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Microbiologia / Microbiologia Ambiental

LEGA / MIEA Olga Nunes 2007

Crescimento populacional microbiano


Mtodos de enumerao / quanticao
Contagem do n total de clulas Contagem de clulas viveis Determinao da biomassa Turbidimetria

Olga Nunes

CRESCIMENTO MICROBIANO POPULACIONAL (ASSEXUADO)

Crescimento Populacional
Aumento do nmero de clulas da populao ao longo do tempo;

Como podemos medir o crescimento de uma populao microbiana?


Qualquer constituinte da biomassa pode ser utilizado para quanticar o crescimento e determinar a taxa de crescimento:

Clulas

Biomassa

Protenas
Olga Nunes

Crescimento Populacional 1. Contagem do n de clulas


1.1 Contagem directa ao microscpio

1 Uma diluio da cultura introduzida numa cmara de contagem:


(Lmina de vidro com quadrculos de rea e profundidade conhecidos)

2 Contam-se as clulas ao microscpio

3 Calcula-se o n de clulas por mililitro da amostra inicial.


Olga Nunes

Crescimento Populacional 1. Contagem do n de clulas


1.1 Contagem directa ao microscpio

Desvantagens:
No distingue clulas mortas de clulas vivas; Clulas pequenas so pouco visveis Baixa preciso;

Suspenses com < 106 clulas /ml no so quanticveis;

Olga Nunes

Crescimento Populacional 1. Contagem do n de clulas


1.2 Contagem com citmetro de uxo, ou contador Coulter
1 Um volume conhecido de amostra da cultura passa entre dois elctrodos; 2 Cada clula faz diminuir a condutividade elctrica entre os elctrodos; 3 Regista-se a variao da condutividade de cada clula;
+

Desvantagens: No distingue clulas mortas de clulas vivas;


Olga Nunes

Crescimento Populacional 1. Contagem do n de clulas


1.3 Contagem do no total de clulas com corantes uorescentes
1 Uma amostra da cultura filtrada e incubada com corantes fluorescentes 2 Contam-se as clulas ao microscpio de fluorescncia / confocal 3 Calcula-se o n de clulas por mililitro da amostra inicial.

Crescimento Populacional 1. Contagem do n de clulas


1.3 Contagem do no total de clulas com corantes uorescentes que intercalam o DNA

Estafilococos (acridina laranja)

Escherichia coli (DAPI)

Desvantagens: No distingue clulas mortas de clulas vivas;

Crescimento Populacional 1. Contagem do n de clulas


1.3 Contagem do no total de clulas com mistura de corantes uorescentes
Kit Live/dead (Bac light) :

Corantes de DNA: SYTO 9 - verde - entra livremente nas clulas Iodeto de propdio - vermelho - s penetra nas clulas com membrana danificada

Vantagens: Distingue clulas viveis de clulas no viveis;

Crescimento Populacional 1. Contagem do n de clulas


1.4 Fluorescent in situ hibridization (FISH)
1. Utilizam-se sondas de DNA que: hibridam especificamente com um gene que esto ligadas a um fluorocromo 2. Quando a sonda adicionada a uma amostra com diferentes tipos de clulas, apenas as clulas que possuem aquele gene ficam coradas com o fluorocromo. 3. A uma mesma amostra podem ser adicionadas vrias sondas, com fluorocromos diferentes. Vantagens: Distingue diferentes tipos de clulas cultura mista

1.4 Fluorescent in situ hibridization (FISH)

Amostra: lamas activadas M. Confocal M. ptico Sondas:


1. Bactrias que oxidam amnia (vermelho) (NH3 (NO2NO2-) NO3-) 2. Bactrias que oxidam nitrito (verde)

Crescimento Populacional

2. Contagem de clulas viveis


Uma clula vivel aquela que ainda tem capacidade para se dividir e originar novas clulas, formando uma colnia em meio slido;

Assim, podemos observar vista desarmada a colnia originada pela clula vivel, designada por unidade formadora de colnia (U.F.C.)

Olga Nunes

Crescimento Populacional 2. Contagem de clulas viveis


2.1 Espalhamento em placa
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

9 ml meio de cultura Cultura 0,1 ml Incubao


Olga Nunes

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

U.F.C.

Crescimento Populacional
2.1 Espalhamento em placa
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

APS PERODO DE INCUBAO N DE U.F.C. DEMASIADO ELEVADO PARA CONTAR

171

16

N U.F.C. / ml CULTURA = 171 X 104


Olga Nunes

Crescimento Populacional 2. Contagem de clulas viveis


2.2 Incorporao em agar
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

9 ml meio de cultura Cultura


10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

1 ml

Meio agarizado lquido

U.F.C.

