MICROESFERAS BIODEGRADABLES DE POLI(D,L-LÁCTICO) CONTENIENDO PROGESTERONA 353

BIODEGRADABLE MICROSPHERES OF POLY(D,L-LACTIDE) CONTAINING PROGESTERONE

Microesferas biodegradables de poli(D,L-láctico)

conteniendo progesterona
Biodegradable microspheres of poly(D,L-lactide) containing progesterone

CHIAPPETTA D1**, LEGASPI MJ1, NISELMAN V2, PASQUALI R1, GERGIC E1, RODRÍGUEZ LLIMÓS AC1,
BREGNI C1
1
Departamento de Tecnología Farmacéutica, 2Departamento de Fisicomatemática, Facultad de Farmacia
y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Junín 956 (1113) Buenos Aires, Argentina.
*
Correspondencia: diegochiappetta@yahoo.com.ar

RESUMEN
Se obtuvieron microesferas de poli(D,L-láctico) conteniendo progesterona por medio de una emulsión
simple aceite en agua empleando una técnica de evaporación de solvente. Se realizó un experimento con
un diseño factorial 2 3 para estudiar el efecto de tres variables independientes (cantidad de principio
activo, cantidad de polímero y concentración de alcohol polivinílico) sobre las variables dependientes
(encapsulación de principio activo y tamaño de partícula). Las tres variables independientes influyeron
significativamente sobre la encapsulación de progesterona. En el caso del tamaño de partícula, las
variables que ejercieron una influencia significativa fueron la concentración de alcohol polivinílico y la
cantidad de polímero. Los estudios de liberación in vitro han mostrado que de acuerdo al tamaño de
partícula se pueden obtener formulaciones que logran liberar progesterona en pocos días u obtener una
liberación sostenida durante 28 días. El estado físico del fármaco se investigó por calorimetría diferen-
cial de barrido. Los estudios muestran que existe una interacción fisicoquímica entre la progesterona y
el polímero.
PALABRAS CLAVE: Diseño factorial. Liberación sostenida. Microesferas biodegradables. D,L-PLA. Progesterona.

ABSTRACT
Microspheres of poly(D,L-lactide) containing progesterone were prepared by the solvent evaporation
method using a simple oil water emulsion. 2 3 factorial design was used to determine the effect of three
independent variables (amount of drug, amount of polymer and concentration of polyvinyl alcohol) over
the dependent variables (drug content and particle size). The three independent variables influenced
significantly over the percentage drug encapsulated. On the other hand, in the particle size case, the
variables which produced a significantly influence were the polyvinyl alcohol concentration and the
amount of polymer. The in vitro release studies have shown that according to the particle size, it can
be obtained formulations which are able to release progesterone in a few days or a sustained release
among 28 days. The physical state of drug has been examined by differential scanning calorimetric. The
studies indicate that exists a physicochemical interaction between the progesterone and the polymer.
KEY WORDS: Biodegradable microspheres. Factorial design. D,L-PLA. Progesterone. Sustained release.

INTRODUCCIÓN INTRODUCTION

El control terapéutico de la fertilidad se lleva The therapeutic fertility control is mainly

a cabo principalmente con la administración realized by oral administration of steroids. The
oral de esteroides. La desventaja de utilizar disadvantage of the oral route is the require-
esta vía de administración se encuentra prin- ment of daily ingestion and the subsequent
cipalmente en una constante variación en la daily variations in blood concentration.

