Anda di halaman 1dari 31

LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS FARMASI II PENETAPAN KADAR QUININ DALAM URIN SETELAH MENGKONSUMSI TABLET QUININ DENGAN METODE

FLUORESENSI (SPEKTROFOTODENSITOMETRI MODE FLUORESENSI)

KELOMPOK IV : Khatija Taher Ali Ni Made Ayu Suartini I.G.A. Mira Semara Wati Ni Putu Parwatininghati Enny Laksmi Artiwi (0808505014) (0808505015) (0808505016) (0808505017) (0808505018)

LABORATORIUM ANALISIS FARMASI JURUSAN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA BUKIT JIMBARAN 2010

PENETAPAN KADAR QUININ DALAM URIN SETELAH MENGKONSUMSI TABLET QUININ DENGAN METODE FLUORESENSI (SPEKTROFOTODENSITOMETRI MODE FLUORESENSI)

I.

TUJUAN Untuk menetapkan kadar Quinin dalam urin setelah mengkonsumsi tablet Quinin dengan metode fluoresensi (alat dengan spektrofotodensitometri-mode fluoresensi).

II.

DASAR TEORI 2.1 Quinin Quinin merupakan alkaloid yang diperoleh dari kulit kayu pohon cinchona dan isomer levorotatory dari quinidin. Quinin merupakan senyawa antimalaria (McEvoy, 2002).

Struktur Kimia Quinin Rumus molekul quinin C20H24N2O2; berat molekul 324,4 g/mol; pemerian berupa

serbuk mikrokristal atau granul-granul berwarna putih, sedikit berfluoresensi; titik lebur 570C; kelarutan dalam air 1 : 1900, dalam air panas 1 : 760, dalam alkohol 1 : 0,8, dalam benzene 1 : 80, dalam kloroform 1 : 1,2, dalam eter kering 1 : 250, dalam gliserol 1 : 2, dan tidak larut dalam petroleum eter; pKa 4,1; 8,5 (20 oC). Quinin sulfat akan menghitam jika kontak dengan cahaya. Kapsul quinin sulfat disimpan dalam tempat yang rapat dan terlindung oleh cahaya, sehingga sebaiknya quinin disimpan pada suhu kurang dari 400C, lebih baik apabila disimpan pada suhu

antara 15-30oC. Tablet quinin sulfat harus disimpan dalam tempat yang tertutup baik pada suhu kurang dari 40oC, lebih baik 15-30oC (McEvoy, 2002). 2.2 Farmakokinetik Quinin 2.2.1 Absorbsi Quinin sulfat diabsorpsi baik jika diberikan secara oral atau intramuskular. Absorpsi quinin secara oral sebagian besar terjadi di saluran pencernaan, yaitu pada usus halus yang mencapai 80%, hal ini juga terjadi pada pasien dengan diare (Lubis, 2009). Berdasarkan administrasi dosis oral tunggal, konsentrasi serum puncak dari alkaloid cinchona, termasuk quinin, umumnya terjadi dalam 1-3 jam. Berdasarkan ketidakberlanjutan terapi quinin, konsentrasi plasma dari obat menurun secara cepat dan hanya konsentrasi rendah dideteksi setelah 24 jam. Kurang dari 70% quinin dalam plasma terikat dengan protein, sehingga jumlah quinin dalam bentuk bebasnya di dalam plasma rendah (McEvoy, 2002). Di dalam plasma, konsentrasi quinin berkisar antara 3-7 mg/L.Waktu paruhnya 4-15 jam. Konsentrasi plasma dari quinin lebih tinggi dan waktu paruh plasma obat lebih panjang pada pasien dengan malaria (Moffat, 2005). 2.2.2 Distribusi Distribusi quinin terjadi ke seluruh jaringan tubuh, termasuk cairan serebrospinal, ASI, dan plasenta. Distribusi quinin luas dalam hati, tetapi kurang dalam paru-paru, ginjal dan limpa (Lubis, 2009). Volume distribusi quinin lebih rendah pada pasien dengan malaria daripada individu yang sehat. Volume distribusi quinin dilaporkan rata-rata 0,8 L/kg pada anak-anak 1 - 12 tahun yang memiliki malaria moderat dan 1,1 L/kg pada anak yang sembuh 112 tahun (McEvoy, 2002). Sejumlah kecil dari obat didisrtribusi ke dalam empedu dan saliva. Quinin melewati plasenta dan terdistribusi ke dalam susu. Kira-kira 70% quinin terikat dengan protein plasma (McEvoy, 2002). 2.2.3 Metabolisme

Metabolisme quinin terjadi di hepar. Metabolisme terjadi melalui oksidasi menjadi metabolit terhidroksilasi. Metabolit utama adalah 2-hidroksiquinolin dan derivate 6-hidroksikuinolin, 3-hidroksiquinin, dan komponen dihidro yang berhubungan. Quinin-10, 11-epoksida dan quinin-10,11-dihidrodiol juga pernah dideteksi pada urin. Setiap metabolit dari quinin akan berfluoresensi pada keadaan tertentu. 2-hidroksiquinolin berfluoresensi pada panjang gelombang 259 nm pada kondisi asam; 332 nm pada pelarut non polar; 324 nm pada pelarut polar. 6-hidroksikuinolin akan berfluoresensi pada panjang gelombang 419 nm dan 583 nm jika kondisinya asam (aseton) (Galichet, 2004). Sedangkan quinine akan berfluoresensi pada panjang gelombang 450 nm (Reily, 2003,). Panjang gelombang maksimum absorpsi quinin 250 nm, 317 nm, 346 nm (pada larutan asam); 280 nm, 330 nm (pada larutan basa) (Galichet, 2004). 2.2.4 Ekskresi Waktu paruh eliminasi plasma quinin rata-rata 8 - 21 jam pada orang dewasa dengan malaria dan 7 - 12 jam pada orang dewasa yang sudah sembuh. Pada anak 1 - 12 tahun, waktu paruh eliminasi plasma dari quinin dilaporkan rata-rata 11 - 12 jam pada anak dengan malaria dan 6 jam pada anak yang sembuh (McEvoy, 2002). Quinin sulfat diekskresikan melalui urin dalam bentuk metabolit hidroksi. Sebagian kecil diekskresikan melalui tinja, getah lambung, empedu dan air liur. Ekskresi quinin yang sempurna terjadi selama 24 jam. Quinin direabsorpsi ketika urin alkali sehingga ekskresi ginjal dari obat dua kali lebih cepat ketika urin asam dibandingkan urin alkali (Lubis, 2009). 2.3 Urin Tidak seperti plasma, urin bebas dari protein dan lipida, karena itu umumnya dapat langsung diekstraksi dengan pelarut organik. Urin jika dibandingkan dengan plasma atau serum, komposisinya bervariasi cukup besar yang dapat dilihat dari warna gelap urin malam dibandingkan dengan warna pucat urin yang dikumpulkan pada siang hari.

