CURSO DE BIOQUMICA APLICADA

GENERALIDADES DE MTODOS ENZIMTICOS

Escuela de Tecnologa Mdica Universidad de Chile Primera Versin 2007

Propiedades de Enzimas en Solucin Acuosa

Conocer las caractersticas de los enzimas como reactivos analticos y la cintica de las reacciones enzimticas. Tener una visin general de los diferentes mtodos enzimticos de anlisis que utilizan enzimas en disolucin. Reconocer los problemas que se pueden resolver mediante mtodos enzimticos e Interpretar los resultados obtenidos en los mismos.

Uso de los ENZIMAS en diagnstico clnico: 1. Unidades enzimticas: Ul (SI). 2. Muestras biolgicas. 3. Importancia clnica. Alteracin de la actividad enzimtica asociada a un proceso patolgico: sangre Dao tisular: Necrosis del tejido. Incremento de la permeabilidad. Induccin enzimtica. sangre: deficiencia del tejido

CPK creatina Quinasa LDH Lactato deshidrogenasa HBDH - -hidroxibutrico deshidrogenasa

Enzima

Sustrato

ENZIMA

Catalizador de origen biolgico y naturaleza proteica, de alto peso molecular y conformacin tridimensional caracterstica.
Estructura y conformacin: Contiene un centro activo, generalmente situado en un entorno apolar. La actividad cataltica requiere que dicho centro adopte una conformacin determinada, mantenida por el resto de la molcula proteica.

Reactividad: Interaccin de complementariedad LLAVE- CERRADURA. La actividad cataltica requiere en general la presencia de cofactores para llevar a cabo la conversin del sustrato.

Protena no activa

Iones metlicos y/o molculas

APOENZIMA

Cofactores

FMN Complejo catalticamente activo Glucosa oxidasa

Sustancia orgnica, no proteica fuertemente enlazada (GRUPO PROSTTICO) Dbilmente enlazados (no estequiomtricos) Productos Sustrato (COENZIMA) (estequiomtrico)

Fosfato de tiamina descarboxilasas

HOLOENZIMA

NAD+, deshidrogenasa

Sustrato

Caractersticas de las enzimas

Elevada especificidad Respecto del sustrato convertido Respecto de la reaccin catalizada Elevada eficacia cataltica Actividad a bajas concentraciones de enzima y de sustrato Actividad in vitro
Reactivos Analticos

O H+ HO C O O C O + O H

Anhidrasa Carbnica knon = 0.14 s-1

t1/2 = 5 segundos

kcat = 106 s-1

t1/2 = 700 nanosegundos

kcat /knon = 7.1 x 106

Reaccin

Catalizador

Temperatura (C)

Energa Activacin (Kcal/mol)

Descomposicin de H2O2

Ninguno Fe2+ Catalasa

20 22 22

18 10 1,7

Clasificacin de las Enzimas

www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/enzymes (E.C. w.x.y.z) E.C.1.-.-.- xido-reductasas Reacciones redox E.C.2.-.-.- Transferasas Nombre sistemtico
Transferencia de grupos Donor-aceptor funcionales oxidoreductasa Reacciones de hidrlisis Grupo transferasa Adiciones a dobles enlaces 1.1. >CH-OH 1.2. >C=O 1.3. >C=CH2.1. Grupos de un tomo de C 1.4. >CH-NH2 2.2. Grupos carbonilo 1.5. >CH-NH2.3. Grupos acilo 1.6. NADH, NADPH 2.4. Grupos glucosilo 3.1. Esteres 2.6. Grupos con N 3.2. Enlaces glucosidicos 2.7. Grupos con fosfato 3.4. Enlaces peptdicos 2.8. Grupos con S 4.1. >C=C< 3.5. Otros enlaces C-N 4.2. >C=O 3.6. Anhdridos de cidos 4.3. >C=N5.1. Racemasas 5.2. Cis-trans isomerasas 6.1. 6.2. 6.3. 6.4. C-O C-S C-N C-C

Nombre sistemtico E.C.3.-.-.- Hidrolasas

Donor-aceptor

E.C.4.-.-.- Liasas

E.C.5.-.-.- Isomerasas
Isomerizaciones

E.C.6.-.-.- Ligasas

Formacin de enlaces con ruptura de un Pirofosfato en el ATP

Unidades de Concentracin de Enzima: Actividad Enzimtica

Unidad internacional (I.U.): Cantidad de enzima que cataliza la formacin de un mol de producto por minuto en las condiciones (pH, T) especificadas. Katal (Kat): Cantidad de enzima que cataliza la transformacin de 1 mol de sustrato por segundo en unas condiciones definidas.