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concentración plasmática al ser administrada
diariamente.
Por esta razón, existen otros sistemas de
liberación tales como implantes (Norplant ®)1
y dispositivos intrauterinos (Progestasert®)2, los
cuales liberan levonorgestrel y progesterona
en forma controlada desde matrices poliméri-
cas no biodegradables.
Resulta de elección utilizar polímeros bio-
degradables, los cuales presentan una ventaja
significativa con respecto a los no biodegra-
dables, por la atoxicidad y biocompatibilidad
de sus productos de degradación. Los políme-
ros biodegradables pueden ser de origen na-
tural o sintético.
Las ventajas de utilizar polímeros biode-
gradables naturales se relacionan con su bajo
costo, su biocompatibilidad y la buena solu-
bilidad en medios acuosos. A pesar de pre-
sentar estas ventajas, los polímeros naturales
ven limitado su uso debido a la variabilidad
en su composición y peso molecular entre lotes.
En contraste a esto, los polímeros biodegra-
dables sintéticos poseen una alta reproducibi-
lidad con respecto a la relación de monóme-
ros y al peso molecular. Esto permite controlar
y predecir las cinéticas de degradación de los
polímeros 3.
Durante las últimas dos décadas, se ha
incrementado el desarrollo de sistemas de li-
beración de anticonceptivos con polímeros
biodegradables sintéticos debido a estar libres
de los problemas asociados a los polímeros
naturales. Implantes, films y microesferas han
sido preparados con polímeros biodegradables
sintéticos como poli(láctico), poli(láctico- co-
glicólico) y poli(e-caprolactona) 4-12.
La aplicación de un diseño estadístico para
optimizar el desarrollo de formulaciones far-
macéuticas podría proveer una metodología
económica y eficiente. El diseño factorial es
una herramienta estadística que nos permite
obtener la información necesaria para enten-
der la relación entre las variables controlables
(independientes) y las variables de performance
(dependientes). Esta técnica ha sido común-
mente empleada en el desarrollo de compri-
midos13-15, microcápsulas16,17 y suspensiones 18.
El objetivo de este trabajo es obtener un
sistema microparticulado biodegradable capaz
de liberar progesterona (PRG) en forma sos-
tenida para lo cual, se ha utilizado un diseño
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CHIAPPETTA D, LEGASPI MJ, NISELMAN V, et al.
For this reason, there are others contro-
lled release systems such as implants (Nor-
plant®)1 and intrauterine device (Progestasert®)2,
which deliver progesterone and levonorges-
trel from non-biodegradable polymer matri-
ces.
Because of the atoxicity and biocompatibi-
lity of its degradation products it is better to
use biodegradable polymers, which present a
significantly advantage in relation with non-
biodegradable. The biodegradable polymers can
be from a natural or a synthetic origin.
The advantages of using natural biodegra-
dable polymers are based on its low cost, its
biocompatibility and its solubility in aqueous
medium. Although these advantages, the na-
tural polymers have a limited use due to the
variability in its composition and molecular
weight between batches. On the other hand,
synthetic biodegradable polymers have a high
reproducibility in relation with the monomers
ratio and molecular weight. This allows to control
and predict the degradation kinetics of poly-
mers 3 .
During the last two decades, synthetics
biodegradable polymers have increased their
usage as steroid hormones delivery systems.
These polymers do not have the problems
associated with natural polymers. Implantable
rods, films and micropsheres have been pre-
pared from a number of synthetic biodegra-
dable polymers such as poly(lactide),
poly(lactide- co-glicolide) and poly(e-caprola-
ctone) 4-12 .
The application of a statistical design could
provide an economic and efficient methodo-
logy to enhance the pharmaceutical formula-
tion development. A factorial design is a sta-
tistical tool which is able to give the necessary
information to understand the relationship
between independent and dependent variables.
This technique has been usually employed in
tablet 13-15 , microcapsule16,17 and suspension 18
developments.
The goal in this work is to obtain a micro-
particle biodegradable system enable to libe-
rate PRG in a sustained way. For this reason,
a factorial design 2 3 has been followed to
optimise the development process and to im-
prove the pharmacotechnical features of the
formulations. Besides, in vitro release was
studied and also the pharmaceutical active
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BIODEGRADABLE MICROSPHERES OF POLY(D,L-LACTIDE) CONTAINING PROGESTERONE
factorial 23 para optimizar el proceso de desa-
rrollo y mejorar las características farmaco-
técnicas de las formulaciones. Además, se
estudió la liberación in vitro y el estado físico
del principio activo, en forma cualitativa, por
calorimetría diferencial de barrido (CDB).
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
Progesterona, 101,0 % (Sigma); poli(D,L-
láctico) (D,L-PLA) (Mw 90.000-120.000) (Sig-
ma); alcohol polivinílico (PVA) (Riedel-de
Haën); cloruro de metileno (Anedra ®) grado
HPLC; fosfato de potasio monobásico (Para-
farm®). Todos los materiales fueron utilizados
como se recibieron.
Diseño factorial de los experimentos
Los experimentos fueron realizados siguien-
do un diseño factorial 23. En este diseño, las
variables independientes son cantidad de prin-
cipio activo (X1), cantidad de polímero (X2) y
concentración de PVA (X3). La encapsulación
de principio activo (Y1) y el tamaño de partí-
cula (Y2) son las variables dependientes. Las
variables independientes y los niveles utiliza-
dos en la preparación de las microesferas se
encuentran detallados en la Tabla 1. El obje-
tivo de realizar un diseño factorial se centra
en el hecho de poder estudiar el efecto de las
variables y sus interacciones utilizando una
herramienta estadística adecuada. Todas las
formulaciones fueron preparadas por triplica-
do. Los datos fueron evaluados utilizando el
programa computacional S-Plus 2000 ®.
355
physical state, in a qualitative way, through
differential scanning calorimetry (DSC).
MATERIAL AND METHODS
Materials
Progesterone, 101.0 % (Sigma); poly(D,L-
lactide) (D,L-PLA) (Mw 90.000-120.000) (Sig-
ma); polyvinyl alcohol (PVA) (Riedel-de Haën);
dichloromethane (Anedra®) grade HPLC; po-
tassium phosphate monobasic (Parafarm®). All
materials were used as received.
Factorial design of experiments
The experiments were performed with a 23
factorial design. In this design, the indepen-
dent variables are amount of drugs (X1), amount
of polymer (X 2) and concentration of PVA
(X 3). The drug content (Y1) and the particle
size (Y 2 ) are the dependent variables. The
independent variables and the levels used in
the preparation of the microspheres are shown
in Table 1. The purpose of using a full facto-
rial experimental design was to conduct a
comprehensive study of the effect of the pro-
cess parameters and their interaction using
suitable statistical tool. All the batches were
prepared in triplicate. The data were evalua-
ted using the computer program S-Plus 2000®.
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TABLA 1. Variables independientes y sus niveles.