Komposisi urin keseluruhan tergantung pada diet yang memang menyebabkan warna yang berbeda (Wirasuta, 2008). Urin mengandung air, urea, dan ammonia yang merupakan sisa perombakan protein; garam mineral terutama garam dapur; zat warna empedu yang memberi warna kuning pada urin, serta zat yang berlebihan dalam darah, seperti vitamin dan obatobatan. Secara spesifik kandungan urin meliputi 0,05 % amonia; 0,18% sulfat; 0,12% fosfat; 0,6% klorida; 0,01% magnesium; 0,015% kalsium; 0,6% potasium; 0,1% sodium; 0,1% kreatinin; 0,03% asam urat; 2% urea; dan sebanyak 95% air (Wasito,-). Sampel urin umumnya hanya digunakan jika kadar obat dalam darah terlalu kecil untuk dapat dideteksi. Selain itu sampel urin juga digunakan apabila eleminasi obat dalam bentuk utuh melalui ginjal cukup besar yaitu lebih dari 40 %. Salah satu keuntungan sampel urin jika digunakan dalam analisis adalah mudah dilakukan karena pengambilan sampelnya lebih mudah daripada pengambilan sampel darah. Selain itu, jumlah sampel yang didapatkan banyak, lama dan selang waktu penampungan urin sesuai dengan karakteristik obat yang akan diuji dan umumnya tidak mengandung lipid dan protein sehingga mudah untuk diekstraksi menggunakan pelarut organik. Jenis senyawa yang umum terdapat dalam urin larut air, sedangkan sebagian besar obat larut lemak, sehingga dapat diekstrasi dengan pelarut yang sesuai (Anonim, 2005). Kesulitan dalam penggunaan sampel urin adalah adanya perbedaan yang besar dari volume urin yang dihasilkan pada satu tenggang waktu. Urin dapat mempunyai rentang pH yang lebar, tergantung dari diet atau pengobatan. Misalnya antasida, jika diabsorpsi akan menyebabkan urin basa sehingga tidak boleh dikocok, melainkan tabung dibolakbalik secara pelahan-lahan (Wirasuta, 2008). 2.4 Spektrofluoresensi Fluoresensi molekular merupakan suatu proses emisi dimana absorpsi REM (Radiasi Elektromagnerik) menyebabkan molekul tereksitasi. Molekul tersebut akan kembali pada keadaan stabilnya (ground state) dan melepaskan energi sebagai foton. Relaksasi tersebut dapat berupa relaksasi fluoresensi atau berupa relaksasi non radiatif. Panjang gelombang yang dapat digunakan agar terjadi fluoresensi adalah 200-800 nm. Metode fluoresensi lebih selektif daripada metode absorpsi karena hanya sedikit

substansi yang berfluoresensi daripada yang mengabsorpsi sinar UV atau sinar tampak. Fluorosensi juga lebih sensitif daripada metode absorpsi karena dengan menggunakan metode fluorosensi selalu akan lebih mudah untuk mengukur sinyal kecil terhadap blangko (Moffat et al, 2005). Pengukuran semikuantitatif untuk kekuatan fluoresensi ditentukan oleh rasio dari intensitas fluoresensi pada spesimen tes dan dibandingkan dengan standar dengan syarat menggunakan setting instrumen yang sama. Pada quinin, standar yang digunakan adalah larutan quinin dalam asam sulfat 0,1 N atau dalam NaOH 0,1 N (Lawrence, 2007). 2.5 KLT-Spektrofotodensitometri Kromatografi lapis tipis merupakan bentuk kromatografi planar selain kromatografi kertas, dengan fase diam berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, plat aluminium, atau plat plastik. Fase gerak dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak disepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending) (Rohman, 2007). Metode KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang tidak volatil atau senyawa yang sifat volatilitasnya rendah, senyawa dengan polaritas rendah hingga tinggi, bahkan untuk memisahkan senyawa-senyawa ionik (Hahn-Deinstrop, 2007). Pemilihan fase gerak didasarkan pada keterpisahan senyawa-senyawa dalam analit yang didasarkan pada nilai Rf atau hRf (100Rf). Nilai Rf diperoleh dari membagi jarak pusat kromatografik dari titik awal dengan jarak pergerakan pelarut dari titik awal. Perhitungan nilai hRf ditunjukkan dengan persamaan dibawah ini. hR f = jarak elusi analit dari titik awal penotolan 100 jarak muka pelarut dari titik awal penotolan

Penggunaan KLT dapat berupa analisis kualitatif dan analisis kuantitatif. Pada analisis kualitatif, KLT dapat digunakan untuk uji identifikasi senyawa baku. Parameter pada KLT yang digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf. Dua senyawa dikatakan identik jika mempunyai nilai Rf yang sama jika diukur pada kondisi KLT yang sama.

