Manual

Normas generales y conocimiento del laboratorio de microbiologa
ndice ndice Introduccin _______________________________________________________ 0 1 Normas generales y conocimiento del laboratorio de microbiologa _____________ 0 2 Gua de microscopio _________________________________________________ 1 4 Mtodos de siembra _________________________________________________ 2 6 Coloracin de Gram _________________________________________________ 3 2 Medios de cultivo ___________________________________________________ 3 8 Distribucin de los microorganismos en el medio __________________________ 4 5 Clasificacin de los microorganismos segn su temperatura de crecimiento _______ 4 9 Control microbiano por agentes qumicos ________________________________ 5 9 Obtencin de hongos a partir de la tierra _________________________________ 6 6 Gua prctica anlisis de aguas _________________________________________ 7 1 Determinacin de sustancias inhibidoras del crecimiento bacteriano ____________ 7 8 Control microbiolgico de manipuladores ________________________________ 8 5 Control de calidad de cosmticos _______________________________________ 8 9 Curva de crecimiento bacteriano _______________________________________ 9 3 Fermentacin alcohlica - elaboracin del vino ____________________________ 9 9 Fermentacin lctica - elaboracin del yogurt _____________________________ 1 0 5 Bibliografa _______________________________________________________ 1 1 0

Introduccin
Introduccin
La microbiologa es la rama de la Biologa que estudia los fenmenos de dependencia entre dos seres vivos. Histricamente los microorganismos han sido asociados a procesos infecciosos del hombre, plantas y animales y atendemos con urgencia los microorganismos patgenos, ignorando en muchos casos y siendo indiferentes con aquellos que son un aporte fundamental en el desarrollo de los procesos biolgicos, trascendentales en los entornos naturales, con capacidad transformadora y productiva en procesos industriales como en la produccin de pan, bebidas alcohlicas, productos lcteos, antibiticos , hormonas, y enzimas entre otros. En los laboratorios de Microbiologa, el buen uso del microscopio, la aplicacin de tcnicas de cultivo indicadas para diagnstico, estudios epidemiolgicos, investigacin biotecnolgica, permite avances cientficos y tecnolgicos que propenden por el bienestar de los seres vivos. Es as como cada vez se profundiza ms en los estudios fisiolgicos, genticos y evolutivos de los microbios, lo que permite entender su comportamiento en hbitat naturales, su reaccin ante medios adversos, sus cambios biolgicos cclicos que sorprenden al mas incauto y motivan al cientfico visionario. La Ciencia, ha convertido a estos seres microscpicos en herramientas de trabajo que nos inquietan por su dominio en el mundo y por la participacin que tienen cada da en la vida cotidiana. El profesional de tecnologa qumica cada da ampla su campo laboral en muchas industrias que tienen que ver con diferentes tpicos de la Microbiologa, es por eso que surge la necesidad de elaborar un manual de practicas de laboratorio que permitan dar una visin global de esta rea del conocimiento, de forma tal que le proporcione al futuro egresado las herramientas necesarias para ejercer su rol profesional.
Introduccin
La microbiologa es una ciencia que a travs de la observacin y de la experimentacin distingue las formas biolgicas, microscpicas que interactan con el hombre y en general con el medio. El laboratorio de microbiologa es un lugar convenientemente habilitado donde con las debidas precauciones, se puede manejar y examinar microorganismos. Cuando se maneja cualquier tipo de muestra se debe tener en cuenta la posibilidad de riesgos que pueden ser biolgicos, del ambiente de laboratorio o riesgos asociados como el manejo de sustancias qumicas, elctricas, fugaz de gas. Todos los microorganismos que se manipulen deben ser manejados con precaucin por su potencial patogenicidad. Las medidas de seguridad en laboratorios, son un conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud de los que all se desempean frente a los riesgos propios derivados de la actividad, para evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro de su mbito de trabajo, como hacia el exterior. Ser fundamental la realizacin meticulosa de cada tcnica, pues ninguna medida, ni siquiera un equipo excelente puede sustituir el orden y el cuidado con que se trabaja.
Objetivos
Inculcar la necesidad y la importancia de las medidas preventivas y elementos de bioseguridad del laboratorio de microbiologa para garantizar un optimo resultado del trabajo realizado Desarrollar en el estudiante la capacidad de afrontar situaciones de emergencia en la forma ms adecuada y pertinente que garanticen su integridad Ofrecer herramientas para que el estudiante conozca acerca de la instrumentacin y equipos utilizados en el laboratorio de microbiologa
Recomendaciones
1. Se deber conocer la ubicacin de los elementos de seguridad en el lugar de trabajo, tales como: matafuegos, salidas de emergencia, mantas ignfugas, lavaojos, gabinete para contener derrames, accionamiento de alarmas, etc.

2. No se permitir comer, beber, fumar o maquillarse. 3. No se debern guardar alimentos en el laboratorio, ni en las heladeras que contengan material de laboratorio. 4. Se deber utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio y cabello recogido (guardapolvo preferentemente de algodn y de mangas largas, zapatos cerrados, evitando el uso de accesorios colgantes). 5. Las manos deben lavarse cuidadosamente despus de cualquier manipulacin de laboratorio y antes de retirarse del mismo. 6. Se debern utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias qumicas o material biolgico. Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no deber tocar objetos, ni superficies, tales como: telfono, lapiceros, manijas de cajones o puertas, cuadernos, etc. 7. No se permitir correr en los laboratorios. 8. Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos se utilizarn anteojos de seguridad, viseras o pantallas faciales u otros dispositivos de proteccin. Cuando se manipulen productos qumicos que emitan vapores o puedan provocar proyecciones, se evitar el uso de lentes de contacto. 9. No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con equipos, mquinas u otros elementos que entorpezcan la correcta circulacin. 10. Se requerir el uso de mascarillas descartables cuando exista riesgo de produccin de aerosoles (mezcla de partculas en medio lquido) o polvos, durante operaciones de pesada de sustancias txicas o biopatgenas, apertura de recipientes con cultivos despus de agitacin, etc. 11. El material de vidrio roto no se depositar con los residuos comunes. Ser conveniente ubicarlo en cajas resistentes, envuelto en papel y dentro de bolsas plsticas. El que sea necesario reparar se entregar limpio al taller. 12. Utilice los recipientes adecuados para depositar los residuos peligrosos biolgicos infecciosos que se generen en la realizacin de la prctica. 13. Est prohibido descartar lquidos inflamables o txicos o corrosivos o material biolgico por los desages de las piletas, sanitarios o recipientes comunes para residuos.

14. Los laboratorios contarn con un botiqun de primeros auxilios con los elementos indispensables para atender casos de emergencia. 15. Cuando utilice luz ultravioleta debe tomarse en cuenta que la exposicin a esa radiacin es peligrosa. 16. Es estrictamente prohibido retirar del laboratorio cultivos o cepas a menos que el profesor lo indique. 17. Cuando se manipulen microorganismos evite hablar
Como actuar frente a emergencias

Si ocurre una emergencia tal como: cortes o abrasiones, quemaduras o ingestin accidental de algn producto qumico, txico o peligroso, se deber proceder: 1. A los accidentados se les proveern los primeros auxilios. 2. Marcar el telfono 411, en caso de tener alguna emergencia en la universidad. 3. Avise al Jefe de Laboratorio o autoridad del Departamento, quienes solicitarn asistencia de la Secretara Tcnica (interno 380) para que enven personal del Dpto. de Mantenimiento, Seguridad y Control o Servicios Generales segn correspondan. 4. El Jefe de Departamento notificar el accidente al Servicio de Higiene y Seguridad para su evaluacin e informe, donde se determinarn las causas y se elaborarn las propuestas para modificar dichas causas y evitar futuras repeticiones.
Incendio
1. Mantenga la calma. Lo ms importante es ponerse a salvo y dar aviso a los dems. 2. Si hay alarma, accinela. Si no grite para alertar al resto. 3. Se dar aviso inmediatamente al Dpto. de Seguridad y Control informando el lugar y las caractersticas del siniestro. 4. Si el fuego es pequeo y sabe utilizar un extintor, selo. Si el fuego es de consideracin, no se arriesgue y manteniendo la calma ponga en marcha el plan de evacuacin. 5. Si debe evacuar el sector apague los equipos elctricos y cierre las llaves de gas y ventanas. 6. Evacu la zona por la ruta asignada. 7. No lleve consigo objetos, pueden entorpecer su salida. 8. Si pudo salir por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos especializados se encarguen.

Derrame de productos qumicos
1. Atender a cualquier persona que pueda haber sido afectada. 2. Notificar a las personas que se encuentren en las reas cercanas sobre el derrame. Coloque la cinta de demarcacin para advertir el peligro. 3. Evacuar a toda persona no esencial del rea del derrame. 4. Si el derrame es de material inflamable, apagar las fuentes de ignicin, y las fuentes de calor. 5. Evite respirar los vapores del material derramado, si es necesario utilizar una mscara respiratoria con filtros apropiados al tipo de derrame. 6. Ventilar la zona. 7. Utilizar los elementos de proteccin personal tales como equipo de ropa resistente a cidos, bases y solventes orgnicos y guantes. 8. Confinar o contener el derrame, evitando que se extienda. Para ello extender los cordones en el contorno del derrame. 9. Luego absorber con los paos sobre el derrame. 10. Deje actuar y luego recoger con pala y colocar el residuo en la bolsa roja y cirrela. 11. Comunquese con el Servicio de Higiene y Seguridad para disponer la bolsa con los residuos. 12. Si el derrame es de algn elemento muy voltil deje dentro de la campana hasta que lo retire para su disposicin. 13. Lave el rea del derrame con agua y jabn. Seque bien. 14. Cuidadosamente retire y limpie todos los elementos que puedan haber sido salpicados por el derrame. 15. Lave los guantes, la mscara y ropa.
Consideraciones para el trabajo microbiologa
en un laboratorio de
1. Mantenga el puesto de trabajo solo con el material necesario, disponga del material de tal manera que pueda usarlo en forma cmoda y segura. 2. Rotule claramente sus cajas de cultivo, placas, tubos, etc., con indicaciones concretas. 3. El asa debe ser esterilizada antes y despus de su uso. Luego, debe colocarse en posicin vertical en el soporte para tal fin. 4. Utilice con cuidado los equipos y aparatos de laboratorio. selos como si fueran propios.

5. Trabaje siempre con el mechero prendido. 6. Tenga cuidado con las preparaciones teidas, sobretodo si son potencialmente patgenos, ya que en el proceso de coloracin no garantiza que se haya perdido su poder infectante. 7. El material usado debe recibir, generalmente la siguiente secuencia de tratamiento. Esterilizacin Lavado Secado Esterilizacin (envuelto) Almacenamiento 8. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes. 9. Las prcticas que produzcan gases, vapores, humos o partculas, aquellas que pueden ser riesgosas por inhalacin deben llevarse a cabo bajo campana 10. Cuando sea necesario manipular grandes cantidades de materiales inflamables (ms de 5 Litros) deber tenerse a mano un extintor apropiado para ese material en cuestin. 11. La temperatura del medio de cultivo debe ser la correcta (45-50C) de tal manera que al mezclarlo con las muestras no sean inactivados los grmenes. 12. Hacer siempre control de esterilizacin del medio de cultivo. 13. En caso de rompimiento de tubos o cajas de petri con cultivos microbiano, cubrir el tubo o la caja con hipoclorito de sodio al 2% o fenol al 5%. Tapar con una hoja de papel peridico y dejar sedimentar los aerosoles durante media hora, luego recoger el material envolverlo en papel, y llevarlo a esterilizacin antes de descartarlo. 14. El medio recin preparado y esterilizado se distribuye en caja de petri para su uso inmediato en cultivos en superficie, en este caso las cajas deben secarse antes de su inoculacin para evitar difusin y confluencia de colonias. 15. Desinfecte la mesa de trabajo al terminar cada sesin de laboratorio. 16. El secado del medio de cultivo, puede hacerse en la cabina de flujo laminar con las cajas destapadas.

17. Esterilice el material contaminado antes de desecharlo. 18. Una vez finalizada la practica descarte el material que ha estado en contacto con microorganismos tales como guantes tapabocas etc. en las bolsas rojas que se encuentran ubicadas en el laboratorio.
Conceptos bsicos de la seguridad biolgica Agentes biolgicos (segn RD 664/97): Microorganismos, con inclusin de los
genticamente modificados, cultivos celulares y endoparsitos humanos susceptibles de originar cualquier tipo de infeccin, alergia o toxicidad.
Microorganismo (segn RD 664/97): Toda entidad microbiolgica, celular o no, capaz de

reproducirse o de transferir material gentico.
Cultivo celular (segn RD 664/97): El resultado del crecimiento in Vitro de clulas

obtenidas de organismos multicelulares.
Peligro : Todo aquello que puede producir un dao o un deterioro de la calidad de vida individual o
colectiva de las personas.
Dao : Es la consecuencia producida por un peligro sobre la calidad de vida individual o colectiva de las
personas.
Riesgo : Probabilidad de que ante un determinado peligro se produzca un cierto dao, pudiendo por
ello cuantificarse.
Desinfeccin (segn la OMS): Eliminacin de agentes infecciosos que estn fuera del
organismo por medio de la exposicin directa a agentes qumicos o fsicos.
Contaminacin (segn la OMS): Presencia de un agente infeccioso en la superficie del

organismo; tambin en vestimenta, ropa de cama, juguetes, instrumentos quirrgicos, apsitos u otros objetos inanimados o substancias, incluyendo el agua y los alimentos.
Esterilizacin (segn la OMS): Destruccin de todas las formas de vida por calor, radiacin,
gas o tratamiento qumico.
Limpieza (segn la OMS): Eliminacin, mediante fregado y lavado con agua caliente, jabn o un
detergente adecuado, o por el empleo de una aspiradora, de agentes infecciosos y substancias orgnicas de superficies en las cuales stos pueden encontrar condiciones adecuadas para sobrevivir o multiplicarse.
Procedimiento que se debe seguir para ingresar a un laboratorio de microbiologa

Implementos usados en el laboratorio de microbiologa Laboratorio : Es el sitio donde se van a estudiar las muestras, deben contar con las instalaciones
necesarias, as como muebles, material equipos.
Superficies interiores : Los suelos, paredes, techo, deben ser impermeables al agua y
resistentes a diferentes productos qumicos, de modo que facilite la limpieza y posterior descontaminacin.
Superficies de trabajo : Las mesas y bancos de trabajo deben ser resistentes al calor, a
disolventes orgnicos, cidos y lcalis.
Cabinas de seguridad : Son recintos ventilados para limitar al mximo el riesgo del
personal del laboratorio expuestos a agentes infecciosos.
Lava ojos : Es usado como equipo de emergencia. Lavabo : Debe existir uno dentro del laboratorio, estar dotado de grifos que puedan accionarse sin
utilizar las manos.
Autoclave : Es un equipo para la esterilizacin y desinfeccin del material del laboratorio, debe
tenerse especial cuidado en el control de la presin interna, ya que un incremento por encima de 15 psi ocasionar una explosin de este instrumento, sin embargo la regulacin de la presin interna por debajo de los 15 psi tambin se hace importante, ya que un cambio brusco ocasionado por levantamiento de la vlvula de control provocar un rompimiento del material de vidrio que se encuentra esterilizado.
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Incubadora : Aseguran temperatura constante para cultivar bacterias. Las incubadoras deben tener
una temperatura fija de mas o menos 35oC, durante muchos aos se ha considerado la temperatura ptima de 37oC mas o menos 2oC, pero existen microorganismos patgenos muy exigentes donde creen bien a 35oC y un incremento de 2oC seria tolerable, pero a 37oC un intermedio de 2oC sera irresistible.
Refrigeradores : Se usan con el fin de almacenar reactivos y medios de cultivos ya preparados.