Incubao
Olga Nunes

Crescimento Populacional
2.2 Incorporao em agar
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

APS PERODO DE INCUBAO N DE U.F.C. DEMASIADO ELEVADO PARA CONTAR

171

16

N U.F.C. / ML CULTURA = 171 X 103


Olga Nunes

Crescimento Populacional 2. Contagem de clulas viveis Nota:


OS MEIOS DE CULTURA E AS CONDIES DE INCUBAO DEVEM SER ADEQUADOS AOS ORGANISMOS A ENUMERAR

Desvantagens: No mtodo de incorporao em agar: organismos aerbios podem ter diculdade em se desenvolver; o choque trmico provocado pela adio de meio de cultura pode inibir os microrganismos;
Olga Nunes

Crescimento Populacional 3. Determinao de Biomassa


3.1 Peso hmido
Funil

1 Pesa-se uma membrana filtrante; 2 Filtra-se um volume conhecido de suspenso celular; 3 Lavam-se as clulas; 4 Pesa-se a membrana filtrante com a biomassa; 5 Calcula-se o peso da biomassa por litro de cultura;
Sistema de vcuo Membrana filtrante Suporte Vedante

Olga Nunes

Crescimento Populacional 3. Determinao de Biomassa


3.2 Peso seco
Semelhante ao mtodo 3.1, mas a membrana filtrante com a biomassa colocada numa estufa a 105C at peso constante;

Peso seco de uma clula procariota: 10-15 a 10-11 g. Peso seco de uma clula eucariota: 10-11 a 10-7 g. Peso seco : ~ 20 a 30% do peso hmido.

Olga Nunes

Crescimento Populacional 4. Turbidimetria


Prisma Amostra de cultura (selecciona ) (ou sua diluio) Clula fotoelctrica Registador

Feixes de luz atravessam a suspenso

Densidade ptica (Log l0/l)

(l0)

Feixes de luz no dispersados pelas clulas

(l)
Olga Nunes

Crescimento Populacional 4. Turbidimetria


Como cada clula dispersa a luz incidente, quanto maior o n de clulas, maior a disperso de luz;

A relao absorvncia / densidade celular aproximadamente linear (numa certa gama de concentraes celulares)

um mtodo muito utilizado pois RPIDO e NO DESTRI a amostra. Biomassa Pode construir-se uma curva que relacione a absorvncia com: N de clulas Protena
Olga Nunes

Crescimento populacional microbiano


Crescimento em descontnuo Fases de crescimento Cintica

Olga Nunes

Crescimento em descontnuo

3 - 10%
COLNIA

VASO CULTURA EM MEIO SLIDO CULTURA DE INCULO

CULTURA ONDE SE SEGUE O CRESCIMENTO (VOLUME CONSTANTE)

Olga Nunes

Curva de crescimento em descontnuo


Escala linear
2 10 ADAPTAO EXPONENCIAL

Escala semi-logartmica

Biomassa (g/l)

Biomassa (g/l)

1.5

0.1

0.5

0.01

MORTE 7 8
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Tempo (horas)

Tempo (horas)

ESTACIONRIA

Crescimento em descontnuo
1. Fase de adaptao
Perodo de tempo necessrio para as clulas sintetizarem todos os componentes necessrios para crescerem naquelas condies.

Depende: Fase crescimento do inculo; Composio do meio de cultura; Condies de incubao; Estado das clulas;

Olga Nunes

Crescimento em descontnuo
2. Fase exponencial
consequncia do facto de cada clula originar duas clulas filhas.

Depende: Caractersticas genticas do organismo; Composio do meio de cultura; Condies de incubao;

Olga Nunes

Crescimento em descontnuo
3. Fase estacionria
Num sistema fechado, o crescimento no pode continuar indefinidamente devido: falta de um nutriente essencial; acumulao de produtos txicos; Normalmente a fisiologia das clulas diferente, pois tm que se adaptar a condies adversas.

4. Fase morte
As clulas da populao morrem porque as suas reservas energticas se esgotaram;
Olga Nunes

Cintica do crescimento em descontnuo


Taxa de crescimento: variao do n de clulas por unidade de tempo
A taxa de aumento da populao no tempo (t) proporcional densidade populacional (N), nesse instante, ento:

(1)

dN/dt = N

N = nmero clulas t = tempo = taxa especca de crescimento instantneo (t-1)

Integrando entre N0, no tempo t0 e N, no tempo t, para constante:

(2) ln N = ln N0 + (t-t0)

N0 = nmero clulas inicial N = nmero clulas nal

ou
(3) = (ln N - ln N0) / (t-t0)

= taxa especca de
crescimento instantneo (t-1)

Olga Nunes

Cintica do crescimento em descontnuo

Durante fase de adaptao Durante fase exponencial Durante fase estacionria Durante fase de morte

~0 = max. ~0 <0
Mantm-se invarivel ao longo do tempo

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Cintica do crescimento em descontnuo


Experimentalmente: a) h pequenas variaes no metabolismo celular, e b) ao retirar amostras para determinar n de clulas, introduz-se erros

experimentais, por isso a que se obtiveram:

max. que se determina a mdia de todos as max.

