MICROBIOLOGIA Prtica 2011/2012

1. Preparao de materiais e de meios de cultura

Mtodos de esterilizao:
- Calor seco (estufa a 180C metais, vidro) - Flamejamento (passar por lcool e levar chama uns segundos) - Irradiao (UV grandes superfcies ou gama) - Filtrao (papel especial orifcios de filtragem tm dimenses menores que as dos microrganismos) - Calor hmido (autoclave alguns plsticos, meios de cultura e gua destilada) A pasteurizao no considerada um mtodo de esterilizao, uma vez que nem todos os microrganismos so destrudos durante este processo (por ex., as bactrias endsporas os seus endsporos resistem a este processo).

Meios de cultura so solues de nutrientes utilizadas para o crescimento de microrganismos em

laboratrio. Podem ser classificados: i) Quanto ao seu estado fsico a. Lquidos consistem nos nutrientes dissolvidos em gua destilada; a cultura dos organismos faz-se geralmente em tubo de ensaio e tem como principais caractersticas a no imobilizao dos organismos e a maior acessibilidade dos nutrientes ao microrganismo. b. Slidos e semi-slidos consistem num meio lquido ao qual adicionado um agente solidificante, o Agar, e que vai dar origem a colnias, uma vez que estes meios tm a capacidade de imobilizar os organismos; os meios semi-slidos tm uma consistncia pouco firme, o que permite a motilidade de microrganismos slidos. ii) Quanto sua constituio

a. Naturais b. Semi-naturais c. Sintticos

iii) Quanto ao fim a que se destinam a. Mnimos ou simples a sua composio no facilita nem inibe em particular o crescimento de um determinado grupo de microrganismos, contendo apenas os nutrientes indispensveis, incluindo os factores de crescimento. b. Selectivos suprimem o crescimento dos microrganismos que no interessam ao fim em vista, permitindo o crescimento dos microrganismos que se desejam isolar.

c.

Diferenciais ou determinativos permitem o crescimento de vrios tipos de

microrganismos mas estes assumem diferentes aspectos, sendo possvel distinguilos/diferenci-los (variaes no tamanho, cor da colnia, cor do meio de cultura, etc.).

d. Completos ou enriquecidos permitem o crescimento de uma espcie microbiana em detrimento de outras. iv) Quanto sua composio a. Quimicamente definidos cuja composio qumica conhecida, porque se preparam adicionando quantidades precisas de compostos orgnicos ou inorgnicos de elevado grau de purificao a gua destilada. b. Complexos so preparados com vrios extractos biolgicos e/ou qumicos e que, portanto, tm uma composio qumica imprecisa. 2. Cultura e isolamento de microrganismos Cultura crescimento de populaes microbianas em meios laboratoriais (meios de cultura). Isolamento separao de um dado microrganismo a partir de populaes mistas. Colnia crescimento macroscpico visvel proveniente da multiplicao celular, originado a partir de uma nica clula.

Obteno de culturas puras:

- Mtodo de estrias pegar no inculo com a ansa e riscar superficialmente o meio de cultura slido, girar lentamente a caixa com o meio de modo a que o prximo riscado se faa noutra direco (o novo riscado deve apanhar uma parte do primeiro, para arrastar alguns organismos e apanhar uma outra parte do meio que no contenha nada). - Mtodo por espalhamento a amostra diluda pipetada sobre a superfcie de um meio de cultura slido e espalhada com a ajuda de prolas de vidro. - Mtodo por incorporao a amostra diluda pipetada numa placa de Petri estril e, em seguida, adicionado o meio de cultura com agar previamente liquefeito. 3. Testes bioqumicos identificao de bactrias a) Glucose (aerobiose)/ Glucose (anaerobiose) este teste permite identificar se o organismo vive em aerobiose ou anaerobiose e se estrita ou facultativa. i) ii) Aerobiose (+) / Anaerobiose (+): aerbio ou anaerbio facultativo Aerobiose (+) / Anaerobiose (-): aerbio estrito

b) Lactose este teste permite verificar se o organismo capaz de metabolizar outro acar que no a glucose.