Deben ajustarse la temperatura cerca de 4oC con el fin de retrasar la multiplicacin bacteriana, aumentando as su vida media.
Centrfuga : Permite la separacin rpida de bacterias del liquido donde est suspendidas. Balanza : Cuando se preparan los reactivos, se deben utilizar balanzas cuya exactitud se verifique
frecuentemente.
Cristalera : Frascos, vasos de precipitado, erlenmeyers, tubos de ensayo probetas y morteros

deben ser previamente esterilizados.
Cajas de Petri : Recipientes planos de vidrio, destinados para los medios de cultivos que
contengan agar (slidos).
Porta objetos : Son lminas de un vidrio muy delgadas. Para desengrasarlas se deben colocar en
una solucin de ter ms alcohol, lavarlas con agua corriente y hervirlas con solucin detergente por 30 minutos.
Asas para Siembra : Consisten un alambre fabricado en nquel-cromo encabado en un

mango que lo sostiene.
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Mecheros : Instrumento de laboratorio utilizado como fuente de calor directo, su funcionamiento es
a base de gas o alcohol, es de vital importancia un control sobre su llama y est no debe ser aproximada a materiales inflamables.
Taller 1. Indique si las siguientes afirmaciones son falsas o verdaderas.

Todo el material de desecho de laboratorio se deposita en una sola caneca. SI ___ NO ___ No colocar objetos personales sobre los mesones. SI ___ NO ___ Los implementos de proteccin personal como guantes, tapabocas pueden ser reutilizables siempre y cuando no se utilicen sustancias altamente contaminantes. SI ___ NO ___ No hablar mientras se este realizando un procedimiento de siembra o cultivos. SI ___ NO ___
2. Cules son las normas generales de utilizacin de equipos y especifique la importancia.

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3. Qu son agentes cultivos celulares.
biolgicos,
microorganismos
Agente biolgico : _________________________________________________________

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Microorganismo : __________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
Cultivos celulares : _____________________________________________________

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4. Para qu se utiliza la autoclave.

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5. Enumere laboratorio.
Normas
cinco
normas
recomendaciones
de
Recomendaciones
1. __________________________ 2. __________________________ 3. __________________________ 4. __________________________ 5. __________________________
1. __________________________ 2. __________________________ 3. __________________________ 4. __________________________ 5. __________________________
6. Explique el procedimiento correcto para trabajar en una cmara de flujo laminar.

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Gua de microscopio
Introduccin
Desde la antigedad muchas personas descubrieron ciertas maneras de ver los objetos aumentados de tamao. Una gota de roco, por ejemplo, nos permite ver con mayor detalle la superficie sobre la cual se deposita. Este efecto, con seguridad se repiti, cuando el hombre fue capaz de descubrir el vidrio y fabricar lentes. Hacia el ao 1300 en Holanda, comenz el auge de la utilizacin de lentes en la fabricacin de lupas o cristales de gafas para mejorar la visin. Estas tenan poco aumento, hasta que se descubri que las lentes convexas empleadas para corregir la presbicia, serva tambin para ver los objetos aumentados de tamao. Se afirma que fueron dos Holandeses fabricantes de lentes, Hans y Zacharias Janssen, quienes hacia el ao 1600 inventaron el microscopio de una manera rudimentaria. En efecto, colocaron una lente convexa en cada uno de los extremos de un tubo y comprobaron que mirando a travs de l, los objetos se vean de mayor tamao. Galileo, en 1610, se convirti en el gran difusor de las bondades del microscopio, pero ya en aquella poca existan investigadores para quienes el uso de este aparato resultaba indispensable. El microscopio es una ayuda importante en el laboratorio de microbiologa, el cual proporciona amplificaciones de elementos y estructuras que son invisibles con la simple inspeccin ocular, este nos es de gran apoyo para as lograr diferenciar y caracterizar elementos.
Objetivos
Al finalizar los laboratorios de microscopio el estudiante estar en capacidad de: Describir las partes del microscopio y manejar adecuadamente cada una de ellas Realizar diferentes enfoques utilizando todos los objetivos Reconocer la importancia del microscopio como instrumento bsico en microbiologa
Microscopio
El microscopio es un instrumento esencial en el laboratorio de microbiologa; permite observar microorganismos y estructuras que no son visibles a simple vista. Con el microscopio se consigue un amplio margen de aumento ptico del objeto a observar. Existen varios tipos de microscopios y se han desarrollado varios mtodos que permiten examinar con gran detalle las muestras que contienen microorganismos. Las clulas y tejidos no coloreados se captan en el microscopio como falto de color y
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Gua de microscopio
transparente, con poca estructura interna, puesto que no presentan suficiente contraste. Con la ayuda de coloraciones histolgicas se consigue una absorcin diferencial de luz de modo que las distintas estructuras se visualizan. La palabra microscopio viene de micro y del gr. Skopein que significa mirar, examinar. El microscopio es un instrumento ptico que sirve para aumentar considerablemente la imagen de los objetos muy diminutos. Con el microscopio de luz las preparaciones teidas son observadas por transiluminacin. El microscopio est compuesto de una parte mecnica y una parte ptica (sistema de lentes).
Parte mecnica
Entre ellas podemos encontrar el pie o pedestal que va a adquirir diversas formas tales como circular, cuadrada, rectangular y semilunar. Tambin va a estar compuesto por el tornillo macromtrico (enfoca la imagen) y por el micromtrico (afina la imagen); ambos tornillos se encuentran en el asa o brazo del microscopio; y por el otro lado vamos a encontrar al porta objetos, carro de movimientos que nos van a permitir deslizar el portaobjetos hacia abajo, arriba y a los costados. Las pinzas van a sostener la lmina porta objetos. En la subplatina vamos a encontrar el condensador, que va a concentrar la luz para poder observar la imagen, tiene un tornillo que permite hacer ascenso y descenso. Tambin vamos a tener al diafragma que es una serie de lminas sobrepuestas que se abren y cierran permitiendo el paso de luz; por debajo de este encontramos filtros que son de color azul que van a transformar la luz amarilla en luz blanca. En la parte inferior encontramos el espejo que puede ser plano con una cara cncava.
Parte ptica
En cuanto a la parte ptica el microscopio va a usar lentes convergentes: plano convexa, biconvexa, cncavo-convexa; y est compuesta por tres sistemas de lentes: condensador, objetivos, oculares.
El condensador proyecta un rayo cnico de luz para iluminar el objeto a ser observado. Los objetivos aumentan el tamao de la imagen y la proyectan en direccin de los lentes
oculares. Son varios y adecuados al revolver porta objetivo; en la parte inferior tiene una lente frontal plano convexa, y en la superior una sucesin de lentes correctores. Van a tener aumentos de 4x (pequeo aumento), 10x (mediano aumento), 40x (gran aumento), 100x (inmersin).
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El ocular aumenta mucho ms la imagen y la proyecta a la retina del observador o a las
pantallas. El ocular es el responsable del aumento de la imagen, ste va a estar dado por un sistema de lentes dado por oculares que son tubos huecos que tienen una lente superior e inferior planaconvexa (aumentos de 4x, 15x, 20x).
Partes del microscopio Componentes del microscopio

Los diversos componentes del microscopio se pueden agrupar en cuatro sistemas: 1. El sistema de soporte 2. El sistema de aumento 3. El sistema de iluminacin 4. El sistema de ajuste
1. El sistema de soporte
Consiste en: a. el pie b. el bastidor c. portaobjetivo revlver (cambiador de objetivos) d. la platina e. la platina mecnica, que imprime un movimiento lento y regulado al portaobjetos
2. El sistema de aumento
Consiste en un conjunto de lentes. Las lentes del microscopio se encuentran montadas en dos grupos, uno en cada extremo de un tubo relativamente largo, o tubo del microscopio. - El primer grupo de lentes se halla en el extremo inferior del tubo, inmediatamente arriba de la preparacin que se va a examinar (el objeto), y se denomina objetivo. - El segundo grupo se encuentra en el extremo superior del tubo, por donde mira el microscopista y se llama ocular. a. Los objetivos Aumento El poder de aumento de cada objetivo se indica por un nmero grabado en la manga de la lente: - El objetivo x 10 aumenta 10 veces.
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- El objetivo x 40 aumenta 40 veces. - El objetivo x 100 aumenta 100 veces, (El objetivo x 100 generalmente se encuentra marcado con un anillo rojo para indicar que se debe usar con aceite de inmersin). La abertura numrica (AN) La AN tambin se halla grabada en la manga de la lente, junto a la indicacin del poder de aumento; v.g.: - 0,30 en el objetivo x 10 - 0,65 en el objetivo x 40 - 1,30 en el objetivo x 100 A medida que aumenta la AN es mayor el poder de resolucin (capacidad de hacer perceptibles detalles adyacentes muy cercanos, separndolos y aclarndolos). (Adems, a medida que aumenta la AN disminuyen las dimensiones de la lente frontal montada en la base del objetivo. La lente frontal del objetivo x 100 tiene el tamao de una cabeza de alfiler, por lo que se debe manejar con cuidado.) En la manga del objetivo puede haber otros nmeros: La longitud recomendada en mm para el tubo del microscopio (entre el objetivo y el ocular), es generalmente de 160 mm El grosor recomendado en mm para el cubreobjetos utilizado para tapar el portaobjetos, v.g., 0.17. Las roscas para atornillar todos los objetivos son uniformes, de .r aera que estos se pueden intercambiar en el revlver. Distancia de operacin del objetivo Esta es la distancia que hay entre la lente frontal del objetivo y el portaobjetos cuando la imagen se encuentra enfocada, a medida que el poder de aumento del objeto es mayor disminuye la distancia de operacin. - Objetivo x 10: la distancia de operacin es de 5 - 6 mm. - Objetivo x 40: la distancia de operacin es de 0,5 - 1,5 mm. - Objetivo x 100: la distancia de operacin es de 0,15 - 0,20 mm.
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Poder de resolucin Cuanto mayor sea el poder de resolucin del objetivo ser mas clara la imagen y aumentar la capacidad de poner de manifiesto detalles adyacentes muy cercanos, separndolos y aclarndolos. El poder de resolucin mximo de un buen microscopio de laboratorio mdico es, aproximadamente, de 0,25 m (el poder de resolucin del ojo humano normal es de 0,25 mm). El aceite de inmersin aumenta el poder de resolucin al hacer que se conserven muchos rayos luminosos que se perderan por refraccin al usar un objetivo seco. b. El ocular Aumento El poder de aumento se encuentra marcado en el ocular: - Un ocular x 4 aumenta 4 veces la imagen que produce el objetivo. - Un ocular x 6 aumenta la imagen 6 veces. - Un ocular y 10 aumenta la imagen 10 veces. Si la imagen del objeto se hace aumentar 40 veces mediante el objetivo x 40 y en seguida 6 veces mediante el ocular x 6, el aumento total ser de 6 x 40 = 240. Para calcular el aumento total de la imagen del objeto que se observa, multiplquese el poder de aumento del objetivo por el del ocular. El poder de aumento de los microscopios utilizados en los laboratorios mdicos oscila entre 50 y 1000.
3. El sistema de iluminacin
a. La fuente luminosa De preferencia se emplear luz elctrica, pues es ms fcil de ajustar. Puede proporcionarla un bombillo contenido en el microscopio por debajo de la platina o mediante un bombillo exterior colocado frente al microscopio. De lo contrario se podr utilizar la luz del da. El microscopio nunca se debe utilizar ni debe permanecer bajo la luz directa sol.
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b. El espejo El espejo refleja los rayos de la fuente luminosa sobre el objeto. Por un lado su superficie es plana y cncava por el otro. El lado cncavo constituye un condensador de escaso poder y no se debe usar si ya se cuenta con un condensador propiamente dicho.
c. El condensador El condensador lleva los rayos luminosos a un foco comn sobre el objeto que se habr de examinar. Se encuentra colocado entre el espejo y la platina. Se puede elevar (iluminacin mxima) y bajar (iluminacin mnima). Se debe centrar y ajustar adecuadamente.
d. El diafragma El diafragma, que se encuentra dentro del condensador, se utiliza para reducir o ampliar el ngulo, y por lo tanto, tambin la cantidad de luz que entra en el condensador. Cuanto ms se abre el diafragma mas se ampla el ngulo y en consecuencia aumenta la AN y se pueden observar detalles ms pequeos. Sin embargo, al mismo tiempo se reduce el contraste.
e. Filtros En algunos microscopios se ajustan filtros de colores (principalmente azules) debajo del condensador. Se pueden dejar en su sitio o quitarlos, segn el tipo de preparacin que se vaya a observar.
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4. El sistema de ajuste
Este sistema comprende: 1. La cremallera de avance rpido: es el tomillo mayor. Se utiliza primero para lograr la aproximacin del enfoque. 2. El tornillo micromtrico de avance lento: hace que el objetivo se desplace ms lentamente. Se emplea para conseguir un enfoque perfecto del objeto. 3. El tomillo de ajuste del condensador: se utiliza para elevar el condensador y aumentar la iluminacin o descenderlo y reducir la iluminacin. 4. Los tomillos para centrar el condensador: puede haber tres tomillos colocados alrededor del condensador: uno al frente, uno a la izquierda y uno a la derecha. Se usan para centrar el condensador exactamente en relacin con el objetivo. 5. El elevador del diafragma iris: este es un pequeo elevador que se encuentra fijo al condensador. Se puede mover para cerrar o abrir el diafragma, reduciendo o aumentando as el ngulo y la intensidad de la luz. 6. Reguladores de la platina mecnica: Se utilizan para desplazar el portaobjetos sobre la platina: 1 tornillo lo desplaza hacia atrs y hacia adelante 1 tomillo lo desplaza a la izquierda o la derecha.
Manejo del microscopio