1 I.U. = 16,67 nkat; 1 kat = 60 I.U.

Actividad especfica de un preparado: Unidades/mg protena Concentracin de enzima en disolucin: mU o U por L o mL Actividad Molecular= Nmero de cambio (turnover) kcat [s-1] Nmero de moles de sustrato transformados por minuto por mol de centro activo bajo condiciones ptimas

Es una medida basada en datos experimentales Todas las condiciones que pueden afectar la actividad Enzimtica deben ser estipuladas 1.0 IU = La cantidad de enzima capaz de convertir 1.0 mol de sustrato en producto en 1 minuto dado que la [sustrato] inicial >> [enzima] bajo condiciones de ensayo definidas 1.0 katal = La cantidad de enzima capaz de convertir S.I 1.0 mol de sustrato en producto en 1 segundo dado que la [sustrato] inicial >> [enzima] bajo condiciones de ensayo definidas

Cada una de estas enzimas incrementa la velocidad de reaccin pero con diferente actividad

enzima D [Producto] enzima A

Enzima Q Espontneo 0 Adicin Tiempo --->

Qu caractersticas de las enzimas debo conocer antes de poner a punto un Mtodo enzimtico de anlisis?

Caractersticas cinticas de las reacciones enzimticas. Km y vmax, su significado. Factores que afectan a la velocidad de las reacciones enzimticas y por tanto a la actividad enzimtica.

Caractersticas Cinticas de las Reacciones Enzimticas.

Reacciones Monosustrato
v

E+S

k1 k2

ES

k3

E+P

[S]

Enzima (invertasa)

Sustrato (sacarosa)

Centro activo fructosa Enzima disponible Los productos se liberan Complejo enzima-sustrato

glucosa

El sustrato se transforma en productos

El sustrato se enlaza al enzima

Caractersticas Cinticas de las Reacciones Enzimticas.

Reacciones Monosustrato
v vmax

vmax 2

Orden 0 Orden 1

E+S

k1 k2

ES

k3

E+P

Ecuacin de Michaelis-Menten [S]

KM = k2 + k3 k1
v max = k 3 [E ] t

KM

v max [S] v= K M + [S]

Orden 1 [S] << KM
v= vmax [S] KM

Orden 0 [S] >> KM

v = v max

Cintica Enzimtica

Entonces......
Km Pequea [sustrato] se necesita para conseguir la mitad de la Vmxima Afinidad de la enzima por el sustrato Gran [sustrato] se necesita para alcanzar la mitad de la Vmxima

Km

Afinidad de la enzima por el sustrato

Cintica Enzimtica Importancia de conocer las Kms

Hexoquinasa Presente en todas las clulas Km=30M(>0,1mM) Saturada Glucoquinasa Presente slo en hgado Km=10mM
Capaz de metabolizar glucosa prandial

[glucosa] en vena portaheptica del orden de mM

Vmx y Km

Vmax depende de la cantidad de enzima.

Influencia de la concentracin de sustrato sobre la actividad enzimtica

primer orden Proporcional a la concentracin de sustrato orden cero Independiente de la concentracin de sustrato

Velocidad de reaccin

[S]

Caractersticas Cinticas de las Reacciones Enzimticas

Determinacin Experimental de los Parmetros de Michaelis-Menten
Para desarrollar un nuevo ensayo enzimtico o adaptar uno ya descrito es importante conocer los valores de Km y vmax de la enzima utilizada.