Untuk meyakinkan identifikasi dapat dilakukan dengan menggunakan lebih dari 1 fase gerak dan jenis pereaksi semprot (Rohman, 2007). Untuk analisis kuantitatif pada KLT dapat digunakan dua cara. Pertama, bercak pada plat KLT diukur langsung pada lempeng dengan menggunakan ukuran luas atau dengan teknik densitometri. Cara kedua adalah dengan mengerok bercak lalu menetapkan kadar senyawa yang terdapat dalam bercak tersebut dengan metode analisis yang lain, misalkan dengan metode spektrofotometri (Rohman, 2007). Densitometer dapat bekerja secara serapan atau flouresensi. Densitometer mempunyai sumber cahaya yang diarahkan menuju monokromator (untuk memilih rentang panjang gelombang yang cocok antara 200-800 nm), sistem untuk memfokuskan sinar pada lempeng, pengganda foton, dan rekorder (Rohman, 2007). Output detektor dikonversikan menjadi signal dan diamplifikasi. Sebagai tambahan untuk scanning instrumen densitometer dilengkapi dengan digital konverter, dan data akan diproses secara digitalisasi oleh komputer. Analis dapat bekerja dengan densitometri pada jangkauan panjang gelombang 190 s/d 800 nm. Terjadinya penyimpangan baseline yang disebabkan oleh variasi ketebalan dan ketidakseragaman lapisan pada densitometer sangat kecil dan level signalnya relatif tinggi.

Gambar 2. Skema Instrumen Spektrofotodensitometer Keterangan: L (light); SL (slit); MC (monokromator); PM (photomultiplier); FF (filter fluorescens); P (plat); SCS (sistem for circular scanning). Prinsip kerja spektrofotodensitometri berdasarkan interaksi antara radiasi elektromagnetik dari sinar UV-Vis dengan analit yang merupakan noda pada plat. Radiasi elektromagnetik yang datang pada plat diabsorpsi oleh analit, ditransmisi atau diteruskan. Jika plat yang digunakan transparan, radiasi elektromagnetik yang

diabsorpsi oleh analit atau indikator plat dapat diemisikan berupa flouresensi dan fosforesensi (Sherma and Fried 1994). Pemadaman flouresensi indikator F-254 dapat terjadi akibat adanya noda pada plat sehingga teramati di bawah lampu UV sebagai noda hitam (Mulja dan Sukarman, 1995). Analisis KLT dengan menggunakan spektrofotodensitometri dapat dilakukan dengan menggunakan mode absorbsi atau flouresensi. Pada umumnya yang paling sering digunakan adalah mode absorbsi dengan menggunakan sinar UV pada 190-300 nm. Oleh karena kebanyakan plat KLT menggunakan silika gel yang bersifat opaque (tidak tembus cahaya), maka pengukuran dengan mode transmitan tidak cocok digunakan. Penentuan absorpsi analit pada plat KLT opaque didasarkan pada rasio intensitas antara radiasi elektromagnetik yang datang dengan intensitas radiasi elektromagnetik yang dipantulkan/direfleksikan. Pengukuran flouresensi merupakan metode pengukuran langsung yang peka untuk senyawa dalam daerah ultraviolet dapat ditentukan melalui emisi penyinaran sekunder. Intensitas cahaya flouresensi setelah dipancarkan melalui suatu monokromator, diukur secara selektif dalam kondisi yang sesuai, berbanding lurus dengan berat senyawa yang ada dalam noda (Sherma and Fried, 1994). Fluorosensi molekuler adalah proses emisi dimana molekul dieksitasi dengan absorpsi dari radiasi elektromagentik. Selektivitas fluorosensi spektrometri memberikan sensitivitas yang tinggi dan spesifiksitas tinggi daripada metode absorpsi. Fluorosensi lebih selektif sebab emisi dan absorpsi spektra dapat diperoleh (Moffat et al, 2005). Analisis kuantitatif dari suatu senyawa yang telah dipisahkan dengan KLT dapat dilakukan dengan densitometri langsung pada plat KLT untuk menentukan kadar suatu senyawa sampel (Schunack et al., 1990). Hal ini dapat dilakukan dengan cara nodanoda yang telah terpisah pada pelat TLC/HPTLC dimasukkan ke dalam alat ini, kemudian ditentukan kadarnya berdasarkan hubungan antara Area Under Curve (AUC) noda dengan konsentrasi senyawa dalam noda (Sherma and Fried, 2003). III. ALAT DAN BAHAN 3.1 Alat

1. 2. 3.
4.

Labu ukur 10 ml Labu ukur 25 ml Neraca analitik Gelas ukur Pipet volume Pipet tetes Chamber Gelas beaker Plat Silika Gel G60 Spektrofotodensitometer Sentrifugator Oven Pipet mikro

5. 6. 7. 8.
9.

10. 11. 12. 13. 3.2 Bahan


1. 2.

Serbuk quinin sulfat Methanol (CH3OH) Urin Amonia pekat (NH3) Kloroform (CHCl3) Asam Sulfat (H2SO4) 0,1 N Isopropanol

3.
4. 5. 6.

7.

IV. PROSEDUR KERJA 4.1 Pembuatan Larutan 4.1.1 Larutan Stok Baku Quinin Sulfat (1 mg/mL) Ditimbang dengan seksama 10 mg serbuk quinin sulfat baku. Serbuk dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambahkan 5 mL methanol P.

Dilakukan pengocokan secara mekanik. Ditambahkan methanol P sampai tanda batas, kemudian dihomogenkan. 4.1.2 Larutan Baku Sekunder I Quinin Sulfat (5000 ng/mL) 1. Pengenceran Pertama Diketahui : Konsentrasi Larutan Baku Stok (C1) = 1 mg/mL = 1000g/mL Volume Larutan Baku Stok (V1) Volume Larutan Baku yang dibuat (V2) Ditanya C1 1000g/mL Perhitungan : V1 0,1 mL C2 C2 C2 C2 2. Pengenceran Kedua Diketahui : Konsentrasi Larutan Baku yang ada (C2) ng/mL Konsentrasi Larutan Baku yang dibuat (C3) ng/mL Volume Larutan Baku yang dibuat (V3) Ditanya C2 10000ng/mL : Volume Larutan Baku yang diambil (V2) V2 V2 V2 = = = C3 5000 ng/mL C 3 V3 C2 V3 10 mL Perhitungan : = 10 mL = 5000 = 10000 = = = = = = C2 V2 C2 10 mL C1 V1 C2 1000 g/mL 0,1 mL 10 mL 10 g/mL 10000 ng/mL = 0,1 mL = 10 mL

A. Perhitungan

: Konsentrasi Larutan Baku yang dibuat (C2)