1. Sacar el microscopio de su estuche tomndolo con ambas manos, una que lo sostenga por el soporte y la otra, por la base. 2. Colocarlo suavemente sobre la mesa, de manera que el soporte quede mirando hacia la persona.
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3. Girar el portaobjetivos, hasta que el objetivo de menor aumento coincida con la abertura de la platina. Mirando a travs de l, mover el espejo hasta que la luz atraviese la abertura que tiene la platina; luego ajustar el diafragma para que el campo visual quede iluminado en forma homognea. Si el objetivo o el ocular se encuentran empolvados o empaados, hay que limpiarlos cuidadosamente con un pedazo de papel lente. No se debe usar otro material. 4. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin). 5. Para realizar el enfoque: - Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos. - Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino. 6. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 4. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin. 7. Empleo del objetivo de inmersin: a. Bajar totalmente la platina. b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que echar el aceite. c. Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el de x40. d. Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz. e. Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin. f. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. g. Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersin y la preparacin es mnima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.
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Gua de microscopio
h. Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operacin desde el paso 3. i. Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver. En este momento ya se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin de observacin. j. Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica. Comprobar tambin que el objetivo 40x est perfectamente limpio.
Esta figura muestra como se debe coger el microscopio y como se debe conservar.
Procedimiento El profesor le asignar las diferentes estructuras que se deben observar, realice esquemas con cada uno de los objetivos.
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Gua de microscopio
Complete los siguientes esquemas con los diferentes enfoques realizados en esta practica.
Consulta 1. Qu tipos de microscopios existen y cual es su uso (por lo menos cuatro microscopios diferentes).
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Gua de microscopio
2. Elabora un dibujo del microscopio ptico y seala todas sus partes.
3. Elabora un cuadro donde coloques recomendaciones para el buen cuidado del microscopio incluyendo el mantenimiento y las medidas de precaucin para su conservacin.
4. Dibuja en el cuaderno todos los enfoques realizados con los diferentes objetivos y anota tus propias conclusiones.
5. Si una bacteria mide 0.3 micras, de que tamao se observa al enfocar con cada uno de los objetivos.
_____________________________________________
6. A travs de Internet ingrese a la siguiente pgina y desarrolle el e jercicio planteado all:

http://encina.pntic.mec.es/~esarment/imagenes/practicas/PDescripcionMOp.pdf
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Mtodos de siembra
Objetivos
Desarrollar habilidades para sembrar microorganismos Diferenciar las clases de siembra utilizadas en microbiologa y seleccionar de acuerdo a las condiciones requeridas el tipo mas adecuado de siembra
Conceptos Bsicos
La transferencia de un microorganismo de un ambiente a otro con el propsito de cultivarlos se denomina Siembra, es la tcnica mas usada en el laboratorio de microbiologa, el medio de cultivo donde se van a transferir los microorganismos debe poseer todos los elementos necesarios para permitir la multiplicacin de estos. El asa microbiolgica constituye un instrumento bsico para las siembras, consta de un mango de 20 cm de longitud cuyo extremo lleva adosado un filamento de platino o nicrom que puede terminar en argolla, Estos metales tienen la propiedad de alcanzar rpidamente temperaturas altas cuando se exponen a la llama de un mechero y de enfriarse de nuevo en pocos segundos, lo que permite rapidez en las manipulaciones.
Inoculacin de los medios de cultivo

Toda siembra debe adaptarse a los siguientes principios generales: 1. Practicarla en un medio de cultivo favorable y previamente esterilizado. 2. Emplear instrumentos aspticos. 3. No contaminar ni destruir al inoculo. 4. Depositarla aspticamente en los medios elegidos. 5. Esterilizar los instrumentos empleados antes y despus de cada operacin. La tcnica general de la siembra variara segn el estado fsico del material a sembrar y del medio de cultivo.
Mtodos de cultivo de uso rutinario

Al inocular debe trabajarse siempre dentro del radio de un mechero bunsen (30cm), o en el ambiente dentro de una campana de flujo laminar, ya que, la corriente ascendente del aire que va por la llama, o la
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Mtodos de siembra
corriente de aire del flujo laminar arrastra el polvo u otras partculas con el aire hacia arriba o hacia fuera, impidiendo la contaminacin del medio de cultivo. El asa y la pipeta pasteur deben ser flameadas adecuadamente y enfriadas antes de tocar el inoculo, o el medio de cultivo. A continuacin se describe brevemente los mtodos de cultivo de uso ms rutinario.
Siembra en placas:
La caja debe mantenerse en la palma de la mano izquierda ligeramente inclinada , con la mano derecha se maneja el asa previamente esterilizada , con el asa ya esterilizada se toma una gota del liquido o de la emulsin de la muestra clnica, se deposita en el costado del agar en una caja de petri, se estra a partir de ese punto pasando suavemente el asa en zig-zag por la superficie del agar sin rasparlo, rotar la placa en un tercio y repetir el procedimiento de 2 a 3 veces.
Nota : Observar la demostracin previa del profesor.

En esta tcnica se puede sembrar tanto en forma masiva, o por agotamiento.
Siembra por agotamiento
Siembra en tubos de agar tendido:

El cuello del tubo debe ser flameado antes y despus de ser sembrado. Con el asa previamente esterilizada a la llama, se toma una pequea cantidad de la muestra y se lleva al fondo del tubo, luego se estra suavemente la superficie del medio en forma ondulante. Antes de introducir el tubo a la incubadora, debe dejarse suelto el tapn de goma para evitar que los gases expulsen el tapn.
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Mtodos de siembra
Siembra por picadura:
El inoculo es introducido con el asa recta o pipeta pasteur hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Debe flamearse la boca del tubo antes y despus de la siembra. Antes de introducir el tubo a la incubadora, debe dejarse suelto el tapn de goma para evitar que los gases expulsen el tapn.
Siembra en superficie y picadura:

El inoculo es introducido con el asa recta o pipeta pasteur hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida, se retira hacia la superficie inclinada del agar haciendo suavemente una estra ondulada. Debe flamearse la boca del tubo antes y despus de la siembra. Antes de introducir el tubo a la incubadora, debe dejarse suelto el tapn de goma para evitar que los gases expulsen el tapn.
Siembra en profundidad:
Es el tipo de siembra mas utilizado cuando se realizan anlisis de alimentos .y consiste en colocar primero la muestra de anlisis generalmente 1 ml y luego vertir el medio de cultivo a una temperatura no mayor de 45 C luego homogenizar bien las cajas Tambin se conoce como siembra de vertido en placa.
Incubacin de los medios de cultivo

Los medios de cultivo pueden ser incubados en estufas a 35C en aerobiosis, anaerobiosis, o en atmsfera de CO2. Para aerobiosis se incuban las placas y tubos en estufa de cultivo a 35C; para anaerobiosis se colocan las placas y tubos dentro de una jarra anaerobia y luego de esto se coloca en estufa de cultivo a 35C con un sobre productor de atmsfera anaerobia; para incubar en atmsfera de CO2 se colocan las placas y tubos dentro de una jarra de CO2 y esta se coloca en una incubadora a 35C con un sobre productor de atmsfera microaerofila.
Tipos de colonias microbianas

Cuando se deposita una bacteria en la superficie de un medio slido se divide rpidamente y su progenie se agrupa en una masa de clulas idnticas. Esta masa se denomina colonia y por lo general es visible a simple vista en 24 horas; debido a la extrema variedad de su metabolismo y de su excepcional poder de adaptacin, las comunidades microbianas estn presentes en todos los medios. Las caractersticas de las colonias varan entre diferentes especies y son tiles para ayudar a identificar las especies particulares; las colonias pueden variar de tamao, textura, contorno, margen y color.
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Mtodos de siembra
Actividad prctica Realizar siembra masiva, por profundidad y en tubo
Nota : En toda muestra se debe anotar en forma clara. La fecha, nombre y registro de la muestra.
Preguntas 1. Qu es un cultivo axenico.

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2. Qu es un cultivo diauxico.
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3. Qu es un inculo microbiano.
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4. Escriba tres posibles causas de contaminacin de un cultivo.

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5. Cundo se utiliza la siembra masiva y cundo por agotamiento.

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Mtodos de siembra
6. Observe las cajas y los tubos despus de 24 o 48 horas de incubadas y describa las caractersticas de los cultivos, tenga en cuenta la clasificacin de las colonias de acuerdo a su forma, elevacin o borde. Y realice un cuadro de sus observaciones informando el medio de cultivo correspondiente y el nombre del microorganismo.
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Coloracin de Gram
Objetivos
Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de: Preparar frotis en fresco de microorganismos Reconocer las diferentes morfologas bacterianas Adquirir habilidades para colorear bacterias a travs de la coloracin de Gram
Fundamentacin terica
Todos los compuestos orgnicos absorben luz, pero lo hacen en la regin ultravioleta como esta parte no es visible aparecen a nuestros ojos incoloros o blancos. Por lo general, las bacterias y otros microorganismos son transparentes y ello dificulta el estudio de los detalles morfolgicos cuando se los examina en su estado natural Las cubiertas que rodean la clula bacteriana se han identificado por medio de tcnicas de tincin en microscopa ptica y electrnica, y tcnicas de aislamiento y caracterizacin bioqumica de los componentes celulares, la gran mayora de las bacterias poseen una pared celular de peptidoglicanos que les confieren su forma caracterstica y les provee de proteccin mecnica. La pared celular es responsable de lo que le sucede al colorante utilizado en la Tincin de Gram (1884). La propiedad de teirse o no de violeta oscuro (Gram positivas o Gram negativas) por esta coloracin es un criterio de clasificacin importante correlacionable con otras propiedades bacterianas. Los colorantes se utilizan en microbiologa para: Teir los microorganismos y sus estructuras (cpsulas, flagelos, esporas, grnulos) Para diferenciarlos en grupos segn la forma de tomar dichos colorantes. Para adicionarlos a los medios de cultivos con el fin de inhibir el crecimiento de un grupo determinado de grmenes. Los colorantes bacterianos son anilinas que contienen radicales que imparten su propiedad cromgena al colorante y grupos auxcromos que permiten que el colorante se una a las fibras o tejidos. Si la porcin coloreada (cromgeno) acta como base, se les denomina colorantes bsicos (catinicos) y s el cromgeno acta como cido se llaman colorantes cidos (aninicos).
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Coloracin de Gram
Los ncleos de las clulas se tien mejor con colorantes bsicos y el citoplasma con colorantes cidos. Como la clula bacteriana tiene su material nuclear distribuido por toda la clula se colorea bien con los colorantes bsicos. Las bacterias son clulas transparentes y por su tamao (0.1 a 5 m) se pueden observar en el microscopio en aumento de 40 X o ms. Por su constitucin tienen una carga negativa y al observarlas en las preparaciones en fresco se ven en continuo movimiento ya que se rechazan unas a otras (movimiento browniano). La coloracin de Gram ideada por Hans Cristian Gram en 1844, permite la diferenciacin de los microorganismos en dos grupos: Gram positivos y Gram negativos. Nota: Para que esta reaccin ocurra es necesario que las bacterias que se van a colorear tengan su pared ntegra, para esto se deben utilizar cultivos jvenes.
Tincin de Gram:
El procedimiento se inicia fijando a la llama las bacterias extendidas en un portaobjetos. Las mismas se tien con una solucin del colorante bsico cristal violeta , durante un minuto., se enjuagan con agua corriente para eliminar el exceso de colorante. El paso siguiente consiste en aplicar solucin de Lugol (iodo/ioduro de potasio). El yodo forma una laca con el cristal violeta, que es insoluble en agua y soluble en alcohol o acetona se deja durante un minuto, y se enjuaga Al preparado se adiciona alcohol acetona , durante 30 segundos, se enjuaga. Finalmente se procede a realizar una coloracin de contraste (diferenciacin) con otro colorante (fucsina), el cual se deja durante un minuto , se enjuaga y se deja secar la placa .
Materiales:
Colorantes de la coloracin de Gram Cristal Violeta Solucin de Lugol Alcohol -Acetona Safranina Cultivos de bacterias (cocos y bacilos)
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Coloracin de Gram
Lminas portaobjetos para realizar los frotis o las preparaciones hmedas Laminillas cubreobjetos Solucin salina Lminas demostrativas con mezclas de cocos, bacilos y espiroquetas
Procedimiento Preparacin del frotis:
1. Calentar el asa de inoculacin hasta que este al rojo
2. Tomar la porcin de la muestra que se va a examinar por medio de un asa o escobilln
3. Colocar la muestra sobre un portaobjetos limpio y sin grasa, debidamente marcado
4. Trazar con la muestra una espiral del centro a la periferia*
Si la muestra no es lquida, colocar una pequea gota de solucin salina sobre el portaobjetos antes de realizar el frotis y disolver en ella la muestra.
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Coloracin de Gram
5. Calentar nuevamente el asa para desinfectarla
6. Fijarlo pasndolo tres veces a travs de la llama con la muestra hacia arriba, una vez se haya secado el frotis al medio ambiente
Una vez fijada la muestra proceda a la coloracin. Verter el cristal violeta sobre el portaobjetos y dejar actuar por 1 minuto. Enjuagar con agua corriente y dejar escurrir Agregar la solucin de Lugol y dejar actuar por 1 minuto Escurrir la solucin y enjuagar el portaobjetos con agua corriente Decolorar con el alcohol-acetona por 30 segundos y enjuagar con agua corriente. Observe la demostracin de la preparacin del frotis y de la coloracin realizada por el profesor antes de proceder. Realice un frotis de un cultivo slido y uno de un cultivo lquido, realice la coloracin de gram, realice los esquemas correspondientes identificando la morfologa y la coloracin.
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Coloracin de Gram
Preguntas Cmo esta compuesta la estructura qumica de la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
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Cul es la accin de cada uno de los compuestos que se utilizan en la coloracin de Gram.
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Si usted hiciera la mirara al microscopio una bacteria gram negativa. Cules son bacterias.
coloracin de gram por pasos y en cada paso, qu observara en positiva y qu en una gram las morfologas clsicas en las
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Medios de cultivo
Introduccin
Un mtodo fundamental de estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio lquido o en la superficie de un medio slido denominado medio de cultivo. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van desde azucares simples hasta sustancias complejas tales como la sangre o el extracto de caldo de carne, para identificar cada tipo de bacteria se estudian sus caractersticas bioqumicas sembrndolas en medios de cultivos especiales. Cada bacteria individual genera por escisin binaria una colonia microscpica compuesta por decenas de millones de clulas similares a la original; si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio, crecer como un cultivo puro de un solo tipo de bacteria.
Objetivos
Al finalizar esta sesin, el alumno se encontrar en capacidad de: Comprender las bases tericas que fundamentan la utilizacin de los medios de cultivo, sus condiciones, preparacin y conservacin; adems de otros trminos relacionados, tales como, tipos de siembra, tipos de colonia y cepario Preparar medios de cultivo de mayor utilizacin en el laboratorio Practicar los distintos tipos de siembras usados frecuentemente
Marco terico Los medios de cultivo en microbiologa

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos se denomina medio de cultivo y el crecimiento de estos es el cultivo.
Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al medio; tales factores son:
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Medios de cultivo
Disponibilidad de nutrientes adecuados Consistencia adecuada del medio Presencia o ausencia de oxigeno y otros gases Condiciones adecuadas de humedad Ausencias de luz ambiental pH Temperatura Esterilidad del medio
Conservacin de los medios de cultivo deshidratados