TABLE 1. The independent variables and their levels.

Variable independiente Nivel bajo Nivel alto

Independent variable Low level High level
Cantidad de principio activo (X1) 20 mg 40 mg
Amount of drug (X1)
Cantidad de polímero (X2) 100 mg 200 mg
Amount of polymer (X2)
Concentración de PVA (X3) 0,5 % P/V 2,0 % P/V
Concentration of PVA (X3)

Preparación de las microesferas Preparation of microspheres

Las microesferas de D,L-PLA conteniendo D,L-PLA microspheres containing PRG were

PRG fueron preparadas por medio de una
emulsión simple aceite en agua (O/A) emplean-
do una técnica de evaporación de solvente.
Una cantidad conocida de polímero (D,L-PLA)
fue disuelta en 3 ml de cloruro de metileno.
A esta solución se agregó una cantidad cono-
cida de progesterona (Tabla 2 ). La solución
de polímero y principio activo (fase orgánica)
fue agregada bajo agitación en 60 ml de una
solución acuosa de PVA. La emulsión O/A
así obtenida se mantuvo bajo agitación du-
rante 3 horas hasta la evaporación del cloruro
de metileno. Las microesferas fueron recupe-
radas por filtración y secadas a temperatura
ambiente en desecador durante 24 horas. Las
diferentes formulaciones desarrolladas se de-
tallan en la Tabla 2.
prepared by the solvent evaporation method
using a simple oil water emulsion (O/W). A
known amount of polymer (D,L-PLA) was
dissolved in 3 ml the dichloremethane. A known
amount of progesterone (Table 2) was added
to this solution. The solution of polymer and
drug (oil phase) was added under stirring into
a 60 ml of PVA solution. The O/W emulsion
kept under stirring for 3 hours until the di-
chloremethane evaporation. The microspheres
were recovered by filtration and dried in a
desiccator at room temperature for 24 hours.
The different developed formulations are de-
tailed in Table 2.

TABLA 2. Formulaciones de microesferas de D,L-PLA conteniendo progesterona.

TABLE 2. The contents of D,L-PLA microspheres containing progesterone.

Formulación Cantidad de Cantidad de Concentración de

principio activo (mg) polímero (mg) PVA (% P/V)
Formulation Amount of Amount of Concentration of
drug (mg) polymer (mg) PVA (% W/V)
F1 20 100 0,5
F2 40 100 0,5
F3 20 100 2,0
F4 40 100 2,0
F5 20 200 0,5
F6 40 200 0,5
F7 20 200 2,0
F8 40 200 2,0

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BIODEGRADABLE MICROSPHERES OF POLY(D,L-LACTIDE) CONTAINING PROGESTERONE
Determinación del contenido de principio ac-
tivo
Aproximadamente 20,0 mg de microesfe-
ras fueron exactamente pesadas y diluidas a
100 ml utilizando cloruro de metileno. La
solución resultante se filtró por membrana de
nylon (0,45 mm) y luego de diluciones apro-
piadas la muestra se leyó espectrofotométri-
camente (CARY [1E] UV – Visible Spectro-
photometer Varian) a 239 nm. Todas las
determinaciones se realizaron utilizando como
blanco microesferas sin PRG.
Morfología y distribución del tamaño de par-
tícula
Las características morfológicas de las mi-
croesferas fueron estudiadas utilizando un
microscopio óptico trinocular (Arcano XSZ-
107 E) con cámara fotográfica (Seagull DF-
300s).
La determinación del tamaño de partícula
se efectuó mediante microscopía óptica (Ar-
cano XSZ-107 E), para lo cual se determina-
ron los diámetros de 300 partículas19. La dis-
tribución de tamaño de las microesferas fue
ajustada en función del porcentaje de frecuen-
cia.
Estudios de liberación in vitro
El estudio de liberación in vitro se llevó a
cabo en condiciones estáticas. El ensayo se
efectuó a una temperatura de 37 ± 0,5 °C,
utilizando como medio de disolución 50 ml
de una solución de buffer fosfato pH 7,4 con
etanol 20 % V/V para mantener las condicio-
nes sink del experimento.
Las muestras fueron analizadas mediante
espectrofotometría a 239 nm (CARY [1E] UV
– Visible Spectrophotometer Varian). En cada
caso, los resultados son el promedio de tres
determinaciones. Los datos experimentales
fueron evaluados cinéticamente utilizando un
programa computacional (SigmaPlot 2001).
357
Determination of drug content
Around 20.0 mg microspheres were accu-
rately weighed and diluted 100 ml using di-
chloremethane. The sample was filtrated trough
nylon membrane (0.45 mm) and after appro-
priate dilutions, the sample was assayed spec-
trophotometrically (CARY [1E] UV – Visible
Spectrophotometer Varian) at 239 nm. All the
determinations were realized using microspheres
without PRG as blank.
Morphology and particle size distribution
The microspheres morphological characte-
ristics were studied using an optical micros-
cope trinocular (Arcano XSZ-107 E) with
photographic camera (Seagull DF-300s).
The particle size was carried out by optical
microscopy (Arcano XSZ-107 E), measuring
the diameter of 300 particles19. The size dis-
tribution of microspheres was plotted against
their percentage frequency.
In vitro release studies
In vitro release study was carried out un-
der static conditions. The test was realized at
37 ± 0.5 °C, using 50 ml of phosphate buffer
solution pH 7.4 with ethanol 20 % V/V to
keep the sink conditions of the experiment.
Samples were analyzed by spectrophtome-
try at 239 nm (CARY [1E] UV – Visible
Spectrophotometer Varian). In each case, the
results are the average of three determinatio-
ns. The release data were evaluated kinetica-
lly using a computer program (SigmaPlot 2001).
Differential scanning calorimetric (DSC) studies
The samples were analyzed in a differen-
tial scanning calorimeter Shimadzu DSC-50.
About 2 to 3 mg of the sample was weighted
in an aluminium pan and crimped non-herme-
tically. The system was calibrated with indium
and fenantreno and heated from 25 to 250 °C
at a rate of 5 °C per minute. Differential scan-
ning calorimetry studies were able to qualita-
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Estudios de calorimetría diferencial de barri- tively determine the physical state of the PRG
do (CDB) in the formulations.