Linearizando os pontos da fase exponencial, obtm-se um max. mdio:

ln N = ln N0 + (t-t0) ou

y = a + mx

Por ajuste dos pontos, directamente curva experimental:

N = N0 e(t-t0)

y = a emx
Olga Nunes

Cintica do crescimento em descontnuo


Ajuste a uma curva exponencial
y = 0,0066466 * e^(1,3948x) R= 0,99949

Regresso linear
y = -5,0136 + 1,3948x R= 0,99931

1 0.5

ln Biomassa (g/l)
0 1 2 3 4 5 6 7 8

Biomassa (g/l)

1.5

0 -0.5 -1 -1.5 -2 -2.5

0.5

-3

Tempo (horas)

Tempo (horas)
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Cintica do crescimento em descontnuo


Quando a populao duplica:

N /N0 = 2

N = 2 N0

tgerao = tempo que a populao demora a duplicar o n de clulas


ln (2 N0) = ln N0 + .tgerao ln 2 + ln N0 = ln N0 + .tgerao

ln 2 = .tgerao

tgerao = 0,693 /
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Crescimento populacional microbiano


Cintica do crescimento em contnuo, num quimiostato

Olga Nunes

Crescimento em contnuo Quimiostato:


MEIO DE CULTURA FRESCO ENTRADA DE AR (OU OUTRO GS) FASE GASOSA VASO REGULADOR DE CAUDAL

CULTURA (VOLUME CONSTANTE) SADA DE EXCESSO DE FASE LQUIDA

MEIO DE CULTURA COM MICRORGANISMOS


Olga Nunes

Cintica do crescimento em contnuo


Num quimiostato:

= max. S / (ks + S) max. = taxa crescimento com saturao de nutrientes. S = concentrao do substrato limitante (normalmente a Fonte de Energia) Ks = constante de Monod (concentrao do substrato limitante para = 1/2 max.) Taxa de diluio: D = taxa de diluio do quimiostato (tempo-1) D = Q / V = 1/
Q = caudal do meio de cultura (volume/tempo) V = volume do reactor (volume) = tempo de passagem no reactor
Olga Nunes

Cintica do crescimento em contnuo


Num quimiostato:
Quando se inocula com um n baixo de clulas e D no excede um valor crtico (Dc), o n de clulas comea a aumentar:

dN/dt = Nclulas que permanecem - Nclulas que saem do vaso dN/dt = N - DN


Como no incio h muito substrato relativamente ao n clulas:

>D

dN/dt > 0

Olga Nunes

Cintica do crescimento em contnuo


Num quimiostato:

[S]

funo directa de S

No estado de equilbrio (estado estacionrio), o quimiostato auto-regula-se:

1.

momentneo

Mais clulas a consumir S

2. momentneo

Falta nutrientes

Menos clulas a consumir S Mais clulas Mais nutrientes

Olga Nunes

Cintica do crescimento em contnuo


Num quimiostato: Se D for mantido constante, em estado estacionrio:

dN/dt = 0
Nclulas que permanecem - Nclulas que saem do vaso = 0

N - DN = 0
Em estado estacionrio:

=D

D = max. S / (ks + S) e S = ks D / max. - D


Olga Nunes

Quimiostato no estado estacionrio


Sada de biomassa (g/l/h)

Conc. substrato (g/l)

Conc. biomassa (g/l)

8 6 4 2 0

4 3 2 1 0 0,0 0,5
Taxa de diluio (h-1)

8
Tempo de gerao (h)
Olga Nunes

6 4

0 1,0

washout

Cintica do crescimento dX/dt = - Y dS/dt Y = - dX/dS


X = biomassa produzida t = tempo S = substrato limitante

Taxa de produo de biomassa funo da taxa de consumo de substrato

Y = rendimento em biomassa relativamente ao substrato S Y = massa biomassa produzida/massa substrato consumido


Medida da ecincia das clulas na converso do substrato em biomassa

Olga Nunes

Cintica do crescimento Produtividade da fermentao P = concentrao do produto /tempo de fermentao (unidades/h-1)


Tempo de limpeza Tempo preparao do fermentador Tempo fase de adaptao

Afectam produtividade

Olga Nunes