Los medios de cultivo deshidratados son pobres en microorganismos y en general son libres de formas microbianas termoresistentes, presentan higroscopicidad, por lo que sus frascos hermticos solo deben abrirse en un ambiente seco, el intercambio de agua entre el medio y el cultivo motivado por oscilaciones grandes de temperatura conlleva al desarrollo de microorganismos en el material, ocasionando disminucin en sustancias nutritivas, variaciones del pH y alteraciones del color. Los medios de cultivo deshidratados deben conservarse siempre en ambiente seco, fresco y protegidos de la luz directa.
Recomendaciones generales
Para la preparacin de medios de cultivo debe emplearse agua recin destilada o desmineralizada, de reaccin neutra y dentro de lo posible pobre en microorganismos. A una cantidad de agua aproximadamente igual a la mitad de la requerida, se agrega la cantidad calculada del medio de cultivo desecado, agitndose e incorporndose el material que se encuentre adherido a las paredes internas del recipiente., posteriormente se complementa el volumen de agua Los medios de cultivo cuyo solidificante sea agar, deben reposar a temperatura ambiente de 10 a 15 minutos para asegurar una buena hidratacin del solidificante; para conseguir una solucin completa de los medios de cultivo que contienen agar o gelatina es recomendable su calentamiento, sin embargo debe evitarse la prolongacin innecesaria de este recurso.
Inoculacin de los medios de cultivo

En microbiologa se entiende por siembra la operacin que consiste en depositar un germen aspticamente en un medio de cultivo. Toda siembra debe adaptarse a los siguientes principios generales: Practicarla en un medio de cultivo favorable y previamente esterilizado Emplear instrumentos aspticos No contaminar ni destruir al inoculo
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Medios de cultivo
Depositarla aspticamente en los medios elegidos Esterilizar los instrumentos empleados antes y despus de cada operacin La tcnica general de la siembra variara segn el estado fsico del material a sembrar y del medio de cultivo.
Esquematizacin de la preparacin cultivo
de los medios de
El siguiente esquema muestra una secuencia lgica de los pasos ms significativos en la preparacin de los medios de cultivo, con el fin de optimizar el proceso.
Mtodos de cultivo de uso rutinario

Al inocular debe trabajarse siempre dentro del radio de un mechero bunsen (30cm), o en el ambiente dentro de una campana de flujo laminar, ya que, la corriente ascendente del aire que va por la llama, o la corriente de aire del flujo laminar arrastra el polvo u otras partculas con el aire hacia arriba o hacia fuera, impidiendo la contaminacin del medio de cultivo.
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Medios de cultivo
El asa y la pipeta pasteur deben ser flameadas adecuadamente y enfriadas antes de tocar el inoculo, o el medio de cultivo. A continuacin se describe brevemente los mtodos de cultivo de uso ms rutinario
Incubacin de los medios de cultivo

Los medios de cultivo pueden ser incubados en estufas a 35C en aerobiosis, anaerobiosis, o en atmsfera de CO2. Para aerobiosis se incuban las placas y tubos en estufa de cultivo a 35C; para anaerobiosis se colocan las placas y tubos dentro de una jarra anaerobia y luego de esto se coloca en estufa de cultivo a 35C con un sobre productor de atmsfera anaerobia; para incubar en atmsfera de CO2 se colocan la placas y tubos dentro de una jarra de CO2 y esta se coloca en una estufa de cultivo a 35C con un sobre productor de atmsfera microaerofila.
Actividad prctica 1. Prepare los medios de cultivo que le indique el profesor, teniendo en cuenta que en cada caja se deben colocar 20 mL de agar.
2. Realice los clculos para preparar 10 cajas petri, es recomendable preparar siempre un 5% exceso.
de de
Para consultar Qu es un cepario y cmo se debe mantener.

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Medios de cultivo
Describa dos bacterianas. mtodos de conservacin de cepas
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Enuncie dos medios de cultivo selectivos y dos medios de cultivo diferenciales.

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Cmo se reactivan las cepas consiguen comercialmente.
liofilizadas
que
se
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Cmo se transportan las cepas bacterianas.

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Completar el siguiente cuadro

Medio Sustancias selectivas Sistema diferencial - Lactosa - Sacarosa - Los colorantes son reveladores del sistema diferencial - Tiosufalto sdico - Citrato frrico amnico - Lisina Utilizacin - Poco inhibidor - Permite el crecimiento de enterobacterias y enterococos - Diferencia E. coli de otras lactosa positivas - Posee gran carcter diferencial para Candida y actinomicetales aerobios
Agar eosina-azul de metileno (EMB)
Agar xilosa-lisina Desoxicolato (XLD)
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Medios de cultivo
- Xilosa, lactosa, sacarosa - Citrato frrico amnico - Tiosulfato sdico - Lactosa, sacarosa, salicina - Azul de bromotimol - Indicador de Andrade
Medio de Hektoen
- Sales biliares - Desoxicolato sdico
- Permite el crecimiento de salmonelas y shigelas
Agar salmonela-shigela (SS) Agar Verde Brillante
- Sales biliares - Verde brillante - Citrato sdico - Verde brillante
- Permite el crecimiento selectivo de salmonelas, shigelas y yersinias - Permite el crecimiento de salmonelas
Esquema 1: tipos bsicos de medios de cultivo
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Distribucin de los microorganismos en el medio

Objetivos
Demostrar la existencia de microorganismos en ambientes naturales Caracterizar la carga bacteriana de diferentes lugares
Marco terico
Los microorganismos se encuentran en muchos ambientes naturales. Pueden ser localizados en hielo, tierra, aceite, gasolina, agua, aire, alimentos, tracto intestinal, piel, etc. Slo unos pocos lugares en la naturaleza como crteres de volcanes y tejidos vivos estn libres de ellos. Su amplia distribucin puede ser demostrada exponiendo medios estriles a varios ambientes y observando su crecimiento. El laboratorio como los otros lugares est poblado de microorganismos suspendidos en el aire, o llevados por el polvo a las superficies. Estos son de particular importancia para quienes trabajan en el laboratorio, puesto que deben practicar tcnicas mediante las cuales se evite la contaminacin de los materiales con los cuales se trabaja, tales como: medios, soluciones y equipo estril.
Materiales
Agar nutritivo o Agar Plate Count en tubos de ensayo. Cajas de Petri estriles. Bao Maria. Escobilln de algodn. Asa metlica. Lmpara.
Procedimiento
Muestras de la poblacin bacteriana ambiental. 1. Funda el agar nutritivo o agar plate count y enfrelo hasta 45 C aproximadamente (que usted soporte tener el tubo en la mano). 2. Vierta 15 ml del agar nutritivo en cada una de las cajas de Petri.
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3. Una vez slido el medio inocule todas las cajas, menos una que servir de control del medio, con bacterias obtenidas de las siguientes fuentes:
Bacterias del Aire

a. Coloque una caja de petri sobre cualquier lugar en el laboratorio. b. Remueva la tapa y djela a un lado sin invertirla. c. Deje la caja abierta por 15 minutos. d. Mrquela indicando que es la expuesta al aire. e. Coloque la tapa sobre la caja, invirtala e incbela por 48 horas.
Bacterias en la superficie de la mesa de trabajo

a. Tome un escobilln humedzcalo con agua peptonada, frtelo sobre la superficie de la mesa de trabajo. b. Levante la tapa de la caja de petri y aplique el escobilln sobre una parte de la superficie del agar, haciendo luego estras con el asa estril. (No rompa el agar). c. Tape la caja, invirtala y mrquela adecuadamente. d. Incube a temperatura ambiente por 48 horas.
Microorganismos Normales de Mucosas y de Piel:

a. Tome un escobilln, frtelo sobre cualquier parte de la superficie del cuerpo insrtelo en la nariz y frote suavemente la mucosa de la misma. b. Inocule una caja de agar nutritivo como lo hizo en el caso anterior. c. Tape, invierta, marque e incube a temperatura ambiente por 48 horas. Repita el anterior procedimiento pero esta vez frotando una moneda
Control del medio de cultivo

Siempre que se trabaja en microbiologa se debe realizar control de los medios de cultivo, por lo tanto incube la caja con medio.
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Resultados
Observe el nmero de colonias obtenidas en cada una de las cajas inoculadas, Note las diferencias entre las colonias de acuerdo a: A. Color B. Consistencia. C. Forma. D. Tamao E. Otras observaciones Reporte y describa las anotaciones, anteriores, en su cuaderno de notas en conjunto con la coloracin de Gram.
Preguntas 1. Consulte qu sustancias se utilizan para mantener la poblacin bacteriana en niveles muy bajos en los siguientes sitios:
Salas de ciruga ___________________________________________________________ Fbricas de alimentos ____________________________________________________ Laboratorios farmacuticos ____________________________________________
2. En qu consisten los mtodos de sedimentacin, rodac y el hisopo y cual es la aplicacin de cada uno de ellos.
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3. Observar las placas de sus compaeros, discutir durante 10 minutos y sacar conclusiones sobre los resultados del laboratorio
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Clasificacin de los microorganismos segn su temperatura de crecimiento

Objetivos
Conocer la clasificacin de los microorganismos segn la temperatura ptima de crecimiento Observar cual de estos microorganismos se encuentra en mayor cantidad dentro de los productos y conocer la razn de esto Realizar recuentos bacterianos
Marco terico
La zona de temperatura en que crecen los organismos es relativamente pequea, y se extiende aproximadamente entre - 5 y + 80 C. El lmite superior de temperatura para el crecimiento biolgico est determinado por la termolabilidad de las protenas celulares, y el inferior, por el punto de congelacin del agua, que es de varios grados bajo cero cuando contiene disueltas, cantidades considerables de solutos. Debe hacerse notar que los organismos vivos pueden sobrevivir a temperaturas mucho ms bajas que la mnima requerida para el crecimiento. Los microorganismos pueden conservar su viabilidad durante largo tiempo si se mantienen a baja temperatura en estado de congelacin; de hecho, un medio excelente para conservar las bacterias es mantenerlas a la temperatura del nitrgeno lquido (-196C). La temperatura que permite el crecimiento de cualquier microorganismo particular raramente sobrepasa los 35C. Cuando se representa la velocidad de crecimiento en funcin de la temperatura, se obtiene una curva de forma caracterstica. Entre los microorganismos procariticos son particularmente notables las diferencias respecto a la zona de temperatura en que ocurre su crecimiento. Basndose en esta propiedad se pueden distinguir tres grupos fisiolgicos principales: termfilos, mesofilos y psicrofilos. Al interpretar la influencia de la temperatura en la velocidad del crecimiento microbiano hay que tener en cuenta el efecto de la temperatura en la velocidad de las reacciones qumicas. Aproximadamente, la velocidad de la mayora de las reacciones qumicas se dobla por cada incremento de 10 C en la temperatura. La ecuacin de Arrhenius describe matemticamente la relacin existente entre la velocidad de reaccin y la temperatura: Log10u = -H 2.303RT + C
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Donde u representa la velocidad de reaccin, -H la energa de activacin de la reaccin, R la constante de los gases y T la temperatura absoluta en grados Kelvin. Puesto que -H, R y C son constantes, hay una relacin lineal entre el logaritmo de la velocidad de reaccin y el valor inverso de la temperatura Las desviaciones en las cercanas de la temperatura mxima se interpretan fcilmente. A medida que la temperatura asciende, el crecimiento microbiano acaba por detenerse como consecuencia de la desnaturalizacin de las protenas celulares; por encima de la temperatura ptima, este factor adquiere rpidamente progresiva importancia, y determina una cada brusca de la velocidad de crecimiento. Debe hacerse notar que el crecimiento se detiene cuando se destruyen las protenas esenciales ms termolbiles de la clula. Diferentes especies microbianas varan ampliamente en sus fluctuaciones de la temperatura ptima para su desarrollo: las formas psicrofilias crecen mejor a temperaturas bajas (15-20 C), las formas mesofilas lo hacen mejor a 30 -37C y las termofilas a 50-60 C aunque tambin podemos encontrar microorganismos termoduricos, los cuales comprende las bacterias que sobreviven pero no son capaces de crecer a las temperaturas de pasteurizacin. La mayora de los microorganismos son mesofilos, y se encuentran en casi todos los productos, esto debido a que su temperatura de desarrollo (30 C) es la temperatura ptima para muchas de las formas de vida libre; adems se encuentran ampliamente difundidas en el medio ambiente. El lmite mximo de la gama de temperatura, tolerado por cualquier especie se correlaciona bien con la estabilidad trmica general de las protenas de dicha especie segn mediciones hechas en extractos celulares. Microorganismos Mesofilos Termofilos Termoduricos Psicrofilos T mnima 10-25C 24-45C Menor de 55 C OC T ptima 30-40 C 50-55 C Mayor de 65 C 10-15C T mxima 43+2C 70C 115C 20 C
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Equipos y materiales
- Cajas de Petri de vidrio estriles. - Tubos de ensayo con tapa rosca. - Pipetas bacteriolgicas de 1 ml estriles. - Cubeta con hielo. - Bao de agua de 45-50 C para fundir el agar. - Bao de agua a 63 C . - Estufa de incubacin. - Agar para recuento en placa. (Plate Count Agar)
Recuento de microorganismos mesofilos