V2 V2

5000 ng/mL 100 mL 10000ng/mL = 5 mL =

B. Pembuatan Larutan Baku Sekunder I Quinin Sulfat (5000 ng/mL)

Dipipet 0,1 mL larutan baku stok quinin dengan seksama dan dimasukkan ke labu ukur 10 mL. Ditambahkan methanol sampai tanda batas, kemudian dihomogenkan. Dari larutan yang terbentuk, dipipet 5 mL dengan seksama dan dimasukkan ke labu ukur 10 mL. Ditambahkan methanol sampai tanda batas, kemudian dihomogenkan. 4.1.3 Larutan Baku Sekunder II Quinin Sulfat (20 ng/L) A. Perhitungan : Konsentrasi Larutan Baku Stok (C1) = 1 mg/mL = 1000g/mL Volume Baku Sekunder (V2) Ditanya C1 1000g/mL = 5 mL Konsentrasi Baku Sekunder (C2) = 20 ng/L = 20 g/mL : Volume larutan stok yang diambil (V1) V1 V1 V1 V1 V1
B.

Diketahui

Perhitungan : = = = = = C2 V2 20 g/mL 5 mL C 2 V2 C1 20 g/mL 5 mL 1000 g/mL 0,5 mL

Pembuatan Larutan Baku Sekunder II Quinin Sulfat (20 ng/L)

Dipipet 0,5 mL larutan baku stok quinin dengan seksama dan dimasukkan ke labu ukur 5 mL. Ditambahkan methanol sampai tanda batas, kemudian dihomogenkan. 4.1.4 Preparasi Larutan Blanko Disiapkan urin sebanyak 2 mL ke dalam tabung reaksi yang diberi label 1.

4.1.5

Preparasi Larutan Uji Dibuat 3 seri larutan uji dengan konsentrasi 250 ng/mL, 500 ng/mL, dan 1000 ng/mL A. Perhitungan Diketahui : Konsentrasi Baku Sekunder I Konsentrasi yang dibuat dan 1000 ng/mL Volume Larutan Uji Ditanya Perhitungan :
1. Untuk C = 250 ng/mL

= 5000 ng/mL = 250 ng/mL, 500 ng/mL, = 2 mL

: Volume Baku Sekunder I yang diambil

Cbaku sekunder 5000 ng/mL

V V V V1 V1

= = =

Clarutan uji Vlarutan uji 250 ng/mL 2 mL C larutan uji Vlarutan uji

C baku sekunder = 250 ng/mL 2 mL 5000 ng/mL = 0,1 mL

2. Untuk C = 500 ng/mL

Cbaku sekunder 5000 ng/mL

V V V V1 V1

= = =

Clarutan uji Vlarutan uji 500 ng/mL 2 mL C larutan uji Vlarutan uji

C baku sekunder = 500 ng/mL 2 mL 5000 ng/mL = 0,2 mL

3. Untuk C = 1000 ng/mL

Cbaku sekunder 5000 ng/mL

V V V

= Clarutan uji Vlarutan uji = 1000 ng/mL 2 mL = C larutan uji Vlarutan uji C baku sekunder

V1 V1 B. Pembuatan Larutan Uji

1000 ng/mL 2 mL 5000 ng/mL = 0,4 mL =

Disiapkan sebanyak 3 tabung reaksi yang berbeda. Tabung diberi label 2, 3, dan 4. Komposisi tiap tabung adalah sebagai berikut. V baku sekunder I 0,1 mL 0,2 mL 0,4 mL V urin yang diambah 1,9 mL 1,8 mL 1,6 mL Kandungan Quinin Sulfat (ng) 500 ng 1000 ng 2000 ng

No. 2 3 4 4.1.6

Konsentrasi 250 ng/mL 500 ng/mL 1000 ng/mL Preparasi Sampel

Disiapkan sampel urin yang mengandung quinine sebanyak 2 mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang diberi label 5. 4.1.7 Preparasi Larutan Standar Larutan standar dibuat dari larutan baku sekunder II quinine sufat (20 ng/L). Larutan standar ditotolkan pada plat sebagai totolan ke-6, 7, 8, dan 9. Volume yang Ditotol (L) 10 20 40 80 Massa quinin sulfat (ng) 200 400 800 1600

No. 6 7 8 9 4.2

Ekstraksi Cair-cair Tabung 1 - 5 diberi amonia secukupnya + 0,1 mL hingga mencapai pH 9-10. pH ditentukan menggunakan indicator pH. Ditambahkan 2 ml campuran pelarut kloroform dan isopropanol (3 : 1) sebayak 4 mL. Tabung 1 - 5 divortex dengan kecepatan 2500 rpm selama 30 menit agar terbentuk emulsi sempurna. Tabung 1 - 5 disentrifugasi

dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit. Fase kloroform diambil dari masing masing tabung, dan diuapkan pada suhu 60C. Residu dilarutkan dalam 25 L methanol. 4.3 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Spektrofotodensitometri Sistem KLT : TA. Fase diam Fase gerak : silika G60 ukuran 10 cm 10 cm : methanol : larutan amoniak pekat (100:1,5)

Plat dicuci dengan methanol, kemudian diaktivasi pada oven dengan suhu 120 C selama 30 menit. Chamber dijenuhkan dengan fase gerak. Disiapkan tepi atas dan tepi bawah pada plat silika. Larutan kontrol, larutan uji, larutan sampel, dan larutan standar ditotolkan pada plat silika G60. Plat dielusi dalam chamber yang telah dijenuhkan dengan fase gerak. Plat diangkat dan dikeringkan pada suhu 60C selama 10 menit, lalu diamati menggunakan spektrofotodensitometer. Masing-masing noda Bercak diukur diamati luasnya dengan dengan spektrofotodensitometer.

spektrofotodensitometer pada panjang gelombang absorpsi maksimum terjadi eksitasi (255 nm). Plat KLT selanjutnya disemprot dengan larutan asam sulfat 0,1 N. Dilakukan pengukuran spektrum emisi pada panjang gelombang 254 nm. Kemudian dilakukan analisis terhadap hasil scan yang didapat. V. SKEMA KERJA 5.1 Pembuatan Larutan-larutan 5.1.1 Stok Baku Quinin Sulfat (mg/mL)

