 ciclos como esta estandarizado, para esta metdica. Por lo tanto para obtener una mejor PCR se debera haber realizado los 30 ciclos, y as obtener un mejor producto de PCR. Por otra parte, la preparacin del gel para la electroforesis podra haber influido en los resultados, ya que el gel se preparo con un 2% de agarosa y no en 3% como estaba estandarizado y sealado. La menor concentracin de la agarosa, permite una mayor migracin de las muestras segn el tamao. En algunos casos no se observaron bandas durante la electroforesis, esto podra haber sido generado producto a que el DNA, se encontraba degradado o que durante el proceso de trabajo se halla contaminado con DNAsas y que estas ltimas interfirieron degradando el DNA. Por lo tanto, la DNA Taq polimerasa no pudo encontrar los sitios adecuados para poder posicionarse y realizar las copias necesarias para amplificar al DNA molde o que hubieron inhibidores de la PCR. Se puede obtener un mejor resultados en PCR considerando todos los posibles interferentes que ya se mencionaron, tratando de evitarlos y as obtener una PCR de rendimiento optima la prxima ves que se trabaje con este tipo de metodologas.

Figura 4. Electroforesis de agarosa. Discusin En la electroforesis se pueden apreciar en algunos casos tres bandas, la primera corresponde a bandas inespecficas que se formaron puede ser producto de un amento en la concentracin de magnesio. La segunda banda que se observa en la electroforesis corresponde a la banda de la beta globina, la que nosotros pretendimos obtener.
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Referencia bibliogrfica. Gladys Pinilla B. Bodas de plata de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Universidad Nacional Posgrado de Microbiologa. Recibido 27-04-08 / Aceptado 19-05-08. Iram Pablo Rodrguez. La reaccin en cadena de la polimerasa a dos dcadas de su invencin. Universidad Autnoma Nuevo Len, MonterreyMxico. Ciencia UANL, julioseptiembre, ao 2004/volumen VII, numero 003. Pgina web: http://redalyc.uaemex.mx/pdf/402/4027 0307.pdf

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