c) NA + 7,5% NaCl este teste serve para testar a halofilia do organismo (necessidade de sal na sua vizinhana), sendo que o crescimento pode ser mais ou menos acentuado, consoante este for haloflico ou halotolerante, respectivamente. Se no crescer, porque o organismo no halfilo. d) Peptona este teste permite perceber se o organismo consegue metabolizar este polipptido, ou seja, se conseguem quebrar as ligaes peptdicas que se estabelecem entre cadeias. Se o fizerem, ocorre libertao de amnia reaco de Nessler que detectada com a mudana de cor do meio de incolor para amarelo. e) Triptona o objectivo deste teste testar se o organismo consegue metabolizar este polupptido com libertao do anel aromtico do Trp existente na sua cadeia; se isto acontecer, o meio contm ainda um reagente, o reagente de Kovacs, que, na presena do anel aromtico, passa de incolor para vermelho. f)

Na + 1% amido este teste permite saber se h produo de amlases. A presena de

amlases implica a degradao do amido, pelo que se forma um halo no corado; a ausncia destes enzimas significa que o amido no foi degradado e, quando se adiciona soluto de Lugol, este vai reagir com o amido formando um composto azul-escuro.

g) Na + esculina este teste permite testar a presena de -glucosidades; se existerem, da degradao da esculina vai ocorrer a libertao de um composto aromtico que precipita e leva a que o meio escurea. h) Teste produo de catalase (meio contendo os microrganismos + perxido de hidrognio) na presena de catalases, o perxido de hidrognio degradado com consequente libertao de oxignio, que confirmado pela formao de efervescncia. i)

Teste produo de oxidase permite testar se a bactria em estudo produz citocromo

oxidase (o reagente adquire uma cor roxa, em caso positivo).

4. Carcter Gram nas bactrias

Bactrias Gram-positivas apresentam uma espessa parede de peptidoglicanos por fora da

membrana celular e, por isto, conseguem suportar presses de turgescncia muito elevadas.

Bactrias Gram-negativas para alm da membrana celular, apresentam uma segunda membrana, a
membrana externa. Entre as duas membranas, existe um espao designado periplasma, onde esto localizados os peptidoglicanos. A sua parede celular menos resistente, uma vez que a camada de peptidoglicanos menos espessa. A membrana externa deste tipo de bactrias possui porinas (protenas transmembranares) que facilitam a entrada de nutrientes para o periplasma; caso contrrio, a existncia desta segunda membrana dificultaria o acesso das bactrias aos nutrientes, uma vez que possuem duas barreiras de permeabilidade.

Teste Carcter Gram (KOH 3%) este teste permite testar de uma forma rpida se os organismos so
Gram-positivos ou Gram-negativos. O meio contendo Gram-positivas no sofre qualquer alterao pois a sua parede celular muito espessa e sem porinas, no deixando passar os ies K + e OH-. O meio que

contm as bactrias Gram-negativas vai tornar-se extremamente viscoso; estes organismos tm porinas na sua membrana externa e uma parede celular muito mais fina, logo os ies vo entrar para o interior da clula e, por aumento da presso osmtica, vai ocorrer lise celular.

Colorao de Gram tcnica de colorao diferencial que permite distinguir os 2 principais grupos de
bactrias por microscopia ptica. O violeta de cristal vai corar as clulas do citoplasma, independentemente do tipo de bactria. A soluo de Lugol vai aumentar a afinidade entre o violeta de cristal e a clula e forma com o corante um complexo insolvel dentro da clula. Nas bactrias Gram positivas, devido presena da parede espessa, o precipitado insolvel que se forma por aco do soluto de Lugol vai ficar retido no interior da clula pela camada espessa de peptidoglicanos, logo estas clulas no so descoradas permanecendo com a colorao conferida pelo corante primrio (violeta). Nas bactrias Gram negativas o dito precipitado removido (camada de peptidoglicanos mais fina que a das Gram-positivo e a membrana externa parcial ou totalmente solubilizada pelo agente descolorante), pelo que as clulas ficam descoloradas; a adio do corante safranina confere-lhes posteriormente uma cor vermelha. 5. Testes de colorao identificao de bactrias