Representacin de Lineweaver-Burk

1/v

= KM/vmax

1 KM 1 1 = + v v max [S] v max

1 / vmax -1/ KM
1/[S]

Caractersticas Cinticas de las Reacciones Enzimticas. Determinacin Experimental de los Parmetros de Michaelis-Menten

Representacin de Hanes

[S]/v

= 1/vmax

[S] 1 KM [S] + = v v max v max

-KM KM / vmax
[S]

vmax tg = -KM
v/[S]

Representacin de Eadie-Hofstee

v v = K M + v max [S]

Factores que afectan a la velocidad de las reacciones enzimticas

Adems para desarrollar un ensayo enzimtico deben controlarse Todas aquellas variables experimentales que puedan afectar a la velocidad de la reaccin enzimtica.

Concentraciones de: Sustrato Enzima (Actividad enzimtica) Activadores Inhibidores Temperatura pH Fuerza inica, naturaleza de los iones presentes en el medio, etc.

Factores que afectan a la actividad enzimtica Presencia de Activadores (A)

Sustancias que producen un aumento de la velocidad de la reaccin enzimtica sin resultar alterados en ella.

1. Interaccin con la enzima E+A EA EA + S EAS EA + P

2. Interaccin con el sustrato S+A SA SA + E ESA E + PA Mg2+ para A + P las PA

(fosfato) kinasas

Cationes metlicos, principalmente de elementos de nmero atmico comprendido entre 19 y 30 Aniones inorgnicos, de efecto inespecfico Compuestos orgnicos (cisteina, -mercaptoetanol)
Cl-

Verdadero sustrato de la enzima

Factores que afectan a la actividad enzimtica Presencia de Inhibidores

Sustancias que producen una disminucin de la velocidad de la reaccin enzimtica.

Inhibidores irreversibles
La inhibicin aumenta con la [I] y puede llegar a ser total Unin enzima-inhibidor covalente La inhibicin no revierte al retirar el inhibidor de la mezcla de reaccin La velocidad de reaccin disminuye linealmente con [I] a bajas [I]

Inhibidores reversibles
La enzima recobra su actividad cuando se elimina al inhibidor del medio Unin enzima-inhibidor y/o complejo ES-inhibidor no covalente La inhibicin puede ser revertida por dilisis o simple dilucin La inhibicin es altamente especfica

Factores que afectan a la actividad enzimtica: Temperatura

Efecto final Cada enzima posee una temperatura ptima
Reaccin no enzimtica
T ptima para enzimas humanas

50

v (u.a.)

Ejemplos

Fraccin de enzima activa

25
Velocidad de reaccin

T ptima para Tptimaenzimas 1,0 termoflicas

Enzima activa
0,5

Reaccin enzimtica
10 20 30 Temperatura (C) 40

T (C)

0,0

Factores que afectan a la actividad enzimtica: pH

pH ptimo para la pepsina pH ptimo para la tripsina

pH y medio inico afectan a la conformacin tridimensional de la protena La actividad de la enzima depende de la extensin de la reaccin de disociacin de ciertos aminocidos en la estructura proteica. Si el sustrato tiene propiedades cido-base es probable que la enzima slo pueda catalizar la transformacin de su forma disociada o de su forma no disociada.

Velocidad de reaccin

Mtodos de equilibrio o de cambio total

Mtodos cinticos

sustrato La reaccin enzimtica transcurre Se mide la velocidad de la hasta alcanzar el equilibrio. reaccin enzimtica Se mide algn cambio fsico Final Mtodos de Punto o qumico producido en el mediofavorable Con equilibrio de reaccin medida de Producto medida de Sustrato Basados en cintica Sustrato medida de Cofactor de orden uno sustrato Mtodos con reacciones Enzima Basados en cintica acopladas Activadores de orden cero Con reaccin indicadora Inhibidores subsiguiente