Ditimbang 10 mg serbuk quinine sulfat dalam labu ukur 10 mL

Ditambah 5 mL methanol

Dikocok secara mekanik

Ditambah methanol sampai tanda batas

Dihomogenkan

5.1.2

Baku Sekunder I Quinin Sulfat (5000 ng/mL)

Dipipet 0,1 mL larutan baku stok quinine sulfat

Dimasukkan ke labu ukur 10 mL

Ditambah methanol sampai tanda batas

Dihomogenkan

Dipipet 5 mL dari larutan yang terbentuk

Dimasukkan ke labu ukur 10 mL

Ditambah methanol sampai tanda batas

Dihomogenkan

5.1.3

Baku Sekunder II Quinin Sulfat (20 ng/L)

Dipipet 0,5 mL larutan baku stok quinine sulfat

Dimasukkan ke labu ukur 5 mL

Ditambah methanol sampai tanda batas

Dihomogenkan

5.1.4

Blanko

Dipipet urin sebanyak 2 mL

Dimasukkan ke dalam tabung reaksi

Tabung diberi label 1

5.1.5

Larutan Uji

Disiapkan 3 tabung reaksi, diberi label 2,3, dan 4

Tabung 2 : 1,9 mL urin + 0,1 mL baku sekunder I

Tabung 3 : 1,8 mL urin + 0,2 mL baku sekunder I

Tabung 4 : 1,6 mL urin + 0,4 mL baku sekunder I

5.1.6

Sampel Sampel disiapkan oleh asisten

5.1.7

Larutan Standar Larutan standar dibuat dari larutan baku sekunder II quinine sufat (20 ng/L). Larutan standar ditotolkan pada plat sebagai totolan ke-6, 7, 8, dan 9.

Disiapkan larutan baku sekunder II

Totolan 6 : 10 L

Totolan 7 : 20 L

Tabung 9 : Totolan 8 : 40 l 80 L

5.2

Ekstraksi Cair-cair

Tabung 1 5 + ammonia 0,1 mL + 4 mL kloroform : isopropanol (3 : 1)

Divortex kecepatan 2500 rpm selama 30 menit

Disentrifugasi kecepatan 3000 rpm selama 30 menit

Fase kloroform dari masing-masing tabung diambil

Diuapkan pada suhu 60C

Residu dilarutkan dalam 25 L methanol

5.3

KLT dan Spektrofotodensitometri

Disiapkan plat silica G60 dengan ukuran 10 cm 10 cm

Tepi atas dan bawahnya ditandai

Plat diaktivasi dalam oven 120 C selama 30 menit

Semua larutan ditotolkan pada plat

Plat dielusi dalam chamber yang sudah jenuh dengan fase gerak methanol : amonia kuat (100 : 1,5)

Plat diangkat dan dikeringkan dalam oven 60C selama 10 menit

Bercak diamati dengan spektrofotodensitometer. Masing-masing noda diukur luas areanya dengan pada max eksitasi 255 nm. Plat disemprot dengan H2SO4 0,1 N dan dikeringkan dalam oven pada suhu 600C selama 10 menit.

Dilakukan pengukuran spektrum emisi pada panjang gelombang 255 nm.

Dilakukan analisi terhadap hasil scan

VI. HASIL PENGAMATAN Tabel Pengamatan harga hRf dan luas AUC Fluoresensi Quinin Sulfat pada Panjang Gelombang 255 nm No Spot 1 2 3 4 5 6 7 8 9 VII. ANALISIS DATA Larutan Blanko Uji 1 Uji 2 Uji 3 Sampel Standar 1 Standar 2 Standar 3 Standar 4 hRf 66 64 64 67 68 70 AUC 696,7 4955,8 8180,1 7352,8 13433,5 33613,9

7.1

Pembuatan Kurva Kalibrasi Dari keempat larutan standar yang dibuat, hanya 2 larutan standar yang terbaca, sehingga hanya 2 data yang digunakan untuk membuat kurva kalibrasi. AUC 13433,5 33613,9 Konsentrasi (ng) 400 1600

7.2

Konsentrasi Quinin Sulfat Dalam Larutan Uji Berdasarkan Persamaan Kurva Kalibrasi Diketahui : AUC larutan uji 1 AUC larutan uji 2 AUC larutan uji 3 Persamaan kurva Ditanya Perhitungan :
a. Jumlah quinin sulfat dalam larutan uji

= 696,7 = 4955,8 = 8180,1 = y = 16,81x + 6706

: Konsentrasi quinin sulfat dalam larutan uji 1

Larutan Uji 1 16,81x + 6706 16,81x + 6706 16,81x 6009,3 x = 16,81 x = -357,4836 ng Jumlah quinin sulfat dalam larutan uji 1 yang terdeteksi berada di luar rentang konsentrasi kurva kalibrasi Larutan Uji 2 16,81x + 6706 16,81x + 6706 16,81x 1750,2 x = 16,81 x = -357,4836 ng Jumlah quinin sulfat dalam larutan uji 2 yang terdeteksi berada di luar rentang konsentrasi kurva kalibrasi Larutan Uji 3 y 8180,1 1474,1 x x = = = = = 16,81x 16,81x 16,81x 1474,1 16,81 87,6918 ng + + 6706 6706 y 4955,8 -1750,2 = = = y 696,7 -6009,3 = = =

7.3

Perolehan Kembali Larutan Uji 3 Diketahui Ditanya : Massa sebenarnya = 2000 ng Konsentrasi dari persamaan kurva = 87,6918 ng : Perolehan kembali Quinin Sulfat dalam larutan uji 3 konsentras i dari persamaan kurva 100% konsentras i sebenarnya Perhitungan : Perolehan Kembali =

Perolehan Kembali Perolehan Kembali 7.4

87,6918 ng 100% 2000 ng = 4,3846 % =

Konsentrasi Quinin Dalam Sampel Diketahui : AUC sampel Persamaan regresi Volume sampel yang dianalisis Ditanya Perhitungan : a. Massa Quinin Sulfat dalam sampel y 7352,8 646,8 x x = = = = = 16,81x + 16,81x + 16,81x 646,8 16,81 38,4771 ng 6706 6706 = 7352,8 = y = 16,81x + 6706 = 2 mL