Las muestras fueron analizadas en un calo-

rímetro diferencial de barrido Shimadzu DSC- RESULTS AND DISCUSSION
50. En una cápsula de aluminio se colocaron
de 2 a 3 mg de la muestra sellándose no Progesterone is the most attractive compound
herméticamente. El sistema fue calibrado con for fertility regulation and treatment of infer-
indio y fenantreno. Se calentó de 25 a 250 °C tility because it occurs in high concentrations
a una velocidad de 5 °C por minuto. Los in the body and therefore does not pose any
estudios de calorimetría diferencial de barrido toxicity problems unlike synthetic progestins.
permitieron determinar cualitativamente el estado However, PRG has a very short biological half
físico de la PRG en las formulaciones. life and is not orally active except in high
doses20. This is why, the PRG is an appropria-
te candidate for the microencapsulation and
RESULTADOS Y DISCUSIÓN controlled parenteral delivery.
D,L-PLA microspheres containing PRG were
La PRG es el compuesto más atractivo para formed by the solvent evaporation method
la regulación de la fertilidad y el tratamiento using a simple oil water emulsion. Percenta-
de la infertilidad. Se encuentra en el organis- ges of encapsulation which go from (8.7 ±
mo en altas concentraciones y, por lo tanto, 0.1)% W/W to (25.5 ± 0.2)% W/W were ob-
no posee problemas de toxicidad como las tained, as detailed in Table 3.
progestinas sintéticas. Sin embargo, la PRG The resulting particles were spherical ( Fi-
posee una vida media corta y cuando se ad- gure 1) with a size included between (12.4 ±
ministra por vía oral no es activa, excepto en 11.1) µm and (91.5 ± 28.9) µm for the diffe-
altas dosis20. Por estas razones, la progestero- rent formulations developed (Table 3 ).
na resulta un buen modelo de fármaco para la
microencapsulación y la liberación parenteral
controlada.
Se obtuvieron microesferas de D,L-PLA
con PRG por medio de una emulsión O/A
empleando una técnica de evaporación de
solvente. Se lograron porcentajes de encapsu-
lación que van desde (8,7 ± 0,1)% P/P a (25,5
± 0,2)% P/P como se detalla en la Tabla 3.
Las partículas resultantes son de forma
esférica (Figura 1) con un tamaño comprendi-
do entre (12,4 ± 11,1) µm y (91,5 ± 28,9) µm
para las diferentes formulaciones desarrolla-
das (Tabla 3).

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FIGURA 1. Microfotografía de microesferas de D,L-PLA con progesterona (100X).

FIGURE 1. Photomicrograph of D,L-PLA microspheres containing progesterone (100X).

TABLE 3. Characteristics of microspheres.

TABLA 3. Características de las microesferas.

Formulación Encapsulación de Tamaño de partícula

principio activo (% P/P) (mm) media ± D.S.
Formulation Drug content Particle size
(% W/W) (mm) average ± SD
F1 12,2 ± 0,2 56,9 ± 17,4
F2 21,1 ± 0,2 58,5 ± 22,1
F3 14,2 ± 0,2 13,2 ± 10,7
F4 24,5 ± 0,2 12,4 ± 11,1
F5 8,7 ± 0,1 91,5 ± 28,9
F6 16,1 ± 0,2 90,5 ± 30,8
F7 8,7 ± 0,1 12,4 ± 11,8
F8 16,3 ± 0,2 12,4 ± 13,0

Evaluación del diseño factorial Factorial design evaluation

Utilizando un análisis de la varianza (ANO-
VA), se evaluó el efecto de las variables inde-
pendientes (X1, X2 y X3) sobre el tamaño de
partícula y encapsulación de principio activo.
Se aplicó una regresión múltiple a las varia-
bles dependientes en función de las variables
independientes. En el caso de la encapsula-
ción de principio activo se obtuvo la siguien-
te ecuación:
The effect of the independent variables (X1,
X2 and X3) on particle size and drug content
was evaluated with analysis of variance (ANO-
VA). Multiple regression is applied to depen-
dent variables against independent variables.
In the case of drug content the following
equation was obtained:

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y = 4,9167 + 0,4725X1 – 0,0175X 2 +
0,8667 X 3 – 0,0005X 1X 2 + 0,09 X 1X 3 –
0,005 X 2X 3 – 0,0004 X 1X 2X 3
R2 = 0,9971
Adj. R2 = 0,9945
Para el tamaño de partícula, la ecuación
obtenida es la siguiente:
y = 18,883 + 0,309X1 + 0,502X2 – 1,667X 3
– 0,002 X 1X 2 – 0,193 X 1X 3 – 0,259 X 2X 3 +
0,001 X 1X 2X 3
R2 = 0,9989
Adj. R2 = 0,9979
Los resultados del análisis de la varianza
indican que las tres variables independientes
(X1, X2 y X3) han influido significativamente
en la encapsulación de principio activo. De
las tres variables estudiadas, la cantidad de
principio activo (X1) fue la variable que más
influyó como se observa en la figura 2B y
2C. Esto podría deberse a la mayor cantidad
de PRG disponible para su encapsulación. La
concentración de PVA (X3) es la variable que
menor influencia ejerció sobre la encapsula-
ción de PRG ( Figura 2A y 2C ). A mayor
concentración de PVA se produce un aumen-
to en la viscosidad de la fase externa de la
emulsión O/A logrando una mayor encapsu-
lación de PRG. Este aumento en la viscosidad
impediría el pasaje de principio activo a la
fase externa. Con respecto a la cantidad de
polímero (X 2 ) empleado, cuanto menos se
utilice en las formulaciones mayor será la
encapsulación. A medida que la relación po-
límero/principio activo se hace más pequeña
aumenta la cantidad de fármaco disponible por
partícula.
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CHIAPPETTA D, LEGASPI MJ, NISELMAN V, et al.
y = 4,9167 + 0,4725X1 – 0,0175X 2 +
0,8667 X 3 – 0,0005X 1X 2 + 0,09 X 1X 3 –
0,005 X 2X 3 – 0,0004 X 1X 2X 3
R2 = 0,9971
Adj. R 2 = 0,9945
For the particle size, the obtained equation
is the following:
y = 18,883 + 0,309X1 + 0,502X2 – 1,667X 3
– 0,002 X 1X 2 – 0,193 X 1X 3 – 0,259 X 2X 3 +
0,001 X 1X 2X 3
R2 = 0,9989
Adj. R 2 = 0,9979
The results of analysis of variance indicate
that the three independent variables (X 1, X 2
and X3) have influenced significantly on the
drug content. The most effective variable was
the amount of drug (X1) as it can be observed
in figure 2B and 2C; this may be caused by
a higher amount of available PRG for its en-
trapment. The PVA concentration (X3) was the
least effective variable over the PRG encap-
sulation (Figure 2A and 2C). A viscosity in-
creament of the external phase (aqueous) is
produced by a higher concentration of PVA,
getting a greater PRG encapsulation. The
mentioned viscosity increament would block
the drug passage to the external phase. As far
as used polymer amount (X2) is concerned,
the less it is used in the formulations, the better
encapsulation will be. While the relationship
polymer/drug decreases, the amount of avai-
lable drug per particle increases.
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BIODEGRADABLE MICROSPHERES OF POLY(D,L-LACTIDE) CONTAINING PROGESTERONE

FIGURA 2. Diagrama de superficie en función de la encapsulación de principio activo. A) Concentración

de PVA y cantidad de polímero. B) Cantidad de principio activo y cantidad de polímero. C) Cantidad de
principio activo y concentración de PVA.
FIGURE 2. Surface plot based on the drug content. A) Concentration of PVA and amount of polymer. B)
Amount of drug and amount of polymer. C) Amount of drug and concentration of PVA.

A) B)

C)

Con respecto al tamaño de partícula, las
variables independientes que influyeron sig-
nificativamente son la cantidad de polímero
(X2) y la concentración de PVA (X3). La va-
riable independiente X3 es la que ejerció ma-
yor influencia sobre el tamaño de partícula
(Figura 3A y 3C). Al aumentar la concentra-
ción de PVA las gotas que forman la fase
interna de la emulsión se hacen más peque-
ñas y se obtienen partículas de menor tamaño
(formulaciones F3, F4, F7 y F8). Una mayor
With regard to the particle size, the inde-
pendent variables which have significantly
influenced were the polymer amount (X2) and
the PVA concentration (X3). Independent va-
riable X3 was the most effective one over the
particle size ( Figure 3A and 3C ). When the
PVA concentration is increased, the drops which
constitute the internal emulsion phase get smaller
and more little particles are obtained (formu-
lations F3, F4, F7 and F8). The higher PVA
concentration favours the higher stability of

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362 CHIAPPETTA D, LEGASPI MJ, NISELMAN V, et al.