Mtodos Enzimticos de Equilibrio de PUNTO FINAL

Analito: S

P
Especie medida Producto Cofactor Sustrato
Peroxidasa

A. Con equilibrio favorable

1. Medida del Producto H2O2 + DH2

POD

2 H2O + D
( = 440 nm )

2. Medida del Cofactor

NADH, m= 340 nm Espectrofotomtrica

Ox

SH2 +

NAD+

NADH + H+ + S
Red

Fluorimtrica Amperomtrica

S + NADH +

H+

NAD+ + SH2

Mtodos Enzimticos de Equilibrio de Punto Final

2. Medida del Cofactor
O C NH2

O C NH2

A
0,4

+ N O O P OH O OH P O O
-

N R

O H OH N NH2 N N

(forma reducida) Nicotinamida adenina dinucletido (NAD+) o su forma fosforilada (NADP+)

NADH

0,2

N O H H OH(PO32-)

NAD+ m= 259 nm
200 250

NADH m= 340 nm

0,0

300

350

/nm

OH

Aldehdo deshidrogenasa

Acetaldehido +

NAD+

AlDH Nitrato reductasa

cido actico + NADH + H+ NO2- + NAD+ + H2O

NO3- + NADH + H+

Mtodos Enzimticos de Equilibrio de UN SOLO PASO Analito: S

P
Especie medida Producto Cofactor Sustrato
Peroxidasa

A. Con equilibrio favorable

1. Medida del Producto H2O2 + DH2

POD

2 H2O + D
( = 440 nm )

2. Medida del Cofactor 3. Medida del Sustrato

NADH, = 340 nm

El mtodo enzimtico aporta selectividad a la medida

3. Medida del Sustrato

O HN O H N O N H N H

Ejemplo: Determinacin de cido rico

O H N O O N H N H

+ O2 + H2O

NH2

+ CO2 + H2O2

cido rico ( = 292 nm)

Alantoina Inyeccin de enzima

A292
90 M
1,0

1,1 50 M
0,5

30 M

0,61 0,37

0,0

t/min

Si no se pueden medir fcilmente los sustratos o productos de la reaccin enzimtica en la que se transforma el analito debe optarse por un esquema de reacciones acopladas Reaccin auxiliar (Eaux): Reaccin en la que se transforma la sustancia a determinar Reaccin indicadora (Eind): Reaccin utilizada para realizar la medida = Analito, compuesto a determinar = Especies medibles A. Mtodos con reaccin indicadora subsiguiente
Eaux. Eind.

S1 + S2 P1 + S3

P1 + P2 P3 + P4

A. Sistema de reacciones acopladas con reaccin indicadora subsiguiente Determinacin de glucosa, sistema HK-G6PDH
HK (Hexoquinasa); G6PDH (Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa)

Glucosa + ATP Glucosa-6-P + NADP+

HK

Reaccin Auxiliar

Glucosa-6-P + ADP

G-6PDH

6-fosfogluconato + NADPH + H+ A340

2
0,5

Reaccin indicadora
1. Incubacin de la mezcla de ensayo con G-6PDH en ausencia de HK 2. Adicin de HK y reduccin de NADP+ 3. A [Glucosa]

HK
1
0,0 2 4 6 8

10

t/min

Reaccin auxiliar: Reaccin en la que se transforma la sustancia a determinar Reaccin indicadora: Reaccin utilizada para realizar la medida

Mtodos Enzimticos Cinticos A. Basados en reacciones de orden cero

Determinacin de enzimas, activadores e inhibidores

Condiciones: Concentraciones saturantes de de sustrato y coenzimas (v = vmax)

v = k 3 [E ]

Mtodos Enzimticos Cinticos B. Basados en reacciones de orden uno

Determinacin de sustratos

v v = max [S] K M
A

Ley lmite de orden 1 de la ecuacin de Michaelis-Menten [S] < 0,05 KM

Pendiente inicial

Comienzo de la reaccin t t1 t2

A = A2 - A1

tiempo

Aplicaciones Analticas
A. Anlisis Clnico Determinacin de metabolitos Glucosa, colesterol, triglicridos, cido rico.... B. Industria Alimentaria Determinacin de actividades enzimticas GOT, para distinguir carne fresca de congelada C. Otros campos marcadores hepticos: Transaminasas, fosfatasa Determinacin de etanol, lactato, glicerol Control de calidad en la industria farmacutica alcalina. Marcadores cardiacos: LDH, HBDH... carbohidratos en alimentos y de cosmticos Qumica Agrcola Botnica Microbiologa