Colorao de endsporos: Os endsporos so clulas de alta resistncia microbiana (resistncia

temperatura, radiao, seca, etc.). Os esporos vo ento corar de verde (verde malaquite) e as clulas vegetativas de vermelho (safranina). 6. Etapas do ciclo do azoto

Fixao do azoto atmosfrico: o isolamento de bactrias do solo (fixadoras de azoto atmosfrico) fazse em meio slido manitol; este meio selectivo, pois inibe o crescimento das bactrias que no fixam o azoto atmosfrico, e no apresenta nenhuma fonte inorgnica/orgnica de azoto.

Amonizao: libertao do io amnio; utilizada uma soluo de peptona h libertao deste io

quando a peptona degradada por certas bactrias.

Nitritao: oxidao do io amnio a nitrito por parte de bactrias nitrificantes (NH4+ NO2-).
Meio de formao de nitrito (NH4)2SO4; K2HPO4; MgSO4; FeSO4; CaCO3; gua destilada.

Nitratao: oxidao do nitrito a nitrato (NO2- NO3-).

Meio de formao de nitrato NaNO2; K2HPO4; MgSO4; Na2CO3; NaCl; FeSO4; gua destilada.

Desnitrificao: reduo do nitrato at produo de azoto livre, por parte de bactrias desnitrificantes.
7. 1 etapa do ciclo do enxofre - Putrefaco Alguns microrganismos so capazes de degradar a cistena e certos compostos que contm enxofre, com libertao de SH2. Se for libertado SH2, este em contacto com o acetato de chumbo que impregna a tira de papel de filtro, reagir formando sulfureto de chumbo, ficando negra a tira de papel de filtro que inicialmente era incolor. Este teste feito em meio de cultura SAI (sulfureto, amnio, indol). Meio de formao de SH2 Triptona; extracto de levedura; extracto de carne; cistena; gua destilada. 8. Anlise microbiolgica de guas

Contaminao fecal contgio atravs do contacto com organismos, nomeadamente o Homem.

gua de consumo humano ausncia de coliformes totais e fecais e enterococos fecais em 100 mL e clostridios sulfitorredutores em 20 mL. Meios de cultura: i)

CCA presena de coliformes totais - colnias cor de salmo - e fecais colnias azul
violeta (os coliformes fermentam a lactose na presena de sais biliares meio selectivo.

ii)

Slanetz and Bartley Agar deteco e enumerao de Enterococos (teste presuntivo.

forma um complexto negro com os ies de ferro do meio.

iii) Kanamicilina Esculina Agar teste confirmativo da presena de Enterococos. A esculina iv) Meat Liver Agar presena de esporos de Clostridium spp. sulfito redutores. Adequado para microrganismos anaerbios e fastidiosos. O sulfito reduzido a H2S e o meio escurece devido presena de sais de ferro. 9. Crescimento populacional

Crescimento microbiano: associado ao crescimento de uma populao de clulas (uma clula d

origem a duas ao fim de um certo tempo tempo de gerao ou duplicao).

Clulas viveis podem dividir-se e originar colnias. cfu/mL = n de colnias x 1/I x 1/D (I = inculo (0,1 mL) e D = factor de diluio) % variabilidade = cfu/ n clulas totais (x 100)

Curva de crescimento microbiano:

- Fase de latncia ou de lag perodo inicial no qual no se observa crescimento. - Fase log ou exponencial a diviso celular segue uma funo logartmica; o crescimento balanceado, todas as actividades biossintticas ocorrem mesma taxa de diviso celular. Nesta fase, os valores de Abs aumentam e o meio de cultura fica mais turvo. - Fase estacionria perodo durante o qual o nmero de clulas viveis constante. - Fase de declnio ou morte a morte celular ocorre a uma taxa superior da diviso celular. Nesta fase os valores de Abs diminuem e o meio de cultura fica mais transparente.