Para este procedimiento, usaremos el mtodo estndar de recuento en placa, por siembra en profundidad. Este recuento se considera como indicador del grado de contaminacin de los alimentos en cualquier etapa del proceso de produccin, tambin se utiliza como indicador de la vida til de un producto. El nmero de bacterias aerobias mesofilas encontrado en los alimentos es uno de los indicadores microbianos de calidad de los mismos (este ndice no es valido para alimentos fermentados tales como: queso, leche, yogurt, mantequilla), se estima la microbiota total, pero sin especificar tipos de grmenes. Un recuento total de aerobios mesofilos bajo, no asegura que un alimento este exento de patgenos o sus toxinas; tampoco un recuento total alto significa, inevitablemente, presencia de microbiota patgena. Excepto en productos que se elaboran por fermentacin, altos recuentos microbianos se consideran poco aconsejables para la mayor parte de los alimentos. Esta determinacin se utiliza para: Verificar la eficacia de los sistemas de limpieza y desinfeccin, averiguar la temperatura a que fueron mantenidos los alimentos durante los procesos de tratamiento industrial, transporte y almacenamiento. Tener idea sobre la alteracin incipiente de los alimentos, de su probable vida til, de la descongelacin no controlada de los alimentos congelados o de las fallas en el mantenimiento de la temperatura de refrigeracin en los alimentos refrigerados.
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Poner de manifiesto las fuentes de contaminacin durante el proceso de manipulacin de los alimentos. En general el recuento de microorganismos aerobios mesofilos es una prueba para conocer las condiciones de salubridad en algunos alimentos.
Procedimiento
1. Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizadores. Ver adelante. 2. Pipetear por triplicado en cajas de Petri alcuotas de 1 ml de las diluciones. 3. Inmediatamente, verter en cada caja de 15 ml de agar Plate count, fundido y mantenido a 45-50 C. 4. Mezclar el inoculo con el agar, inclinando y girando las cajas. 5. Como prueba de esterilidad, verter la cantidad del medio de cultivo sobre una caja de Petri sin muestra (marcar = control). 6. Dejar las cajas sobre la mesa hasta solidificacin del agar. 7. Invertir las cajas e incubar a 37 C por 48 horas.
Preparacin de homogenizados
Para realizar un conteo en placa es necesario recurrir al mtodo de las diluciones decimales. Es decir preparar diluciones de la muestra hasta que se estime conveniente de acuerdo con una poblacin microbiana esperada. El agua peptonada y la solucin salina fisiolgica con peptona al 0.1% se emplean como agente diluyente y dan los mejores resultados en la mayora de los casos. Los alimentos slidos requieren hacerse lquidos, se debe preparar una dilucin 10-1 adicionando 10 g del alimento y mezclndolos con 90 ml de diluyente o cualquier otra cantidad que conserve la misma proporcin. Posteriormente se deja homogenizar la mezcla utilizando un vortex o con movimientos de rotacin hechos con la mano. A partir de all se preparan diluciones en serie 10-2, 10-3, etc. Para el xito del proceso, es necesario realizar una buena agitacin y utilizar pipetas diferentes para cada dilucin. Recuerde que este procedimiento pretende diluir los microorganismos presentes en una muestra y se hace indispensable no mezclar pipetas que vengan de diluciones pequeas (alto contenido de microorganismos) con diluciones altas.
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Lectura y clculo de los recuentos
Seleccionar las placas correspondientes a la dilucin que contenga entre 30 y 300 colonias; contar las colonias que aparezcan en las cajas y multiplicar por el factor de dilucin. Si el crecimiento de los microorganismos fue masivo pero bien distribuido en toda la placa, esta se divide en 4 partes iguales y se realiza el conteo de una de las cuartas partes, luego, el resultado se multiplica por 4 y finalmente por el factor de dilucin.
Recuento de los microorganismos psicrofilos

El nombre de psicrofilos se aplica a las bacterias las cuales tienen como temperatura ptima de crecimiento 5-15 C. En este punto se encuentran especies de Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus y Streptococcus.
Procedimiento
1. Preparar las muestras y las diluciones de los homogenizados. (Helado) 2. Pipetear por duplicado en cajas de Petri 1 ml de la serie de diluciones. 3. Inmediatamente verter en cada caja 15ml del medio agar para recuento fundido y mantenido a 50 C. 4. Mezclar el inoculo con el agar, inclinado y girando las cajas. 5. Realizar la prueba de esterilidad, vertiendo una cantidad de medio de cultivo sobre una caja de Petri sin muestra (marcar =control). 6. Dejar las cajas sobre la mesa hasta solidificacin. 7. Invertir las cajas e incubar a 7 C. durante 8 das

Proceder como se indico para recuento de mesofilos.
Recuento de microorganismos termoduricos

Las bacterias termoduricas son las que sobreviven a la pasteurizacin y contribuyen a los recuentos altos en la leche pasteurizada. (Las resistencias al calor de los microorganismos se expresan generalmente como tiempo de destruccin trmica, que se define como el tiempo necesario para destruir a una temperatura, un nmero determinado de organismos o esporas en condiciones especificas). Los microorganismos termoduricos incluyen: Micrococcus, Streptococcus, Lactobacillus, entre otros.
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Las bacterias termoduricas esporuladas se dividen en dos grupos principales Bacillus y Clostridium. Todos estos microorganismos pueden llegar a la leche proveniente de utensilios, vacas, establos sucios y plantas de pasteurizacin que no llenan las condiciones sanitarias. Adems pueden encontrarse en enlatados, conservas, carnes fras y todos los alimentos que para su esterilizacin necesitan ser sometidos a altas y bajas temperaturas; como las gelatinas, concentrados y alimentos envasados a presin.
Procedimiento terico
1. Homogenizar la muestra de leche y transferir 5 ml a un tubo de ensayo con tapa rosca. 2. Colocar el tubo en un bao Mara a 63 C por 30 min. 3. Enfriar inmediatamente el tubo en una cubeta con hielo (aprox 5 min). 4. Agitar el tubo y hacer diluciones hasta 10-3. 5. Sembrar cajas por duplicado de cada dilucin y agregar el agar plate count. 6. Incubar a 35-37 C por 24 - 48 horas. 7. Hacer recuento correspondiente, e informar como # de ufc termoduricas/ml. 8. Realizar el control de esterilidad.

Proceder como se indic para el recuento de mesofilos.
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Diagrama de flujo Recuento de mesofilos y psicrofilos
10g 10ml 1ml 1ml
Muestra
90ml H2O peptonada 10-1 1ml
15ml agar
15ml agar
15ml agar
Hacer control de esterilidad Mesofilos incubar a 35C durante 48 hora Psicrofilos a 7C en 48 horas
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Diagrama de flujo Recuento termoduricos
10 ml
5ml
1ml
1ml
Muestra
90ml H2O peptonada
bao mara 63C x30
bao mara por 5
9ml H2O peptonada
9ml H2O peptonada
10-1 1ml
10-2 1ml
10-3 ml
15ml agar
15ml agar
15ml agar
Hacer control Incubar a 37C durante 48 horas
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Preguntas En qu consiste la prueba del azul de metileno y qu relacin tiene con la contaminacin de la leche.
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
Explique mediante qu mecanismos los microorganismos viven en ambientes psicrofilicos.

___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
Cules son los principales contaminantes de la leche.
microorganismos
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
Reporte los recuentos de cada uno de los anlisis e informe correctamente.

___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
Qu es la pasteurizacin pasteurizacin.
que
la
ultra
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
Reporte los recuentos de cada uno de los anlisis e informe correctamente.

___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
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Control microbiano por agentes qumicos

Introduccin
Las sustancias antimicrobianas se pueden dividir en bactericidas (capaces de eliminar las bacterias), o bacteriostticos (bloquean el crecimiento y multiplicacin celular). Los frmacos bacteriostticos resultan eficaces debido a que las bacterias inhibidas en su crecimiento morirn con el tiempo o sern atacadas por los mecanismos de defensa del husped. Los antibiticos que lesionan la membrana celular producen una liberacin de los metabolitos celulares al exterior, y por tanto su muerte. Tales compuestos, como las penicilinas o cefalosporinas, son por tanto bactericidas. En el siguiente laboratorio se evaluarn los desinfectantes a estudiar poniendo en contacto, con cada solucin desinfectante el microorganismo, para luego sembrarlo en un medio apropiado y determinar la supervivencia del microorganismo la cual es indicada por el crecimiento bacteriano.
Objetivos
Identificar las diferencias entre el efecto bactericida y el efecto bacteriosttico Realizar pruebas que permitan dilucidar la efectividad de las diferentes soluciones antimicrobianas empleadas en el laboratorio Evaluar tiempos de exposicin de los desinfectantes, y explicar su accin frente a los microorganismos
Marco terico
Antibitico (del griego, anti, contra; bios, vida) es cualquier compuesto qumico utilizado para eliminar o inhibir el crecimiento de organismos infecciosos. Una propiedad comn a todos los antibiticos es la toxicidad selectiva: la toxicidad es superior para los organismos invasores que para los animales o los seres humanos que los hospedan. Los antibiticos pueden lesionar de forma selectiva la membrana celular en algunas especies de hongos o bacterias; tambin pueden bloquear la sntesis de protenas bacterianas. La eficacia de los antibiticos algunas veces depende de cun rpido detiene el crecimiento de las bacterias, cuando se agrega el antibitico a un cultivo stas continan creciendo durante aproximadamente dos o cuatro generaciones antes de ser inhibido su crecimiento, slo despus de la formacin de muchas clulas, el frmaco se puede volver bactericida o bacteriosttico. En algunos casos puede ser mejor usar un agente
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bactericida que uno bacteriosttico; sin embargo la diferencia entre estos dos agentes no debe considerarse absoluta pues la accin de un frmaco puede ser diferente en distintos microorganismos, a pesar de estas ambigedades los criterios que se manejan para ambos agentes en general son tiles para considerar el resultado de la farmacoterapia. La eficacia de los frmacos antimicrobianos depende del grado de sensibilidad de los supuestos microorganismos blanco, cada agente es efectivo contra un espectro definido de microorganismos. A continuacin se presentan algunos conceptos tiles: Agentes qumicos para desinfeccin Nombre Definicin Compuestos que evitan la descomposicin o putrefaccin, Antispticos al controlar el crecimiento de microbios, se usan en tejidos vivos y no en los alimentos. Compuestos que matan a las bacterias de todo tipo, aunque Bactericidas generalmente no matan a las esporas. Compuestos que evitan la reproduccin y crecimiento de Bacteriostticos las bacterias, pero no las matan. Compuestos que eliminan microorganismos, presentes en Desinfectantes los objetos inanimados. Compuestos que matan a los hongos, mohos y levaduras de Fungicidas todo tipo, aunque generalmente no matan a las esporas. Compuestos que evitan la reproduccin y crecimiento de Fungistticos los hongos, mohos y levaduras, pero no las matan. En general, si no slo nos referimos a las bacterias, sino a cualquier tipo de microorganismos, hablamos respectivamente de agentes microbiostticos y microbicidas. Ahora bien, para una misma sustancia qumica, la lnea de demarcacin entre un efecto microbiosttico y otro microbicida depende muchas veces de la concentracin de dicha sustancia y del tiempo durante el que acta. Cmo podemos saber que un microorganismo est "muerto"? El nico criterio vlido es la prdida irreversible de la capacidad de divisin celular, es decir, de la prdida de viabilidad, y se suele comprobar empleando tcnicas con placas de Petri (es decir, confirmando que no crecen en medios slidos adecuados). Una de las tcnicas para determinar la capacidad microbiana de los agentes qumicos es colocando el microorganismo en contacto con la solucin del agente qumico por determinado tiempo, despus del cual
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se siembra a partir de la mezcla, en un medio, para determinar la supervivencia del microorganismo. Por este procedimiento se puede evaluar la eficiencia antimicrobiana de gran variedad de compuestos.
Procedimiento
En esta prctica se tendrn en cuenta diferentes variables tales concentracin del desinfectante y tiempo de exposicin. como: clase de microorganismo,
Colocar en un tubo 5 ml de la solucin desinfectante y adicionar 0.5 ml de cultivo en caldo con una absorbancia de 0.1 a 540 nm. (el cultivo debe estar en fase exponencial) Agitar suavemente el tubo para distribuir uniformemente el microorganismo. Esperar 5 minutos.
Transferir 1 ml de la mezcla anterior a una caja petri, agregar 15 ml del medio de cultivo (siembra por profundidad).Mezclar e Incubar a 37oC durante 48 horas. Repetir este procedimiento a los 15 y a los 30 minutos, despus de haber mezclado la solucin desinfectante con el microorganismo. Repetir las condiciones de incubacin.
Repetir el procedimiento para todos los desinfectantes a evaluar. El profesor le asignara el microorganismo a evaluar, se utilizar como control positivo lmpido y se har control de crecimiento de cada microorganismo.
Complete la siguiente tabla evaluar el crecimiento.

Agente qumico 1. 2. 3. 5 minutos
utilizando
cruces
para
15 minutos
30 minutos
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Observe todas las cajas y microorganismos de cada una. anote el nmero de
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
Realice el procedimiento anterior pero esta vez diluyendo uno de los agentes antimicrobianos utilizando un factor de dilucin 1/10, y 1/100.
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
Represente tabla.
Microorganismo Recuento de UFC
sus
resultados
utilizando
la
siguiente
1/10
1/100
Conclusin
En grupos de trabajo intercambien resultados para diligenciar la tabla dos, deben unirse de forma tal que tengan en comn la solucin desinfectante pero diferente microorganismo.
Tabla No 2. Soluciones de diferentes desinfectantes a la misma concentracin Agente desinfectante/microorganismo Tiempo de exposicin 5 15 30 45 Recuento UFC
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Conclusiones
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
Preguntas Como tecnlogo qumico qu factores tendra en cuenta para elegir un desinfectante.
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
Qu significa sustancias espectro reducido.
de
amplio
espectro
de
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
Qu es un agente desinfectante.
esterilizante,
antisptico
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
Existen diferentes mtodos para microbiolgico explique dos de ellos. No incluir el control por sustancias qumicas.
control se debe
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
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Diagrama de flujo Procedimiento
Prepare dos concentraciones del desinfectante a evaluar. Inocule los tubos con el microorganismo de absorbancia conocida.
Adicione el medio de Siembra por profundidad.
cultivo.
Transfiera a los intervalos de tiempo descritos 1ml a cajas estriles.
Incube a 37oC por 24 horas.
Realice los controles de crecimiento y el control positivo utilizando un antibitico o hipoclorito de sodio, complete las tablas de datos.
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Obtencin de hongos a partir de la tierra

Objetivos
Desarrollar destrezas en la manipulacin, aislamiento y recuento de los hongos Realizar enfoques en el microscopio de algunas estructuras caractersticas de los hongos
Fundamentacin terica
Los hongos son organismos eucariticos portadores de esporas, con nutricin por absorcin, no son fotosintetizadores (no tienen clorofila) y se reproducen sexual y/o asexualmente. Junto con las bacterias, los hongos son los causantes de la putrefaccin y descomposicin de toda la materia orgnica Algunos son parsitos de organismos vivos y producen graves enfermedades en plantas y animales. Otros hongos filamentosos son utilizados para la produccin de antibiticos. La penicilina fue el primer antibitico que se produjo industrialmente. Gracias a los aportes de Flemming y sus descubrimientos, fue posible la produccin a escala del Penicillium notatum. Las enzimas hidroliticas de los hongos se utilizan en diversos procesos industriales. Cuando crecen sobre salvado caliente de trigo o de arroz, algunas especies fngicas producen amilasas una clase de enzimas que se utilizan en fermentacin alcohlica. Las proteasas que se obtienen de otros hongos se emplean en la fabricacin de pegamento lquido. Por otra parte cada da se descubren nuevas aplicaciones industriales de los hongos, hasta el punto que muchos de ellos se comercializan desde alimentos hasta insecticidas biolgicos.
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Procedimiento
De acuerdo al siguiente diagrama se realizar la prctica.
La siembra es por superficie en el medio de cultivo PDA (papa, dextrosa , agar) y agar rosa de bengala Incubar a temperatura ambiente por ocho das, colocando cinta alrededor de las cajas. Despus de pasado el tiempo de incubacin realice una descripcin macroscpica de las estructuras Para realizar el anlisis microscpico tome una tirilla de cinta pegante transparente colquela en contacto con una parte del hongo presione y conservando la polaridad colquela en el portaobjetos, adicione una gota de azul de lactofenol y cbrala con una laminilla teniendo la precaucin de no dejar burbujas, realice los diferentes enfoques hasta un aumento de 40X. (Ver demostracin del profesor).
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Preguntas Consulte aplicaciones industriales de los hongos.
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Realice el esquema de las diferentes estructuras observadas en el microscopio.