concentración de PVA favorece la estabiliza-
ción de las partículas de menor tamaño, lo
cual disminuye la tendencia a coalescer y formar
partículas de mayor tamaño. En trabajos ante-
riores se obtuvieron resultados similares8. La
variable X 2 tuvo un menor efecto sobre el
tamaño de partícula ( Figura 3A y 3B ). Una
mayor cantidad de polímero conlleva a un
aumento en la viscosidad de la fase interna de
la emulsión que impide disminuir el tamaño
de las gotas, con lo cual se obtienen partícu-
las de mayor tamaño (formulaciones F1, F2,
F5 y F6).
the smallest particle is obtained. This latter
decreases the coalescence tendency and the
formation of bigger particles. Similar results
were obtained by previous workers8. The va-
riable X2 had a less effect on the particle size
(Figure 3A y 3B). A higher polymer amount
generates an increment in the viscosity of the
internal phase emulsion, which impedes to
diminish the drops size, granting in this way
obtaining of bigger particles (formulations F1,
F2, F5 and F6).

FIGURA 3. Diagrama de superficie en función del tamaño de partícula. A) Concentración de PVA y

cantidad de polímero. B) Cantidad de principio activo y cantidad de polímero. C) Cantidad de principio
activo y concentración de PVA.
FIGURE 3. Surface plot based on the particle size. A) Concentration of PVA and amount of polymer. B)
Amount of drug and amount of polymer. C) Amount of drug and concentration of PVA.

A) B)

C)

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BIODEGRADABLE MICROSPHERES OF POLY(D,L-LACTIDE) CONTAINING PROGESTERONE
Evaluación in vitro
Los perfiles de liberación de todas las for-
mulaciones fueron caracterizados por un efecto
inicial de liberación inmediata durante las
primeras 24 horas, excepto en las formulacio-
nes F5 y F6. Este efecto inicial de liberación
inmediata, conocido como efecto burst, se debe
a la liberación de PRG desde la superficie de
la microesfera. Después de este efecto inicial
se observa una liberación del principio activo
en forma sostenida para todas las formulacio-
nes, excepto para las formulaciones F4, F7 y
F8.
Las formulaciones preparadas con 100 mg
de polímero (F1, F2, F3, F4) ven afectada su
liberación según el porcentaje de encapsula-
ción (Figura 4). Las formulaciones F1 y F2,
que tienen un tamaño de partícula similar,
liberan el principio activo con diferente velo-
cidad. La formulación F2 libera más rápido
que F1, esto se debe al mayor porcentaje de
encapsulación de PRG. Lo mismo ocurre con
F3 y F4, que poseen tamaño similar pero libe-
ran con diferente velocidad. La formulación
F3, que posee menor porcentaje de encapsu-
lación, libera más lento que F4. En estas for-
mulaciones, una mayor cantidad de principio
activo produce un aumento en el gradiente de
concentración en el medio de disolución. Este
aumento en el gradiente de concentración
conlleva a un aumento en la velocidad de li-
beración. En trabajos anteriores se obtuvieron
resultados similares 5.
FIGURA 4.
4 Perfiles de liberación de progesterona desde microesferas de D,L-PLA (F1, F2, F3 y F4).
FIGURE 4.
4 Released profiles of PRG from D,L-PLA microspheres (F1, F2, F3 and F4).
363
In vitro evaluation
The release profiles for all the formulatio-
ns have been characterized by an initial effect
of inmediate release for the first 24 hours,
except for formulations F5 anf F6. The initial
effect of inmediate release previously mentio-
ned, is known as burst effect, owing to the
PRG release from the microsphere surface. After
this initial effect, it can be observed the relea-
se of the drug content in a sustained way for
all the formulations, except for formulations
F4, F7 and F8.
The release of formulations prepared with
100 mg of polymer (F1, F2, F3 and F4) de-
pends on the percentage of encapsulation (Fi-
gure 4). The formulations F1 and F2, with a
similar particle size, release the drug at diffe-
rent rates. The formulation F2 releases fastter
than F1 due to a higher percentage of PRG
encapsulated. The same occurs with F3 and
F4, both have a similar particle size but relea-
se at different rates. Formulation F3, which
has less percentage of encapsulation, releases
slower than F4. In this formulations, a greater
amount of drug content produces an incre-
ment in the concentration gradient in the di-
solution medium, which generates an increa-
ment in the release rate. Similar results were
obtained by previous workers 5.
Ars Pharm 2005; 46 (4): 353-368.
364
En cambio, en las formulaciones prepara-
das con 200 mg de polímero (F5, F6, F7, F8)
la liberación de PRG es influida por el tamaño
de las microesferas. Las formulaciones que
presentan un menor tamaño de partícula (F7 y
F8) presentan una mayor velocidad de libera-
ción de PRG debido a que presentan una mayor
superficie de exposición en el medio de libe-
ración21. Estas formulaciones (F7 y F8) logran
alcanzar el plateau a los 4 días de liberación.
En cambio, las formulaciones F5 y F6 presen-
tan una menor velocidad de liberación de PRG
debido al mayor tamaño de partícula (Figura
5). Estas formulaciones logran liberar PRG en
forma sostenida durante 28 días. En estas for-
mulaciones, la liberación no se vio afectada
por el porcentaje de PRG encapsulada.
FIGURA 5.
5 Perfiles de liberación de progesterona desde microesferas de D,L-PLA (F5, F6, F7 y F8).
FIGURE 5.
5 Released profiles of PRG from D,L-PLA microspheres (F5, F6, F7 and F8).
Estudio de las cinéticas de liberación in vitro
Empleando el programa computacional Sig-
maPlot, se estudiaron las cinéticas de libera-
ción utilizando el modelo de Orden 0, Orden
1, Higuchi y el modelo propuesto por Baker
and Lonsdale 22.
De acuerdo a los coeficientes de correla-
ción (Tabla 4) obtenidos en el estudio de las
cinéticas de liberación in vitro las formulacio-
nes F4, F7 y F8 ajustan a una cinética de
orden 1. Las formas farmacéuticas que se ajustan
a esta cinética liberan el principio activo en
forma proporcional a la cantidad de fármaco
remanente en el interior del sistema. Estas
formulaciones son las de menor tamaño de
partícula (Tabla 3), lo cual genera una mayor
velocidad de liberación.
Ars Pharm 2005; 46 (4): 353-368.
CHIAPPETTA D, LEGASPI MJ, NISELMAN V, et al.
On the other hand, in formulations prepa-
red with 200 mg of polymer (F5, F6, F7 and
F8) the PRG release depends on the micros-
phere size. The formulations with a smaller
particle size (F7 and F8) show a greater PRG
release rate because of its bigger exposure
surface in the release medium 21 . These for-
mulations (F7 and F8) achieve to reach the
plateau after 4 days of the release. However,
formulations F5 and F6 show a lower PRG
release rate, due to their bigger particle size
( Figure 5 ). These formulations are able to
release PRG in a sustained way for 28 days,
and the release was not affected by the per-
centage of PRG encapsulated.
In vitro release kinetics study
Employing the computer program Sigma-
Plot, release kinetics have been studied using
the zero order model, first order model, Higu-
chi model and the model suggested by Baker
and Lonsdale 22.
According to the correlation coefficients
(Table 4) obtained in the study of the in vitro
release kinetics, formulations F4, F7 and F8
adjust to a first order kinetic. The pharmaceu-
tical forms which adjust to this kinetic release
the drug content proportionally to the amount
of drug residual in the inside of the system.
These formulations have the smallest particle
size (Table 3), which generates a faster relea-
se rate.
MICROESFERAS BIODEGRADABLES DE POLI(D,L-LÁCTICO) CONTENIENDO PROGESTERONA 365
BIODEGRADABLE MICROSPHERES OF POLY(D,L-LACTIDE) CONTAINING PROGESTERONE