Taxa de crescimento: = ln 2 / t, onde t = tempo de gerao.

10. Interaco fago-hospedeiro Bacterifagos ou fagos = vrus que infectam bactrias. So entidades biolgicas simples constitudas basicamente por um invlucro proteico que envolve o genoma viral (DNA ou RNA). caracterstico da infeco fgica a especificidade fago/bactria, ou seja, na grande maioria dos casos um determinado bacterifago infecta exclusivamente uma espcie, ou mesmo uma estirpe bacteriana.

Ciclo de multiplicao fgica - via ltica:

a) Adsoro dos fagos a receptores especficos da superfcie celular. b) Injeco do genoma viral para o interior da bactria. c) Replicao do genoma viral e morfognese de novas partculas fgicas. d) Libertao da descendncia fgica pela induo de lise bacteriana (nem sempre).

Via lisognica: alguns fagos podem alternativamente integrar o seu genoma no cromossoma bacteriano,
podendo ser perpetuado ao longo de varias geraes como parte integrante do genoma do hospedeiro. As bactrias transportando no seu cromossoma um genoma viral (profago) designam-se por lisognicas. Os vrus que apresentam a possibilidade de seguir, alternativamente, uma das duas vias de replicao designam-se por fagos temperados, enquanto que os que se multiplicam exclusivamente por via ltica designam-se por fagos lticos. Por vezes os hospedeiros bacterianos sofrem mutaes que conduzem ao bloqueio de um ou mais passos da multiplicao viral originando estirpes resistentes infeco fgica. Como os bacterifagos s so visveis ao ME, o mtodo standard utilizado para a sua deteco baseia-se na capacidade que os fagos

tm de formar halos de lise (placas fgicas) numa superfcie de crescimento confluente de um hospedeiro bacteriano.

11. Fungos: estrutura, reproduo e sistemtica Fungos so organismos heterotrficos com organizao somtica diversa, dotados de parede celular bem definida e tipicamente quitinizada e geralmente no-mveis, embora possam ocorrer estados mveis (zosporos). A organizao vegetativa dos fungos pode ser do tipo leveduriforme, quando unicelular, ou de tipo miceliano, quando filamentosa e ramificada.

Organizao somtica:
a) Leveduriforme caracterizada geralmente por clulas globosas, ovides, elpticas, cilndricas ou apiculadas; diz-se de tipo gemparo ou cissparo, consoante a multiplicao vegetativa ocorre por gemulao ou fisso binria. b) Miceliano caracteristicamente formado por hifas dotadas de crescimento apical, pode apresentar-se no septado ou possuir septos simples (no perfurados ou com um ou mais poros no obstrutivos do transito nuclear) ou septos complexos (dolipricos, dotados de parentossomas).

Reproduo assexuada em fungos:

A reproduo assexuada inclui todos os processos de multiplicao de indivduos de uma espcie que no envolvem cariogamia e meiose. Como no ocorrem modificaes na fase nuclear considera-se que um processo de reproduo conservativo, funcionando fundamentalmente como mecanismo de disseminao de um genoma previamente estabelecido. Os processos de reproduo assexuada encontrados nos fungos incluem, para alm da fragmentao do soma, a fisso binria ou gemulao encontradas em leveduras e a produo mittica de esporos que, em condies favorveis, germinam produzindo um novo miclio.

Esporo estrutura especializada para reproduo, sobrevivncia e disperso, normalmente delimitada

do soma fngico, e caracterizado por actividade metablica mnima, reduzido contedo em gua e ausncia de movimento citoplasmtico. Nos fungos micelianos, existem fundamentalmente dois tipos de esporos assexuais: a) Esporangisporos formam-se por clivagem do citoplasma em torno de cada ncleo de um esporngio multinucleado.

b) Conidisporos (condios) resultam de uma clula conidiognica pr-existente, por processos que no envolvem clivagem citoplasmtica.

Esporngios resultam da dilatao terminal e diferenciao de hifas especializadas (esporangiforos

simples ou ramificados) e contm geralmente um elevado nmero de esporos, embora alguns possuam um nmero reduzido (esporangiolos e meroesporngios).