___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
Describa sus observaciones macroscpicas.

___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
Defina lo siguiente:
Micelio : ______________________________________________________________________ Esporas : ______________________________________________________________________ Conidias : _____________________________________________________________________ Hongos filamentosos : _____________________________________________________ Levaduras : ___________________________________________________________________
Qu procedimiento se utiliza para germinar esporas y para hacer recuento de ellas.

___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
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Cul es la importancia de los microorganismos en los suelos.

___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
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Gua prctica anlisis de aguas
Introduccin
La presencia de bacterias patgenas, en el agua destinada al consumo humano es un riesgo siempre presente, que se incrementa en las reas de mayor densidad de poblacin. El agua contaminada puede ser la causa de muchas enfermedades infecciosas como: Fiebre Tifoidea, Disentera, Clera, entre otras. Esto ha llevado a la necesidad de realizar anlisis microbiolgicos de rutina a partir de muestras de agua.
Objetivos
Determinar la calidad microbiolgica del agua Desarrollar habilidades para el manejo de la tcnica de filtracin por membrana Establecer diferencia entre bacterias Coliformes Totales y Coliformes fecales
Marco terico
Por la gran variedad de bacterias patgenas que se pueden encontrar en una muestra de agua se hace necesario e indispensable el control rutinario de todos aquellos microorganismos indicadores que deben cumplir los siguientes requisitos: - Ser fciles de aislar y cultivar en el laboratorio - Ser relativamente incuos para el hombre y animales - Su presencia en el agua debe de estar relacionada cualitativamente y cuantitativamente con la de otros microorganismos patgenos y/o de aislamiento difcil
Coliformes totales y fecales

Las Coliformes son un grupo de bacterias habitantes de la regin intestinal de los mamferos y las aves, estos microorganismos cumplen las condiciones antes mencionadas. Pertenecen a la familia de la Enterobacterias, se caracterizan por su capacidad de fermentar la lactosa a 35-37C. Los gneros que componen este grupo son: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter, Edwardsiella.
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Todos los Coliformes pueden existir como saprofitos independientes o como microorganismos intestinales, excepto el gnero Escherichia, que solo puede tener origen fecal. Esto ha hecho necesario distinguir entre Coliformes Totales (Todas las Coliformes de cualquier origen como suelo y vegetacin), y Coliformes fecales (Coliformes exclusivas de origen fecal, sea el gnero Escherichia). Dentro de todas las coliformes solamente el gnero Escherichia y eventualmente la Klebsiella, tienen la capacidad de fermentar la lactosa no solo a 35-37 C, sino tambin a 44.5 C.
Otros microorganismos
Estreptococos fecales como la especie lancefield del grupo D y Q que se encuentra en el intestino de mamferos y aves. Los Clostridium sulfito reductor: bacterias esporuladas causantes de enfermedades como Botulismo, Gangrena gaseosa, Ttano, este gnero ofrece gran resistencia a los tratamientos de potabilizacin del agua por esto es de importancia su anlisis. El reglamento tcnico sanitario para control de calidad de aguas potables de consumo humano establece como anlisis microbiolgico mnimo el de coliformes totales y fecales. El anlisis normal incluye los dos grupos anteriores, ms grmenes totales. El anlisis completo incluye los tres gneros de grupos antes mencionados, ms Estreptococos fecales, Clostridium sulfito reductor y otros grmenes patgenos.
Lmites permitidos
- Grmenes totales: Hasta 100 por ml de agua - Bacterias Coliformes y Estreptococos fecales: Ausencia en 100 ml de agua - Clostridium sulfito reductor: Ausencia en 20 ml de agua - Ausencia de microorganismos Parsitos y/o Patgenos
Tcnicas para detectar coliformes Filtracin por membrana

Esta tcnica tiene un alto grado de reproducibilidad, permite anlisis de ms cantidad de muestra y proporciona resultados con mayor rapidez. Permite la filtracin de muestra en el campo y el traslado de la membrana al laboratorio en medios de conservacin.
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Fundamento :
Este mtodo se basa en hacer pasar la muestra de agua problema, a travs de un filtro de membrana microporosa en cuya superficie quedan retenidos los microorganismos. Habitualmente se utiliza una membrana de Millipore tipo HA (hidroanlisis), que tiene un tamao de poro de 0,45 micras, puesto que la mayora de microorganismos a analizar tienen un dimetro superior a 0,45 micras. Solo basta cultivar la membrana sobre un medio de cultivo adecuado a una temperatura y un tiempo necesario para posteriormente contar directamente las colonias sobre la superficie de la membrana. El medio que se utilizara en esta prctica ser el agar Cromocult.
Tcnica :
Mezclar el agua por inversin unas 10 veces. Pasar 100 ml de agua por el filtro de membrana. Poner el filtro en el medio de Cultivo Cromocult. Incubar de 35- 37 C por 48 horas. Leer directamente en el filtro. Limpiar el mesn de trabajo con alcohol al 70% Prender el mechero. Colocar el equipo de filtracin en autoclave por 15 min. 15 lb. de presin y 121C en lmpara UV por 10 min.
Con la pinza estril, sacar una membrana con mucho cuidado de la envoltura protectora y colocarla sobre la base del filtro.
Flamear la pinza Gelman impregnada de alcohol en el mechero.
Mezclar la muestra, adicionar 100 ml al vaso de filtracin y aplicar vaci. Cuando sea necesario aplicar diluciones, utilizar agua destilada estril.
Sacar la membrana del filtro con la pinza estril y colocar sobre el medio de cultivo cromocult.
Finalizando este periodo realizar el recuento de colonias desarrolladas sobre la membrana.
Incubar a 35C de 18-24 horas.
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Medio fluorocult con tcnica de nmero ms probable (nmp)
Fundame nto :
En el primer paso se busca detectar la presencia de bacterias Coliformes totales, basndose en la capacidad de dichos microorganismos de fermentar la lactosa con la produccin de cido y gas. Se considera indicador positivo la produccin de gas, dado que otros microorganismos (no coliformes), son capaces de producir acidez pero no gas. Un segundo paso es diferenciar entre las bacterias coliformes de origen fecal y las de origen no fecal; finalmente la cuantificacin se hace por NMP, que es un mtodo estadstico.
Tcnica :
- Se mezcla bien el agua por inversin 10 veces. - Se hace dilucin de la muestra 1/10 y 1/100 con APE. (Agua peptonada esteril) - Se siembra 1ml de la solucin madre y 1 ml de cada dilucin en el medio FLUOROCULT LMX. - Se incuba a 35-37 C por 48 horas.
Le ctura :
- Tubos positivos para coliformes totales los que presenta turbidez - Tubos positivos para coliformes fecales: 1. Los que al llevarlos a la Luz UV, presenten fluorescencia. Para hacer la prueba confirmatoria de E. coli se adiciona directamente sobre el tubo el reactivo de indol con el reactivo de Kovacs, la prueba sera positiva si aparece un anillo de color rojo, y negativa si aparece un anillo de color amarillo. Positivo: presencia de Coliformes fecales (Escherichia coli). La dilucin de la primera parte tambin puede hacerse aadiendo a la primera serie de tubos con el medio Fluorocult, 0,1 ml de agua problema. A la segunda serie 1 ml de agua. A la tercera serie 10 ml de agua.
No ta : Si el agua para analizar contiene cloro, se debe tomar la muestra en frasco de vidrio estril que
contenga 0,25 ml de tiosulfato de sodio por cada 100 ml de agua.
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Fluorescencia :
La Escherichia coli, es la nica especie del grupo de las Enterobacterias, que poseen la enzima B-D glucoronidasa. Esta enzima es capaz de escindir el sustrato 4- metilumbeliferil-B-D-glucornido (MUG), formando 4-metillumbeliferona. Esta sustancia se caracteriza por ser fluorescente al iluminarse con la luz UV., lo que permite su deteccin fcilmente. Este hecho es un indicador de la presencia de Escherichia coli.
P reguntas Cul es la normatividad vigente que regula la calidad del agua.

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Q u otros mtodos se utilizan para evaluar la calidad microbiolgica del agua.

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Q u significado tiene el hallazgo de coliformes fecales en el agua potable.
bacterias
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Q u son aguas duras y que importancia tienen en la industria.

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En qu consiste muestreadotes. el anlisis de agua utilizando
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C ules son los microorganismos utilizados como bioindicadores de contaminacin en agua potable.
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D e acuerdo a sus resultados que concluye respecto a la calidad microbiolgica de la muestra analizada.
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Determinacin de sustancias inhibidoras del crecimiento bacteriano

Introduccin
Variados mtodos de laboratorio pueden ser usados para determinar in vitro la susceptibilidad de bacterias ante agentes microbianos. En muchos laboratorios de microbiologa clnica, el test de difusin en agar es usado en forma rutinaria para este tipo de anlisis. Los ensayos de susceptibilidad estn indicados para apoyar la quimioterapia antimicrobiana de tratamiento en procesos infecciosos por bacterias en las que la identidad del microorganismo no es suficiente para predecir en forma confiable su susceptibilidad. En la determinacin de potencia de un antibitico generalmente se emplean dos mtodos el de difusin en placa y el mtodo turbidimetrico o ensayo en tubo.
Objetivos
Al finalizar esta sesin, el alumno estar en capacidad de: Determinar la presencia no de sustancias antimicrobianas evaluando el efecto inhibitorio de estas sobre algunos microorganismos Describir metodologas que permiten evaluar el efecto antibacteriano de diferentes sustancias
Marco terico Mtodo de difusin en placa

Se basa en la difusin de una solucin de agente antimicrobiano desde el reservorio a travs de una capa de agar que ha sido inoculada con un microorganismo. Se colocan cantidades medidas de las sustancias a ensayar en cajas con medio de cultivo slido inoculado con un microorganismo. Las cajas se incuban para permitir el desarrollo del microorganismo. La respuesta obtenida es una zona clara (halo) de inhibicin del crecimiento en torno a los reservorios. La base cuantitativa del ensayo es la relacin entre el dimetro de la zona de inhibicin y el dimetro del antibitico.

El mtodo de difusin en placa incluye los siguientes aspectos: - Preparacin y estandardizacin del inoculo - Inoculacin del medio de cultivo - Preparacin de cajas de petri - Preparacin del control positivo o estndar - Preparacin de las sustancias a evaluar - Colocacin de las muestras en los reservorios o pozos - Predifusin - Incubacin - Lectura de resultados
Reactivos para mtodo de difusin en agar Medio agar Mueller - Hinton

De los muchos medios disponibles, se considera el Agar Mueller - Hinton como el mejor, para pruebas de susceptibilidad de rutina de bacterias por las siguientes razones: - Reproducibilidad aceptable para ensayos de susceptibilidad - Es bajo en inhibidores de sulfonamida, trimetoprim, y tetraciclina - Crecimiento satisfactorio para la mayora de los patgenos
Estndar de turbidez para preparacin del inculo

Para estandarizar la densidad del inculo para una prueba de susceptibilidad, se utiliza estndar de turbidez de BaSO4, equivalente a un estndar 0.5 McFarland o su equivalente ptico. Un estndar de 0.5 McFarland de BaSO4 se prepara como sigue: 1. Una alcuota de 0,5 ml de 0,048 m/L de BaCl2 (1,175% p/v BaCl2 x 2H2O) se agrega a 99,5 ml de H2SO4 de 0,18 mol/L (1% v/v) con agitacin constante para mantener la suspensin. 2. La densidad correcta del estndar de turbidez debera verificarse usando un espectrofotmetro con una celda de 1 cm. de paso de luz con una cubeta de calibracin para determinar la absorbancia. La absorbancia a 625 nm debe ser 0,08 a 0,10 para el estndar de 0,5 McFarland.

3. La suspensin de Sulfato de Bario debe transferirse en alcuotas de 4 a 6 ml a tubos con tapa atornillada del mismo tamao que aquellos que se usan para el crecimiento o dilucin del inculo de bacterias. 4. Estos tubos deben ser bien sellados y almacenados en la oscuridad a temperatura ambiente. 5. El estndar de turbidez debe ser bien agitado en un vortex mecnico antes de usar y se debe revisar que haya una apariencia turbia uniforme. Si aparecen partculas grandes debe ser reemplazado. Suspensiones de partculas de ltex pueden agregarse para agitar invirtiendo el tubo suavemente sin usar vortex. 6. El estndar de Sulfato de Bario debe ser reemplazado o verificado su densidad mensualmente.
Procedimiento Preparacin del inculo

- Tomar de 3 a 5 colonias bien aisladas y del mismo tipo de morfologa, transferir a un tubo con 4 a 5 ml de un medio de cultivo adecuado, tal como infusin cerebro corazn (BHI). - El caldo de cultivo es incubado a 35C por 24 h. - La turbidez del caldo se ajusta con solucin salina estril o con caldo para obtener una turbidez de Abs= 0.1 a = 625 nm ptimamente comparable a un estndar de 0,5 McFarland.
Inoculacin de las cajas

En las cajas de petri se adicionan 100 l de la cepa bacteriana y 20 ml de agar Mueller Hinton a una temperatura de 50 C. Agitar bien y en diferentes direcciones. Despus de solidificado realizar las perforaciones con una sacabocado de 5 mm o una pipeta Pasteur estril , rompiendo el fondo del agar, se adiciona a cada uno 15 l del agar para sellar y garantizar que todos los pozos se encuentran con la misma profundidad. Posteriormente adiciona en cada uno de los pozos 10 l de la sustancias a evaluar. Se incuba a 37 C durante 24 horas. A continuacin se hace la lectura del halo de inhibicin para cada muestra. Siempre se deben colocar un control positivo, (usualmente es un antibitico) un control negativo (generalmente el solvente donde se encuentra diluida la solucin a evaluar) y un control de crecimiento bacteriano

Preparacin sustancia a evaluar
Pesar una cantidad determinada de la sustancia a evaluar y diluir segn caractersticas de la sustancia. Hasta obtener una concentracin conocida, realice dos diluciones seriadas coloque 15 l de cada concentracin en el pozo.
Adicionar 100l bacteria (Abs 0.1)+25ml agar a 50C Mezclar uniformemente Dejar secar hasta solidificacin
Perforar los pozos por medio de sacabocado
Adicionar a cada uno 15l agar, para sellar el pozo
Adicionar a cada uno 10l de la sustancia correspondiente

10l 10l
Control
10l 10l 10l
100 mg/ml 50 mg/ml
25 mg/ml
DMSO 99%
Incubar por 24h a 37C Medicin del halo de inhibicin
Lectura de resultados
las
cajas
interpretacin
de
los
Las zonas de inhibicin resultantes deben ser uniformemente circulares en una capa homognea de crecimiento. Los dimetros de la zona de inhibicin completa son medidos en mm. pasando por el centro

del disco. Los tamaos de las zonas de inhibicin son interpretados para ser informado como susceptible, intermedio, o resistente a los antimicrobianos que se han evaluado.
Sensible
Implica que una infeccin debido a una cepa puede ser apropiadamente tratada con la dosis de agente antimicrobiano recomendado para ese tipo de infeccin y especie infectante.
Intermedio
Incluye aislamientos con agentes antimicrobianos con una concentracin inhibitoria mnima (CIM) que se aproximan usualmente a nivel de tejido y sangre disponible y para los cuales su velocidad de respuesta puede ser ms lenta que la de los aislamientos susceptibles.
Resistente
Las cepas resistentes no son inhibidas por la concentracin sistmica usualmente alcanzable de un agente cuando los esquemas de dosificacin normal son usados. Pueden tener CIM que caen dentro del rango donde estn disponibles mecanismos de resistencia especficos.
Preguntas Cul es la importancia de encontrar nuevas fuentes de sustancias antibacterianas.