: Konsentrasi quinin sulfat dalam sampel

b. Konsentrasi Quinin Sulfat dalam sampel Konsentrasi = = massa dari kurva volume yang dianalisis 38,4771 ng 2 mL

= 19,2385 ng/mL VIII. PEMBAHASAN Pada praktikum kali ini, dilakukan penentuan kadar quinin dalam urin pasien yang telah mengkonsumsi tablet quinin. Metode yang digunakan dalam penentuan kadar quinin dalam urin adalah KLT-spektrofotodensitometri dengan mode flouresensi. Metode ini digunakan karena quinin sulfat memiliki sifat mampu berfluorosensi. Prisip kerja alat spektrofotodensiometer berdasarkan interaksi antara radiasi elektromagnetik dari sinar UVVis dengan analit yang merupakan noda pada plat (Mulja dan Sukarman, 1995). Mode yang digunakan pada analisis ini adalah mode fluoresensi, dimana intensitas cahaya flouresensi setelah dipancarkan melalui suatu monokromator berbanding lurus dengan berat senyawa

yang ada dalam noda (Sherma and Fried, 1994). Untuk melakukan penetapan kadar quinin dengan metode KLT-spektrofotodensitometri mode flouresensi, diperlukan 4 jenis larutan, yaitu larutan blanko, larutan uji, sampel, dan larutan standar. Tujuan dari penggunaan larutan blanko adalah untuk koreksi serapan yang disebabkan oleh pelarut, pereaksi, sel, ataupun pengaturan alat (Anonim, 1979). Larutan blanko adalah larutan yang komposisinya persis sama dengan sampel namun tidak mengandung analit, sehingga pada analisis ini larutan blanko yang digunakan adala urin yang tidak mengandung quinin sulfat. Sedangkan, sampel yang disiapkan oleh asisten merupakan urin yang mengandung sejumlah quinin sulfat. Larutan uji dibuat dengan melarutkan quinin sulfat yang telah ditetapkan jumlahnya ke dalam urin. Larutan uji bertujuan untuk menentukan akurasi dari metode yang digunakan dalam penetapa kadar quinin. Kecermatan merupakan ukuran yang menyatakan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit sebenarnya. Kecermatan dapat dinyatakan dengan persentase perolehan kembali. Pembuatan larutan uji dari matriks yang tidak diketahui kandungannya secara pasti, seperti urin, seharusnya menggunakan metode penambahan baku dan sebaiknya dibuat sedikitnya lima sampel yang mengandung analit 50150% dari kandungan yang diharapkan dan plasebo (Harmita,2004). Namun, dalam praktikum ini pembuatan larutan uji dilakukan dengan metode simulasi. Berdasarkan metode tersebut, dilakukan penambahan sejumlah analit bahan murni (senyawa pembanding kimia SRM quinin sulfat) ke dalam urine dari sumber urin yang sama. Larutan uji hanya dibuat sebanyak 3 larutan, masing masing memiliki konsentrasi 250 ng/mL, 500 ng/mL dan 1000 ng/mL quinin sulfat. Pembuatan larutan standar bertujuan untuk membuat kurva kalibrasi. Kurva kalibrasi digunakan untuk menentukan kadar quinin sulfat dalam sampel. Kurva kalibrasi juga berfungsi untuk uji validasi metode, yaitu linearitas. Linearitas merupakan kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Linieritas biasanya digunakan untuk memperoleh hubungan proporsional antara hasil pengukuran dengan konsentrasi analit. Untuk membuat suatu larutan sandar, biasanya digunakan satu seri larutan yang berbeda konsentrasinya antara 50 150% kadar analit dalam sampel dan dibuat sekurang-kurangnya delapan buah larutan (Harmita, 2004). Namun,

pada praktikum ini, hanya dibuat 4 larutan standar, dengan anggapan 4 lartan standar sudah cukup untuk membuat kurva kalibrasi dan menentukan linearitas. Larutan standar yang dibuat mengandung quinin sulfat masing masing 200 ng, 400 ng, 800 ng, dan 1600 ng. Pelarut yang digunakan dalam pembuatan larutan adalah methanol. Pelarut ini digunakan karena dapat melarutkan quinin sulfat. Selain itu, methanol tidak menyerap cukup banyak cahaya dalam daerah UV-Vis. Methanol memiliki titik batas transparansi minimum sebesar 210 nm pada daerah UV-Vis sehingga tidak menimbulkan masalah saat pengukuran pada daerah spektrum quinin (Underwood and Day, 1998). Penetapan kadar quinin dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu preparasi larutanlarutan, ekstraksi, KLT, dan analisis dengan spektrofotodensitometer. Larutan blanko, larutan uji, dan sampel diekstraksi terlebih dahulu dengan metode ekstraksi cair-cair. Ekstraksi ini bertujuan untuk memisahkan quinin dari senyawa-senyawa pengotor dalam urin. Setelah terpisah dari pengotor, dilakukan lagi pemisahan, yaitu dengan KLT yang bertujuan untuk memisahkan quinin dari metabolitnya, yaitu hidroksiquinolin. Pemisahan dengan KLT dilakukan terhadap semua larutan, termasuk larutan standar. Setelah dipisahkan dengan KLT, plat disemprot dengan asam sulfat 0,1 N, lalu dianalisis dengan spektrofotodensitometer mode fluoresensi, dimana intensitas fluoresesni akan berbanding lurus dengan berat quinin sulfat. Ekstraksi cair-cair dilakukan terhadap semua larutan, kecuali larutan standar karena matriks larutan standar bukan urin. Agar jumlah quinin yang terekstraksi maksimal, quinin diharapkan berada dalam bentuk bebasnya. Untuk mendapatkan bentuk bebasnya, quinin harus dibuat berada dalam suasana basa. Oleh karena itu, sebelum dilakukan ekstraksi, dilakukan penambahan amonia pekat sebanyak 0,1 mL sehingga pH larutan berada pada rentang 9 10. Rentang pH ini dipilih karena berdasarkan perhitungan, jumlah quinin yang berada dalam bentuk bebas pada rentang ini adalah 97 %. Ekstraksi dilakukan menggunakan larutan kloroform-isopropanol (3:1). Penggunaan kloroform-isopropanol ditujukan untuk memisahkan quinin dari pengotor-pengotor dan metabolitnya yang bersifat polar hingga semipolar. Quinin akan terekstraksi dalam fase kloroform, sedangkan komponen urin yang terdiri dari air, magnesium, kalsium, metabolit quinin yang bersifat polar hingga semipolar akan terekstraksi pada fase isopropanol. Dalam fase kloroform diharapkan hanya terdapat quinin dan komponen lain dalam urin yang bersifat nonpolar.