Condios produzidos em hifas especializadas (conidiforos) que suportam as clulas conidiognica. Os

conidiforos distintos ou indistintos do resto do miclio podem ser simples ou ramificados, com complexidade varivel, e em determinados organismos associam-se formando corpos de frutificao assexual (esporodquios, cormios, picndios e acrvulos). Para alm da variabilidade e complexidade dos esporos encontrados nos fungos micelianos, de salientar que frequentemente o mesmo organismo produz diferentes tipos de esporos, fenmeno designado por

pleomorfismo. Reproduo sexuada em fungos:

A reproduo sexuada um processo que envolve sempre trs fases distintas e sequenciais: plasmogamia, cariogamia e meiose. Deste modo realiza-se a fuso de ncleos haplides, geneticamente compatveis, com formao de um zigoto diplide e consequentemente modificao da fase nuclear. Processos possveis para a plasmogamia: a) Fuso gametangial em hifas especializadas, designadas por zigforos, formam-se gametngios no diferenciados que se fundem originando o zigoto. Neste processo no se desenvolve uma fase dicaritica, a cariogamia sucedendo-se quase imediatamente plasmogamia. b) Contacto

gametangial

produzem-se

gametngios

morfologicamente

diferenciados

(anterdeos e ascognicos), verificando-se migrao de um ou mais ncleos anteridiais para o interior do gametngio feminino, atravs de um poro desenvolvido na zona de contacto. c) Espermatizao formam-se apenas gametngios femininos a cujas estruturas receptoras se ligam espermcios (clulas masculinas uninucleadas, esfricas ou bacilares, formadas em hifas especializadas) ou microcondios, verificando-se a migrao dos ncleos atravs dos poros de contacto. d) Somatogamia a plasmogamia ocorre directamente entre hifas somticas de miclios geneticamente compatveis ou entre hifas somticas e odios ou microcondios.

Cariogamia fuso dos ncleos haplides geneticamente compatveis, com formao de um zigoto
diplide.

Meiose necessria para o restabelecimento da fase nuclear haplide, garante a possibilidade de

recombinao gentica, funcionando a reproduo sexuada como um processo essencialmente destinado disseminao da variabilidade. Nos Zigomicetes (fuso gametangial), a diferenciao de gametngios a partir de hifas somticas um processo induzido quimicamente observando-se septao da poro terminal dos zigforos, com delimitao de gametngios previamente plasmogamia. Nos Ascomicetes (contacto gametangial ou espermatizao), forma-se um conjunto de hifas dicariticas a partir do gametngio feminino (ascognio). Nas clulas terminais destas hifas ascognicas, ocorre posteriormente a cariogamia que conduz formao de uma clula diplide, a clula-me do asco. Sucede-se imediatamente a meiose e forma-se uma dupla membrana que, envolvendo os ncleos formados, constitui a vescula do asco. Por pragueamento e invaginao so libertados por rotura ou dissoluo da parede do asco. Os ascos podem ser globosos, ovides ou alongados, de parede simples ou dupla, pedunculados ou ssseis, isolados, agrupados irregularmente ou dispostos em camada (himnio). Embora alguns ascomicetes produzam ascos livres ou nus, geralmente os ascos formam-se no interior de frutificaes designadas por ascocarpos. Nos Basidiomicetes (somatogamia num estado inicial do ciclo de vida), forma-se um miclio dicaritico (miclio secundrio) que prolifera e se organiza em corpos de frutificao complexos, os basidiocarpos. Neste carpforos formam-se estruturas tipicamente clavadas, os basdios, onde ocorre a cariogamia e a meiose, produzindo-se geralmente quatro basidisporos que se mantm inseridos em esterigmas na superfcie do basdio at maturao. Na maioria dos basidiomicetes, os basdios encontram-se dispostos em camadas (himnio) e podem apresentar-se expostos desde um estado inicial do desenvolvimento ou permanecer encerrados at desintegrao ou fractura acidental do basidiocarpo.