TABLA 4. Coeficientes de correlación (r2) para los modelos de orden 0, orden 1, Higuchi y Baker &
Lonsdale.
TABLE 4. Determination coefficients (r2) values for zero order model, first order model, Higuchi model
and Baker & Lonsdale model.

Formulación F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8
Formulation
Orden 0 (r2) 0,6966 0,6606 0,7485 0,6884 0,7938 0,6127 0,3912 0,3579
Zero order (r 2)
Qt = k0 x t
Orden 1 (r 2)Ln 0,971 0,9017 0,9665 0,9577 0,9615 0,8014 0,8059 0,8341
First order (r2)Ln
(Q0 – Qt) = k1 x t
Higuchi (r 2) 0,8449 0,8095 0,8697 0,7881 0,9259 0,7738 0,5663 0,5233
Higuchi (r 2)
Qt = kH x t0,5
Baker & Lonsdale 0,9802 0,9613 0,9859 0,954 0,9778 0,8622 0,6405 0,6928
Baker & Lonsdale
(r 2)3/2[1-(1-F) 2/3]-
F = kbl x t

Las formulaciones F1, F2, F3, F5 y F6 se
ajustan al modelo propuesto por Baker and
Lonsdale (3/2[1-(1-F)2/3]-F = kbl x t), donde F
es la fracción de principio activo liberada a
tiempo t y kbl es una constante de velocidad.
Generalmente, esta ecuación se ajusta a siste-
mas matriciales esféricos 23-25 . Este modelo
asume que el paso limitante para la liberación
del fármaco es la erosión de la matriz22. Por
esta razón, las partículas de mayor tamaño
poseen una mayor estructura para erosionar,
con lo cual la PRG se libera en mayor tiempo.
Formulations F1, F2, F3, F5 and F6 adjust
to the model suggested by Baker and Lonsda-
le (3/2[1-(1-F)2/3]-F = kbl x t), where F is the
drug fraction released at time t and kbl is rate
constant. Generally, this equation adjusts to
spherical matrix systems23-25. This model shows
that the limitating path for the drug release is
the matrix erosion 22. For this reason, bigger
particles have a greater structure for eroding
and, consequently, PRG releases in more time.
Evaluation of physical state of drug content

Evaluación del estado físico del principio activo
Los estudios de CDB del polímero, PRG y
microesferas con PRG (formulación F5) fue-
ron realizados para caracterizar el estado físi-
co del polímero y del principio activo. De-
pendiendo de la solubilidad del fármaco en el
polímero y de la cantidad presente en la for-
mulación, el principio activo puede existir en
diferentes estados físicos. El estado físico del
fármaco en la formulación puede afectar las
características de liberación in vitro e in vivo26.
La figura 6 muestra las curvas de CDB para
la PRG y para las microesferas con y sin PRG.
Tests of DSC of the polymer, PRG and
microspheres with PRG (formulation F5) were
done to characterized the physical state of the
polymer and of the drug. Depending on the
drug solubility on the polymer and the amount
in the formulation, the drug can be found in
different physical states. The drug physical
state can affect the in vitro and in vivo release
characteristics in the formulation 26. Figure 6
shows the DSC curves for the PRG and for
the microspheres with and without PRG. In
curve a) it can be observed an endothermic
peak at 128.99 °C, corresponding to the mel-
ting point of PRG. Microspheres with PRG do

Ars Pharm 2005; 46 (4): 353-368.