Proses ekstraksi dilakukan dengan menggunakan vortex yang bertujuan untuk membentuk emulsi pada masing-masing tabung. Pembentukan emulsi menyebabkan peningkatan luas permukaan kontak antara analit dan larutan pengekstraksi, sehingga semakin banyak quinin yang terikat pada kloroform dan proses ekstraksi quinin akan menjadi lebih maksimal. Masing-masing tabung selanjutnya disentifugasi untuk memisahkan fase kloroform dengan fase isopropanol. Karena berat jenis kloroform lebih besar daripada isopropanol, maka fase kloroform akan berada di bawah. Fase kloroform diambil, dimasukkan ke dalam effendorf, dan diuapkan menggunakan tangas air pada suhu 60oC, agar pelarut kloroform menguap. Suhu yang digunakan untuk penguapan adalah 60oC karena suhu tersebut merupakan titik uap dari pelarut kloroform (Anonim,1995). Ekstrak quinin direkontitusi menggunakan 25 L methanol untuk selanjutnya dipisahkan dengan KLT. Pemisahan dengan KLT bertujuan untuk memisahkan quinin dari metabolitnya yang juga bersifat nonpolar, yaitu hidroksiquinolin. Untuk itu, digunakan sistem fase gerak TA karena sistem ini memberikan pemisahan yang baik untuk kedua senyawa tersebut, dimana hRf quinin dengan sistem ini adalah 51 (Moffat et al, 2004). Berdasarkan sistem TA, fase gerak yang digunakan adalah campuran methanol amonia kuat (100 : 1,5). Plat yang digunakan dalam pemisahan ini adalah silika G60. Plat ini dipilih karena tidak memberikan fluoresensi. Mode yang digunakan pada analisis dengan spektrofotodensitometer adalah fluoresensi, sehingga jika digunakan plat KLT yang juga berflouresensi, quinin yang terelusi dalam plat tidak akan terdeteksi karena adnya flouresensi yang diberikan oleh plat, akibatnya proses analisis akan terganggu. Setelah dilakukan pemisahan dengan KLT, plat yang telah dielusi disemprot dengan larutan asam sulfat 0,1 N. Penyemprotan bertujuan untuk membentuk quinin sulfat yang mampu berfluoresensi. Selain itu, penambahan asam sulfat bertujuan meningkatkan intensitas fluoresensi quinin sulfat yang terbentuk karena quinin sulfat mampu berluoresensi pada suasana asam. Pada preparasi semua larutan, larutan qunin yang digunakan merupakan quinin sulfat, namun penambahan amonia kuat saat ekstraksi dapat mengubah quinin sufat menjadi quinin bebas. Fluoresensi yang diberikn quinin bebas lebih lemah dibandingkan quinin sulfat, karenanya perlu disemprot dengan asam sulfat 0,1 N. Plat yang telah disemprot di-scan dengan spektrofotodensitometer mode floresensi pada panjang gelombang 255 nm karena memberikan absorbsi yang maksimum.

Hasil dari scanning yang dilakukan berupa data AUC, Rf, kromatogram, dan spektra. Kromatogram yang dihasilkan dicocokkan dengan kromatogram library alat spektrofotodensitometer untuk mengetahui apakah senyawa yang diidentifikasi tersebut adalah quinin. Untuk mencocokkan kromatogram, dilakukan pembandingan harga Rf dan kesesuaian pola spektrum yang dihasilkan masing-masing puncak. Berdasarkan literatur harga hRf quinin dengan pemisahan menggunakan sistem TA adalah 51 (Moffat et al, 2004). Setelah dilakukan pembandingan, diperoleh bahwa nilai hRf quinin yang dihasilkan tidak sesuai dengan literatur, dimana kisaran hRf yang diperoleh adalah antara 64 70. Hal tersebut disebabkan oleh perbedaan kondisi lingkungan (pH, suhu, kelembaban, dll) serta perbedaan kondisi kejenuhan chamber saat praktikum dilakukan dengan percobaan yang dilakukan pada literatur. Spektra yang diperoleh dari masing-masing track, menunjukkan kemiripan yang berarti senyawa yang diidentifikasi memang benar quinin sulfat. Berdasarkan data hasil scan, diperoleh bahwa pada track 1 (blanko) tidak ditemukan adanya quinin sulfat. Selain pada track 1, pada track 6 dan 8 yang merupakan larutan standar juga tidak ditemukan adanya quinin sulfat. Seharusnya pada track tersebut ditemukan quinin sulfat. Hal ini terjadi karena konsentrasi larutan standar yang dibuat sangat kecil (ng) sehingga dalam melakukan pengenceran untuk pembuatan larutan standar seharusnya digunakan pipet mikro, namun pada praktikum ini pengenceran dilakukan menggunakan pipet volume 0,1 mL. Karenanya, ada kemugkinan quinin sulfat tertinggal pada dinding pipet sehingga larutan yang dihasilkan tidak mengandung quinin sulfat. Dari data yang didapatkan dilakukan sejumlah validasi metode meliputi permbuatan kurva kalibrasi dan persamaan regresi, perhitungan persen perolehan kembali, perhitungan LOD dan LOQ, dan perhitungan kadar quinin dalam sampel. Pembuatan kurva kalibrasi dilakukan dengan cara memplot AUC yang dihasilkan dari masing-masing standar terhadap konsentrasi. Karena dari 4 larutan standar yang dibuat, hanya 2 yang terdeteksi, maka kurva kalibrasi dibuat menggunakan 2 data saja. Kurva kalibrasi yang diperoleh adalah sebagai berikut.