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Si usted encontrara que un extracto vegetal tiene potencial efecto antibacteriano aplicando sus conocimientos de qumica qu realizara.
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Cul es la razn por la que generalmente se encuentran sustancias con mayor efecto de inhibicin contra bacterias gram positivas que contra gram negativas.
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Describa tres mecanismos de accin antibiticos frente a las bacterias.

_____________________________________________ _____________________________________________ _____________________________________________
de
los
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Control microbiolgico de manipuladores

Introduccin
Todos los aos, miles de personas alrededor del mundo sufren intoxicaciones por consumir alimentos contaminados por microorganismos patgenos. Una herramienta bsica y efectiva para garantizar la inocuidad, sanidad y calidad de los alimentos, es la implementacin de un plan de monitoreo microbiolgico de materias primas, productos en proceso y terminados; como tambin de las superficies de contacto de los alimentos en las instalaciones y del ambiente de las plantas procesadoras. El operario desempea un papel muy importante en la industria cosmtica, farmacutica y de alimentos Por lo tanto la herramienta de trabajo mas utilizada son las manos las cuales se deben mantener aseadas siguiendo una estricta rutina de limpieza, que asegure la calidad de los productos elaborados. Este anlisis aplica a los auxiliares de fabricacin y operarios de envase primario que son las personas que tienen contacto con el producto. El control se lleva a cabo en forma espordica y sin avisar al personal el da y la hora en que se va a realizar el anlisis. Dentro de los datos que deben incluirse en las muestras estn, fecha de la toma de la muestra, la hora, el producto que se esta trabajando y los nombres de las personas muestreadas. Estornudar y toser son formas obvias de extender una infeccin, pero las manos del manipulador de alimentos, representan el vehiculo mas comn por el cual la contaminacin procedente del cuerpo humano y de otras fuentes de enfermedades llega hasta los alimentos. Este transporte de microorganismos puede implicar actos principales simples y descuidos tales como; rascarse la nariz, frotarse una oreja, rascarse el cuero cabelludo, tocar con los dedos granos y heridas, toser y estornudar sin cubrirse con un pauelo, etc. Sin embargo tambin pueden implicar mtodos de manejo de alimentos, que son mucho mas graves que los malos modales. Cualquiera que sea la causa, podemos evitar gran parte de los problemas de contaminacin por el simple hecho de lavarse muy bien las manos. Existen diversos mtodos para evaluar las manos de los operarios donde se incluyen: contacto, enjuague e hisopo, entre otros. Es responsabilidad del manipulador, tener conciencia acerca de la importancia de practicar hbitos personales higinicos y manejar adecuadamente los productos, con el fin de proporcionar al consumidor final una buena calidad.
Objetivos
Efectuar anlisis microbiolgico de manipuladores Identificar los principales microorganismos que se encuentran en los manipuladores de alimentos de las cafeteras de la Universidad Tecnolgica de Pereira
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Materiales
- 60 ml de agar OGY fundido (Oxitetraciclina Glucosa Yeast) - 60 ml de agar VRB fundido (Violet Red Bile Agar) - 6 cajas de petri estriles - Tubo con 10 ml de caldo tripticasa - Hisopos estriles - Pipetas de 1 ml estriles
Procedimiento
Tome el hisopo estril, desempquelo y mjelo en el caldo, escurra el hisopo contra las paredes internas del tubo. El hisopo se debe pasar por todas las superficies de las manos incluyendo las uas, mjelo nuevamente para dejar en el tubo los microorganismos y luego contine con el recorrido por las manos, completando la izquierda y la derecha, por ultimo deje el hisopo en el tubo. A partir del tubo tome 2 ml, 1 ml, 0.1 ml y siembre en cada caja y adicione agar OGY fundido, homogenice e incube a 22 OC de 3 a 5 das. Este mismo procedimiento se repite pero adicionando agar VRB y llevando a incubar a 35 C de 24 a 48 horas. Despus de la incubacin, seleccione la caja que presente el mejor recuento, realice este y haga la conversin necesaria para informar en trminos de 1 ml.
Nota : Este examen se debe hacer antes y despus de lavarse las manos, para evaluar el proceso de
limpieza y desinfeccin.
Actividad Grupal
Sern distribuidos por el profesor para muestrear las personas de las cafeteras de la UTP, realizaran frotis de manos y siembra directa de una persona manipuladora de alimentos, luego informaran el recuento y el tipo de microorganismos aislados.
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Preguntas Cules son los implementos bsicos de bioseguridad que debe tener todo manipulador de alimentos
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Describa algunos microorganismos indicadores alteracin y contaminacin en los alimentos
de
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Elaborar una tabla para mostrar los resultados
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Control de calidad de cosmticos

Introduccin
Los cosmticos por su uso sobre la piel no deben contener patgenos como Staphylococcus aureus, ni Pseudomonas aeruginosa, ya que estos microorganismos pueden llegar a complicar el cuadro clnico en lesiones causadas por el acne u otro tipo de lesiones en la piel, as mismo la presencia de enterobacterias es inaceptable porque indica calidades deficientes en su elaboracin, adems los cosmticos deben mantenerse en unos limites de tolerancia para bacterias mesofilas y mohos y levaduras. Cuando se preparan muestras cosmticas para la realizacin de un anlisis microbiolgico, es importante garantizar que los microorganismos, que pudiesen estar como contaminantes, van a ser detectados y que el analista, durante la realizacin del ensayo, no aporta ningn tipo de contaminante.
Objetivos
Evaluar la calidad microbiolgica de algunos cosmticos Leer e interpretar los diferentes resultados
Procedimiento Recuento de bacterias mesofilas

Materiales
- 1 frasco con 90 ml de caldo TAT (caseina lecitina polisorbato) - 2 tubos con 9 ml de caldo TAT - 3 pipetas de 1 ml - 120 ml de agar casoy fundido - 1.2 ml de solucin de TTC (Cloruro de trifenil tetrazolio) al 0.5% Pesar 10 g del producto (cosmtico) directamente en el frasco con los 90 ml de caldo TAT, mezclar dejar 15 minutos a temperatura ambiente (esto ayuda a inactivar el preservante) Hacer diluciones 10-2 y 10-3 Sembrar por duplicado 1 ml de cada una de las diluciones en profundidad Adicionar 15-20 ml de agar casoy Mezclar y dejar solidificar Incubar a 37 0 C por 48 horas
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Realice el recuento e informe correctamente
Recuento de Hongos y Levaduras

Materiales
- 120 ml de agar YGC (Yeast Glucose Chloramphenicol) - 6 cajas de petri A partir de las diluciones realizadas para el recuento de bacterias mesofilas, sembrar por duplicado 1 ml de cada una de las diluciones en profundidad Adicionar 15-20 ml de agar YGC, mezclar y dejar solidificar Incubar a 25 o C por 96 horas Realizar el recuento
NMP de coliformes y Escherichia coli

Materiales
- 9 tubos con 10 ml de caldo LMX - Lmpara de luz U.V - Reactivo de Kovac
Metodologa
A partir de las diluciones realizadas para el recuento de bacterias mesofilas, sembrar 1 ml de cada dilucin en tres tubos para crear una serie. Mezclar Incubar a 35 C por 24 horas Leer de la siguiente manera: coliformes por cambio de color a verde azulado Para la lectura de E. coli se toman los tubos positivos para coliformes se observan bajo luz uv, los tubos que presenten fluorescencia azul positiva, se presumen como E. coli, se confirman con la presencia de un anillo color rojo al adicionar el reactivo de Kovac.
Prueba de aerouginosa
Materiales
ausencia
/presencia
para
Pseudomonas
- 1 frasco con 225 ml de caldo triptofano - 2 cajas de agar cetrimide - 1 tira de oxidasa
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Pesar 25 g de la muestra, adicionar al caldo triptofano, incubar caractersticas, hacer prueba de oxidasa. por 24-48 horas, revisar colonias
Preguntas Como es la calidad microbiolgica analizados por usted, Explique. de los cosmticos
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Qu otros anlisis se les realizan a los cosmticos.

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Cules son los lmites permitidos en cada uno de los anlisis, comprelos con sus resultados.
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Qu es la FDA y cual es la normativa que regula la calidad de los cosmticos.

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Curva de crecimiento bacteriano

Objetivos
Cuantificar por espectorofometria el crecimiento de una poblacin bacteriana Correlacionar los resultados de turbidez con el recuento viable Explicar el crecimiento bacteriano en trminos matemticos
Introduccin
Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biolgico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicacin celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicacin se traduce en un aumento del tamao del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisin o por gemacin, lo que ocurre es un aumento de la poblacin. En los microorganismos cenocticos (en los que la duplicacin del genoma no se acompaa de divisin celular) el crecimiento se traduce en aumento de tamao de la colonia cenoctica. El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista: A escala individual A escala poblacional Los eventos de crecimiento en el mbito individual hacen referencia al ciclo celular, y dentro de ste podemos abordar los siguientes temas:

Inicio y transcurso de la replicacin cromosmica y de plsmidos Segregacin de cromosoma y plsmidos a las clulas hijas Sntesis de nuevos materiales de las envueltas, sobre todo de pared celular Seales que coordinan la replicacin genmica con la divisin celular
El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes tpicos:

Cintica del crecimiento Factores que afectan al tiempo de generacin (g) Factores ambientales que limitan el crecimiento
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Medida del crecimiento de poblaciones bacterianas
En la prctica habitual del laboratorio, los experimentos se realizan siempre con poblaciones bacterianas, a menudo tomando muestras en diversos momentos de su crecimiento en un medio de cultivo. El crecimiento de una poblacin o cultivo bacteriano se puede expresar en funcin de:

aumento de masa del cultivo aumento del nmero de clulas
Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre s en cultivos que estn en crecimiento balanceado o equilibrado (en el que todos los componentes aumentan una misma proporcin por unidad de tiempo).
Marco terico
Para establecer el crecimiento bacteriano en trminos de masa celular existen diferentes mtodos dentro de los cuales se destacan: determinacin de peso hmedo, determinacin de peso seco, determinacin de nitrgeno total, medida de consumo de nutrientes, mtodos turbidimetricos, recuentos en cmara, recuento de viables en placa, y recuento en filtros entre otros. El crecimiento bacteriano esta sometido a principios matemticos elementales que permite predecir el comportamiento del sistema en cualquier momento dado. La duplicacin de un cultivo bacteriano sigue, inicialmente los principios bsicos de una reaccin de primer orden con relacin al nmero de clulas existentes, por tanto la rapidez de la duplicacin celular ser: dN/dt = KN En donde N es el nmero de clulas presentes en un momento dado, y K la constante de rapidez de crecimiento, integrando la expresin anterior entre los tiempos se tiene la expresin: ln X ln X0= K (t-to) X y Xo corresponden a la cantidad de cualquier componente de sistema (# de clulas, DNA, RNA o protenas). La ecuacin tambin puede expresarse como: X = Xo e k (t-to)
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A menudo el crecimiento bacteriano se describe mediante otros parmetros, entre los cuales el ms frecuente es el tiempo de duplicacin D, que se define como el tiempo necesario para que ocurra una duplicacin del nmero de clulas: D = ln 2/ K Como el ln de 2 es 0.693. Entonces: D = 0.693/K K es un valor especfico para cada microorganismo
Materiales
- Cultivo bacteriano - Espectrofotmetro - Erlenmeyer - Agar Plate Count - Pipetas - Tubos con 5 ml de caldo BHI
Procedimiento
Tome una colonia de la cepa a estudiar y dilyala en 10 ml de caldo BHI, incube por 24 horas. Tome 0.3 ml del medio anterior y adicinelos a un erlenmeyer con 30 ml de caldo BHI (Cultivo inicial). Tome 5 ml del medio anterior y colquelos en una celda de espectrofotometra. Mida la O.D (densidad ptica) y denomine este tiempo como tiempo cero. Las mediciones se harn a una longitud de onda de 550 nm Este valor refleja un parmetro proporcional a la concentracin de masa celular (siguiendo la ley de Lambert-Beer). El blanco es el medio de cultivo sin inocular. A partir del tiempo considerado como 0 se seguirn tomando muestras de 5 ml cada 30 minutos del cultivo inicial el cual esta en agitacin a una temperatura de 37 C en las que se medir la turbidez para reflejarlo con posterioridad en una grfica. Cada vez que mida la O.D deber preparar 5 diluciones seriadas y sembrar 1 ml de cada dilucin en agar Plate Count, se debe repetir el anterior procedimiento hasta que se obtengan 8 lecturas.
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Los resultados de O.D y de UFC/ml de cada uno de los experimentos se irn registrando, para que sean a continuacin representados sobre papel semilogartmico (en ste, la escala logartmica transforma directamente los valores obtenidos en las posiciones de sus logaritmos correspondientes), de forma que en el cuadernillo final aparezcan una grfica del cultivo. De estas grficas se podr observar: 1) Fase exponencial y entrada en estacionaria (la fase de latencia no se ve en este medio y condiciones, y la de muerte tarda mucho en llegar). 2) Tiempo de generacin, calculable a partir de la pendiente de la grfica en su fase exponencial.
Tabla de datos
Tiempo (min) 0 30 60 90 120 150 180 210 240 O.D. Recuentos UFC/ml
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Preguntas Cules son las ventajas y desventajas de los mtodos directos e indirectos de cuantificacin de microorganismos.
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Considerando que el tiempo de duplicacin de E. coli y M. tuberculoso son 0.35 y 6 respectivamente realice una grfica donde represente el crecimiento bacteriano de estos dos microorganismos. Asuma que inicialmente hay 100 clulas en cada uno de los cultivos.
Qu importancia tiene el recuento de microorganismos en microbiologa industrial.