366 CHIAPPETTA D, LEGASPI MJ, NISELMAN V, et al.

En la curva a) se observa un pico endotérmi-
co a 128,99 °C, que corresponde al punto de
fusión de la PRG. Las microesferas con PRG
no presentan el pico endotérmico a 128,99
°C. Esto sugiere que la PRG se encontraría en
un estado no cristalino en las microesferas.
Por otra parte, las microesferas sin progeste-
rona presentan un pico endotérmico a los 57,99
°C, que corresponde al rango de la tempera-
tura de transición vítrea del polímero27. Estos
resultados sugieren que la PRG existiría en un
estado amorfo en las microesferas. Los estu-
dios realizados demuestran que existe una
interacción fisicoquímica entre el principio
activo y el polímero.
not show the endothermic peak at 128.99 °C.
This suggests that PRG would be in a non
crystalline state in the microspheres. Otherwise,
microspheres without progesterone show an
endothermic peak at 57.99 °C, corresponding
to glass transition temperature27. These results
suggest that PRG would be in an amorphous
state in microspheres. The studies carried out
show that there exists a physicochemical inte-
raction between the drug content and the
polymer.

FIGURA 6. Perfiles de CDB de (a) progesterona; (b) microesferas vacías y (c) microesferas
con progesterona (Formulación F5).
FIGURE 6. DSC profiles of (a) progesterone; (b) empty microspheres and (c) microspheres with
progesterone (Formulation F5).

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MICROESFERAS BIODEGRADABLES DE POLI(D,L-LÁCTICO) CONTENIENDO PROGESTERONA
BIODEGRADABLE MICROSPHERES OF POLY(D,L-LACTIDE) CONTAINING PROGESTERONE
CONCLUSIONES
De los resultados obtenidos se puede con-
cluir:
1. Después de un efecto inicial inmediato
de liberación, se ha obtenido una libe-
ración de progesterona en forma soste-
nida desde microesferas de D,L-PLA pre-
paradas por medio de una emulsión O/
A empleando una técnica de evapora-
ción de solvente.
2. Los resultados del análisis de varianza
indican que las tres variables indepen-
dientes (cantidad de principio activo, can-
tidad de polímero y concentración de
PVA) influyeron significativamente so-
bre la encapsulación de PRG. En el caso
del tamaño de partícula, las variables que
ejercieron una influencia significativa
fueron la concentración de PVA y la
cantidad de polímero.
3. Los estudios de liberación in vitro han
mostrado que de acuerdo al tamaño de
partícula se pueden obtener formulacio-
nes que logran liberar el principio acti-
vo en pocos días (F4, F7 y F8) u obte-
ner una liberación sostenida durante 28
días (F5 y F6).
4. Los estudios de CDB demuestran que la
PRG existiría en un estado amorfo en
las microesferas.
Los sistemas microparticulados biodegra-
dables desarrollados serían una interesante
alternativa frente a los implantes, ya que de-
bido a su pequeño tamaño podrían ser inyec-
tados con una jeringa convencional, sin nece-
sidad de una intervención quirúrgica para su
aplicación.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el aporte financiero
para este trabajo provisto por UBACyT (Pro-
yecto B027).
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164.
367
CONCLUSIONS
From the obtained results, the following
conclusions can be drawn:
1. After an initial effect of immediate re-
lease, it has been obtained a progestero-
ne release in a sustained way from D,L-
PLA microspheres, prepared through a
O/W emulsion employing a solvent eva-
poration method.
2. The results of analysis of variance indi-
cate that the three independent variables
(amount of drug content, amount of
polymer and PVA concentration) have
influenced significantly on the drug
content. With regard to the particle size,
the independent variables which have
significantly influenced were the PVA
concentration and the polymer amount.
3. In vitro release studies have shown that
according to the particle size, it can be
obtained formulations that achieve to
release the drug in a few days (F4, F7
and F8) or a sustained release for 28
days (F5 and F6).
4. DSC studies show that PRG would be in
an amorphous state in microspheres.
Biodegradable microparticulate systems
developed would be an interesting alternative
against implants; seeing that, owing to its small
size, they could be injected by a conventional
syringe with no need of a surgical operation
for its application.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors acknowledge the financial
support for this work provided by UBACyT
(Grant B027).
Ars Pharm 2005; 46 (4): 353-368.
368 CHIAPPETTA D, LEGASPI MJ, NISELMAN V, et al.

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