Dengan menggunakan persamaan kurva kalibrasi yang diperoleh, dilakukan perhitungan konsentrasi qunin sulfat dalam ketiga larutan uji berdasarkan data AUC. Perhitungan konsentrasi larutan uji bertujuan untuk menghitung perolehan kembali, LOD, dan LOQ. Untuk larutan uji 1 dan 2 diperoleh hasil negatif. Hal ini berarti jumlah quinin sulfat yang terdeteksi pada kedua track tersebut berada di luar rentang konsentrasi kurva kalibrasi. Untuk larutan uji 3, diperoleh konsentrasi 87,6918 ng dengan perolehan kembali 4,3846 %. Persen perolehan kembali yang diperoleh sangat rendah, bahkan pada larutan uji 1 dan 2 tidak terdeteksi adanya quinin sulfat. Hal ini dapat disebabkan karena kesalahan pada saat pembuatan larutan uji. Untuk pembuatan larutan dengan konsentrasi yang rendah (ng/mL), pemipetan larutan seharusnya dilakukan menggunakan pipet mikro. Namun, pada praktikum ini praktikan tidak menggunakan pipet mikro, sehingga ada kemungkinan larutan baku sekunder quinin sulfat yang dipipet tertinggal pada dinding pipet sehingga konsentrasi yang ingin dibuat menjadi tidak tepat. Pada setiap metode penelitian seharusnya dilakukan perhitungan LOD dan LOQ untuk larutan standar dan larutan uji. Perhitungan untuk larutan standar bertujuan untuk menentukan LOD dan LOQ alat terhadap sejumlah senyawa yang mampu diukur. Sedangkan perhitungan untuk larutan uji bertujuan untuk mengetahui kesesuaian metode terhadap jumlah senyawa dalam sampel yang mampu terukur. Namun, pada praktikum ini tidak dapat dilakukan perhitungan LOD dan LOQ. Hal ini disebabkan karena konsentrasi larutan uji 1 dan 2 tidak dapat ditentukan dengan kurva kalibrasi. Dengan menggunakan kurva kalibrasi, dilakukan perhitungan konsentrasi quinin sulfat dalam sampel. Adapun massa quinin sulfat yang diperoleh adalah 38,4771 ng. Volume sampel

yang dianalisis adalah 2 mL, sehingga kadar quinin sulfat dalam sampel adalah 38,4771 ng setiap 2 mL atau 19,2385 ng/mL. Konsentrasi quinin sulfat yang diperoleh masih berada dalam rentang konsentrasi kurva kalibrasi. Namun, kurva kalibrasi yang digunakan untuk menghitung konsentrasi sampel dibuat hanya menggunakan 2 data. Oleh karena itu, konsentrasi quinin sulfat yang diperoleh berdasarkan perhitungan menggunakan kurva kalibrasi tersebut tidak valid. IX. KESIMPULAN
1.

Persamaan regresi linier untuk kurva baku yang diperoleh, yaitu y = 16,81 x + 6706 Berdasarkan perhitungan, kadar quinin sulfat dalam sampel adalah 38,4771 ng Kurva kalibrasi yang digunakan untuk menghitung konsentrasi sampel dibuat hanya

dengan r2 = 1 2.
3.

setiap 2 mL atau 19,2385 ng/mL. menggunakan 2 data, sehingga konsentrasi quinin sulfat yang diperoleh tidak valid.

DAFTAR PUSTAKA Anonim. 2005. Pedoman Uji Bioekivalensi. Jakarta : Badan Pengawas Obat dan Makanan. Camag. 1999. Welcome to the CAMAG Wincats tutorial: Wincats planar chromatography. Switzerland: CAMAG. Galichet, Y. L. 2004. Clarke's Analysis of Drugs and Poison In Pharmaceuticals, Body Fluids, and Postmortem Material. London: The Bath Press. Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rohman. 2007. Kimia Analisis Farmasi . Yogyakarta : Pustaka Pelajar. Hahn-Deinstrop,E. 2007. Applied Thin-Layer Chromatography Best Practice and Avoidance of Mistakes, Second, Revised and Enlarged Edition. New York: John Wiley and Sons. Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode Dan Cara Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian, Departemen FMIPA-UI. Jakarta. Kusmardiyani, S. dan A. Nawawi. 1992. Kimia Bahan Alam. Jakarta: Universitas Bidang Ilmu Hayati. Lubis, Syamsidah. 2009. Efikasi Gabungan Kinin Doksisiklin Dibandingkan dengan Kinin Azithromycin pada Pengobatan Malaria Falciparum Tanpa Komplikasi pada Anak. (sited: 2010 Sept, 27). Avilable at: http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/6282/1/10E00153.pdf Lawrence. 2007. USP/NF 25. USA: The Official Compendia of Standards. McEvoy, G. K. 2002. AHFS Drug Information. USA: American Society of Health System Pharmacist. Moffat, C.A., M. D. Osselton, and B. Widdop. 2005. Clarkes Analysis of Drugs and Poisons, In Pharmaceuticals, Body Fluids, and Postmortem Material, 3rd Edition. Pharmaceutical Press Mulja, M. dan Sukarman. 1995. Analisis Instrumental. Surabaya: Airlangga University Press. Mutschler, E. 1991. Dinamika Obat, Edisi V. Bandung : Penerbit ITB. Schunack, W., Mayer K., and Haaeke M. 1990. Buku Pelajaran Kimia Farmasi Edisi 2. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Sherma, J. and B. Fried. 1996. Handbook of Thin-Layer Chromatography Third Edition. New York: Marcel Dekker Inc. P.147-149. London:

Wasito, Hendri. -. Analisis Obat Dalam Berbagai Cairan Biologis. Jawa Tengah : Jurusan Farmasi FKIK Universitas Jenderal Soedirman. Wirasuta, IMAG. 2008. Buku Ajar Analisis Toksikologi Forensik. (Sited 2010, Sept 26). Available at : http://www.scribd.com/doc/27303128/Analisis-Toksikologi-Forensik