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Fermentacin alcohlica - elaboracin del vino

Introduccin
Los microorganismos han sido utilizados durante siglos para modificar diversas materias primas y obtener as bebidas fermentadas, las cuales constituyen un rea muy importante en la industria alimentara. Dichas modificaciones ocurren a travs de un proceso denominado Fermentacin alcohlica, en donde a travs de levaduras como Sacharomyces cerevisiae y Bayanus. Y de bacterias como Zymomonas mobilis. Se asimila la glucosa presente en los zumos de frutas y/o en los desechos orgnicos, para metabolicamente convertirlos en alcohol etlico y otros productos secundarios.
Objetivos
Llevar a cabo los pasos que conlleven a la elaboracin del vino a partir de fruta Identificar la microbiota natural y contaminante del proceso
Marco terico
El vino es el resultado de la transformacin del jugo de la uva o de otros sustratos por medio de la fermentacin alcohlica. El proceso fermentativo se lleva a cabo mediante la inoculacin de cepas puras seleccionadas de levadura, las cuales transforman un medio inestable en uno estable del cual resulta el vino. Dicha estabilidad ha sido el soporte para las industrias vincolas que antiguamente contaban con escasos medios tecnolgicos.
Materiales
- Fruta en estado optimo de madurez - Sacarosa (Azcar comercial) - Vino Blanco - Benzoato de sodio, sorbato de potasio o anhdrido sulfuroso - Hipoclorito de sodio - Botellas de vidrio oscuro con corcho
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- Balanza - Refractmetro - Potencimetro - Termmetro - Mortero - Despulpadora - Escaldador (Estufa y recipientes) - Recipientes plsticos Producto Mora Papaya Naranja Mango Manzana Guayaba Tomate de rbol Durazno Pera Tiempo de escaldado por inmersin (min.) 5 6 5 10 6-8 10 10 10 6-8
Procedimiento
Obtencin del mosto y fermentacin primaria

Lavar y desinfectar los frascos de fermentacin con metabisulfito de sodio al 1%, y luego con acido tartarico al 0.1%. Lavar bien 3 libras de fruta con suficiente agua. Escaldar en agua pura a 90-95C (Ver tabla para el tiempo de acuerdo a la fruta) Inmediatamente despus del tiempo de inmersin, pasar la fruta por agua fra. Choque trmico. Macerar en un recipiente amplio toda la fruta tratando de obtener la mayor cantidad de jugo posible Separar las semillas del mosto. Medir el volmen obtenido. Verificar la concentracin de slidos solubles en la fruta por lectura refractomtrica y determinar el pH por medio del potencimetro.
101

Por cada Kg de jugo de fruta se obtendr aproximadamente 1 litro de vino. Pese el jugo obtenido. Si el valor encontrado por refractometra (slidos solubles totales) es bajo adicione el 50% en peso de azcar, si el valor es moderado adicione el 25% de azcar. El escaldado ha inactivado enzimas y eliminado algunos microorganismos entre ellos los que favorece la fermentacin alcohlica, por lo tanto se hace necesario inocular el mosto obtenido, adicionando el 10% de levadura (disolverla previamente en una alcuota de jugo con azcar para activarla). Vaciar el mosto en el frasco de fermentacin, mezclando muy bien, dejarlo a medio tapar en un sitio oscuro durante ocho das. De esta manera el mosto comenzar naturalmente a fermentar. Cuando el lquido comience a fermentar usted observar un burbujeo dentro de la botella, habr un aumento de volmen del mismo y desprendimiento natural de anhdrido carbnico, mezclar suavemente en el transcurso de este tiempo.
Primer trasiego
Despus de transcurrido el tiempo de fermentacin, iniciar la filtracin con una gasa evitando al mximo que se mezcle el sobrenadante con el sedimento del mosto, ya que ste contiene cido tartarico, el cual produce una mayor acidificacin del vino. Del filtrado, realice coloracin de Gram y siembra en medio selectivo para hongos y bacterias lcticas. Adicionar metabisulfito de sodio al 4% al frasco nmero 1. Ver figura 2. Dejar a medio tapar por tres das.
102

Aclaramiento
Transcurrido este tiempo agregar dos claras de huevo o media cucharadita de gelatina sin sabor. Dejar a medio tapar por 8 das ms.
Segundo trasiego
Filtrar nuevamente el mosto, realizar coloracin de gram y siembra en medio selectivo para hongos.
Pasteurizacin
Colocar en un beaker el vino, taparlo con papel aluminio y llevarlo al bao Maria a una temperatura de 60 C durante 30 min. Al terminar este proceso inmediatamente enfriar en nevera. Adicionar azcar al gusto.
Maduracin final o envejecimiento

Luego de la pasteurizacin, el vino se envasa en una botella color mbar desinfectada segn indicaciones previas, y se lleva a refrigeracin durante 3 semanas. En estos momentos queda listo el vino para ser consumido.
Preguntas Que se observa en los diferentes pasos, donde se practica la coloracin de Gram.
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Que clase de microorganismos se encuentran presentes en el vino, al sembrar las muestras en las diferentes etapas.
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103

Cules son los rangos microbiolgicos permitidos en un vino.
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Qu factores influyen en la fermentacin.

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Cul es la fermentacin primaria.

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Por qu se debe activar adicionarla al mosto.
la
levadura
antes
de
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Fermentacin lctica - elaboracin del yogurt

Introduccin
La fermentacin lctica se llama al proceso celular donde se utiliza glucosa para obtener energa y donde el producto de desecho es el cido lctico. Este proceso lo realizan muchas bacterias (llamadas bacterias lcticas), algunos protozoos, hongos y ocurre en los tejidos animales. Un ejemplo de este tipo de fermentacin es la acidificacin de la leche. Ciertas bacterias (Lactobacilos), al desarrollarse utilizan la lactosa (azcar de leche) como fuente de energa. La lactosa, al fermentar, produce energa que es aprovechada por las bacterias y el cido lctico es eliminado. La coagulacin de la leche (cuajada) resulta de la precipitacin de las protenas de la leche, y ocurre por el descenso de pH debido a la presencia de cido lctico. En ausencia de oxgeno, las clulas animales convierten el cido pirvico en cido lctico. El cido lctico puede ser un veneno celular. Cuando se acumula en las clulas musculares produce sntomas asociados con la fatiga muscular. Cuando se utiliza el cido lctico en los alimentos como conservante tiene excelentes propiedades.
Objetivos
Desarrollar los procesos necesarios para llevar a cabo una fermentacin lctica y obtener yogurt Identificar las variables ms relevantes en las propiedades organolpticas del yogurt
Marco terico
El yogurt es un derivado de la leche que se obtiene al aadir a la leche hervida, entera o desnatada los fermentos que degradan la lactosa y la transforman en cido lctico., los microorganismos responsables de este proceso son Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus. Las propiedades que contiene el yogurt, lo hacen un alimento altamente nutritivo pues aporta al ser humano protenas de alta calidad, as como vitaminas, carbohidratos y grasas. Para la elaboracin de yogurt se parte generalmente de una leche con un contenido de slidos no grasos del 15 al 16%. Esto se puede observar en la acidez titulable al trmino de la incubacin ya que los valores que se especifican son de 75 a 90Th.
106

La leche ms apropiada es la que posea un contenido elevado de protenas por razn de su alta densidad. A pesar de ello no es necesario elegir una leche con una proporcin elevada de extracto seco para la produccin de yogurt, pues aquel puede ser aumentado ms tarde por medio de otros productos como, leche descremada concentrada, leche en polvo descremada, suero, lactosa. Para que el cultivo iniciador se desarrolle, han de tenerse en cuenta los siguientes criterios:

Bajo recuento bacteriano. Libre de antibiticos, desinfectantes, leche masttica, calostro y leche rancia. Sin contaminacin por bacterifagos.
Las cualidades nutritivas del yogurt provienen no slo de la presencia de los compuestos de la leche, sino tambin de la transformacin de stos como resultado de la fermentacin cido-lctica causada por los microorganismos. La ingestin de este producto es recomendable en todas las edades. Para la mayor parte de los lactantes intolerantes a las leches constituye un magnfico alimento, pues la reduccin moderada de su contenido de lactosa, en comparacin con el de la leche, lo hace ms apropiado para los pacientes con deficiencia de lactasa. Las propiedades bacteriostticas del yogur contribuyen a la resistencia a las infecciones, es decir , permiten prevenir los trastornos intestinales evitando la colonizacin y el desarrollo de grmenes patgenos, estimulando el sistema inmunitario ya que contienen bacterias activas que forman parte de nuestra microbiota intestinal indispensable, las cuales participan en la descomposicin de los alimentos en el proceso digestivo. El yogurt se cataloga como un producto de alta digestibilidad, que aumenta el coeficiente de absorcin de numerosas sustancias, tales como protenas y grasas. Adems contiene protenas, grasas graduales, hidratos de carbono (con predominio de la lactosa), vitaminas del tipo A y B, niacina y cidos pantotnico y flico difciles de encontrar en otros alimentos, as como diferentes minerales, adems de fsforo, potasio, magnesio, zinc y yodo, entre otros. El consumo de yogurt intensifica la retencin de fsforos, hierro y calcio en comparacin con la leche; tambin cabe destacar su participacin en la disminucin de los problemas alrgicos; el componente bsico del yogurt es la leche, a la que se agregan enzimas que favorecen la fermentacin cido-lctica hasta obtener la coagulacin. La calidad del producto que se obtiene depende fundamentalmente de la calidad de los fermentos y del tipo de leche que se utilice, cada una posee distintas proporciones de agua, protena, lactosa, grasas y sales minerales; no obstante, se puede tomar como base diferentes tipos de leches, como de vaca, oveja, cabra, o bfala.
107

Tambin debe usarse un sitio adecuado con suficiente calor para que el cultivo del yogurt se desarrolle, por ejemplo: cerca de la cocina o, si se prefiere, colocar en un horno un recipiente con agua a una temperatura mantenida entre 41 y 43 C durante 2 a 3 h. Esto es de estricto cumplimiento, pues si la temperatura asciende a 49 C el cultivo muere, y si desciende a 35 C la accin de los microorganismos se detiene.
Procedimiento
- Tomar 2 L de leche entera pasteurizada - Calentar en un bao Mara hasta que se alcance una temperatura de 45 C - Adicionar el 3 % del cultivo bacteriano (Cepa) o Yogurt natural al 10% - Adicionar 0.15% de gelatina sin sabor, y el 0.5% de leche en polvo - Mezclar muy bien con movimientos envolventes y cubrir con papel aluminio - Dejar quieto mientras se lleva a cabo el proceso de fermentacin, siempre a 42 C - Una vez este haya finalizado - Licuar con mermelada o con fruta - Dejar enfriar Antes de iniciar con el procedimiento debe titular la leche y determinar el % de acido lctico (este procedimiento lo debe realizar cada hora durante el proceso de fermentacin). Al cultivo inicial realizarle una coloracin de gram, y durante cada hora repetir el procedimiento y observar la relacin de Streptoccocus y Lactobacilus durante la fermentacin. En los productos lcteos fermentados, la fermentacin culmina cuando se alcanza un valor de 4,2 a 4,5 de pH aproximadamente, o cuando se observa un valor de 0,75 a 0,8 de acidez titulable. Una vez lograda la acidez requerida, debe enfriarse a 4 o 5 C para detener la fermentacin y evitar que se siga produciendo cido lctico.
Preguntas Qu son probioticos y qu efecto tienen en la salud humana.

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108

Mediante un grfico muestre la relacin de Streptococcus termophilus y Lactobacillus bulgaricus durante el proceso de fermentacin, explique esto en trminos del pH.
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Elabore un diagrama de flujo del proceso identifique los PCC (Puntos crticos de control).
Defina Kefir y Sinresis.

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Cules son las caractersticas organolpticas que debe tener un Yogurt de buena calidad.
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109
Bibliografa
Carrascal A.K (2004). Guas laboratorio de microbiologa industrial para la carrera de microbiologa. Pontificia Universidad Javeriana. INVIMA. Ministerio de Salud. Manual de normas tcnicas de calidad. Gua tcnica de anlisis. Tercera revisin. 2002. Martnez Maria Mercedes. Microbiologa Universidad Nacional abierta y a distancia 2001. Toro Daniel Ricardo. Laboratorio de Microbiologa ambiental 6 Edicin. Universidad de Caldas. Daz Barco Hilda Esperanza. Guas tericas y prcticas Control de calidad en procesos industriales. Universidad Catlica de Manizales 1997. Gutirrez Sofa, Castro Norma. Microbiologa de Cosmticos. Universidad Central de Venezuela. Gua prcticas de Microbiologa Industrial. Departamento de Microbiologia. Universidad Complutense de Madrid.

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Microorganismo (segn RD 664/97): Toda entidad microbiolgica, celular o no, capaz de

Cultivo celular (segn RD 664/97): El resultado del crecimiento in Vitro de clulas

Contaminacin (segn la OMS): Presencia de un agente infeccioso en la superficie del

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Refrigeradores : Se usan con el fin de almacenar reactivos y medios de cultivos ya preparados.

Cristalera : Frascos, vasos de precipitado, erlenmeyers, tubos de ensayo probetas y morteros

Asas para Siembra : Consisten un alambre fabricado en nquel-cromo encabado en un

Normas generales y conocimiento del laboratorio de microbiologa

Taller 1. Indique si las siguientes afirmaciones son falsas o verdaderas.

2. Cules son las normas generales de utilizacin de equipos y especifique la importancia.

3. Qu son agentes cultivos celulares.

Agente biolgico : _________________________________________________________

Normas generales y conocimiento del laboratorio de microbiologa

Cultivos celulares : _____________________________________________________

4. Para qu se utiliza la autoclave.

1. __________________________ 2. __________________________ 3. __________________________ 4. __________________________ 5. __________________________

6. Explique el procedimiento correcto para trabajar en una cmara de flujo laminar.

Partes del microscopio Componentes del microscopio

Manejo del microscopio

2. Elabora un dibujo del microscopio ptico y seala todas sus partes.

6. A travs de Internet ingrese a la siguiente pgina y desarrolle el e jercicio planteado all:

Inoculacin de los medios de cultivo

Mtodos de cultivo de uso rutinario

Nota : Observar la demostracin previa del profesor.

Siembra por agotamiento

Siembra en tubos de agar tendido:

Siembra en superficie y picadura:

Incubacin de los medios de cultivo

Tipos de colonias microbianas

Preguntas 1. Qu es un cultivo axenico.

4. Escriba tres posibles causas de contaminacin de un cultivo.

5. Cundo se utiliza la siembra masiva y cundo por agotamiento.

Procedimiento Preparacin del frotis:

1. Calentar el asa de inoculacin hasta que este al rojo

2. Tomar la porcin de la muestra que se va a examinar por medio de un asa o escobilln

3. Colocar la muestra sobre un portaobjetos limpio y sin grasa, debidamente marcado

4. Trazar con la muestra una espiral del centro a la periferia*

5. Calentar nuevamente el asa para desinfectarla

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Marco terico Los medios de cultivo en microbiologa

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

Conservacin de los medios de cultivo deshidratados

Inoculacin de los medios de cultivo

Esquematizacin de la preparacin cultivo

Mtodos de cultivo de uso rutinario

Incubacin de los medios de cultivo

Para consultar Qu es un cepario y cmo se debe mantener.

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Enuncie dos medios de cultivo selectivos y dos medios de cultivo diferenciales.

Cmo se reactivan las cepas consiguen comercialmente.

1. 2. 3. 4. 5. __

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