ANALISIS HPLC Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi

(kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial point dalam metode HPLC. Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan proses analisa. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya (Johnson dan Stevenson, 1978). yaitu : Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran Mudah melaksanakannya Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis Resolusi yang baik Dapat digunakan bermacam-macam detektor Kolom dapat digunakan kembali Mudah melakukan "sample recovery" Sedangkan kerugian dari penggunaan HPLC yaitu : 1. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu 2. Hanya bisa digunakan untuk asam organik 3. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusi 4. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas Cara kerja HPLC : 1. Sampel yang akan dianalisis ditempatkan 2. Fasa gerak disedot oleh pompa, memasuki degaser untuk menghilangkan gas yang ada di dalam fasa gerak 3. Dimasukkan dalam oven untuk dihilangkan sampel yang mengandung uap dan dipompa. Dan menghilangkan gelembung udara 4. Larutan sampel dianalisis jika mengandung bakteri maka di filtrasi dengan filter membrane ukuran 0,2-0,4 m 5. Sampel masuk ke dalam kolom dimana panjang kolom sesuai dengan senyawa yang akan dianalisis. 6. Hasil dari kolom akan masuk ke detector, dimana akan diditeksi berdasarkan indeks bias 7. Detektor dihubungkan dengan computer pada layar, pada monitor akan ditampilkan kromatogram berupa grafik, dan dapat diketahui waktu retensi masing-masing sampel yang digunakan. Faktor yang mempengaruhi kerja HPLC

1. Kecepatan alir fase gerak , kecepatan alir yang sangat lambat akanmenyebabkan terjadinya difusi longitudinal, sedangkan bila terlalu cepat akanmenyebabkan terjadinya transfer masa non ekuilibrium, sehingga terjadipelebaran pita kromatogram 2. Ukuran partikel fase diam, semakin kecil ukuran partikel maka efisiensi semakinbaik Tetapi menyebabkan tekanan dalam kolom semakin besra sehinggadibutuhkan kekuatan pompa yang semakin besar. 3. Panjang kolom, semakin panjang akan semakin besar harga efisiensi kolom,tetapi dapat menyebabkan terjadinya pelebaran pita. 4. Viskositas fase gerak , semakin kecil harga viskositas fase gerak maka efisiensikolom semakin besar. 5. Temperatur, semakin tinggi temperatur maka viskositas semakin rendah danefisiensi kolom menjadi lebih besar. 6. Volume ekstra kolom, semakin besar volume ekstra kolom maka kemungkinanterjadinya pelebaran pita semakin besar, sehingga efisiensi semakin berkurang. 7. Jumlah sampel dan volume sampel, bila jumlah maupun volume sampel sangatbesar (overload) maka kemungkinan terjadinya pelebaran pita semakin besar,sehingga efisiensi semakin berkurang Penentuan Kualitatif HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar. Penentuan Kuantitatif Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah: o Parameter percobaan sama antara standar dan sampel o Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama o Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu. - Berdasarkan area kromatogram - Berdasarkan tinggi puncak kromatogram Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample. Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah

cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja. Kesulitan biasanya dihadapi ketika akan mengidentifikasi suatu kromatogram yang terdiri atas banyak peak. Untuk mengetahui peak mana yang merupakan milik analat (zat target analisa) kromatogram dibandingkan dengan kromatogram standard. Cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya akan langsung di vonis sebagai peak milik analat. Memang senyawa/zat yang sama akan mempunyai RT yang juga sama, dengan catatan sample dan standard dijalankan dengan kondisi dan sistem HPLC yang sama. Namun bukan berarti RT yang sama pasti merupakan zat/senyawa yang sama. Disinilah para analis biasanya terkecoh. Jadi, melihat RT sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi suatu zat. Hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama. Kolom Kolom kromatografi cair biasanya dibangun dari yang halus atau stainless steel. Kolom HPLC kadang-kadang dibuat dari tabung gelas dan tabung polimer, seperti polyetheretherketone. Selain dilapisi baja, kolom juga dapat dilapisi stainless. Ratusan kolom dikemas berbeda dalam ukuran dan pengepakan tersedia. Biayanya berukuran standar. Kolom yang tidak spesifik berkisar dari $ 200 sampai lebih dari $ 500. Kolom khusus, seperti kolom kiral, dapat biaya lebih dari $ 1000. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. Kolom yang biasa digunakan untuk analisa adalah bentuk kolom fase balik. Kolom diisi dengan partikel silika yang dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantairantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut. Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak

lambat dalam kolom.Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil. a. Analytical Cholumn Kolom kromatografi cair berkisar dari 5 sampai 25 cm. Umumnya digunakan kolom yang lurus. Diameter dalam kolom analitis sering antara 3-5 mm, ukuran partikel paling umum dari kemasan adalah 3 atau 5 FLM. Kolom yang paling umum memiliki adalah 10 atau panjang 15 cm, 4,6 mm diameter dalam, dan dikemas dengan 5-FLM partikel. Kolom jenis ini menghasilkan 40.000 untuk 70.000 lempeng / meter (biasanya sekitar 10.000 lempeng / kolom). Pada 1980-an, tersedia microcolumns dengan diameter dalam 1 sampai 4,6 mm dan panjang 3-7,5 cm. Kolom ini, yang dikemas dalam 3 atau 5 FLM partikel, mencapai sebanyak 100.000 lempeng / m dan memiliki keunggulan kecepatan dan membutuhkan pelarut yang minimal. Properti ini sangat penting karena pelarut dengan kemurnian tinggi diperlukan untuk LC. Selain itu, pelarut umumnya memiliki harga mahal sehingga dengan LC ini pelarut dapat digunakan kembali tanpa dibuang-buang. b. Guard Cholumn Kolom penjaga diperkenalkan sebelum kolom analitis untuk meningkatkan kerja analisis kolom karena tidak hanya menghilangkan partikel dan kontaminan dari pelarut tetapi juga komponen sampel yang terikat ireversibel pada fase diam. Susunan kemasan kolom penjaga harus serupa dengan yang ada pada kolom analitis, partikel ukuran biasanya lebih besar. Ketika kolom penjaga telah terkontaminasi, kolom ini dapat dikemas ulang atau dibuang dan diganti dengan jenis yang sama. c. Pengontrolan Suhu Kolom Diharapkan kolom memiliki suhu yang konstan. Dimensi kolom antara lain 4 cm, 0,4 cm diameter; kemasan: 3-FLM spherisorb; fase gerak: etil asetat 4,1% pada n-heksana. Senyawanya; (1) p-xilena, (2) anisol, (3) benzil asetat, (4) phthalate dioktil, (5) phthalate dipentyl, (6) ftalat dibutil, (7) dipropyl phthalate, (8) diethyiftalat. Kolom juga dilengkapi dengan jaket air untuk memberikan kontrol suhu tepat. Banyak kromatograf mempertimbangkan kontrol suhu sebagai suatu hal yang penting untuk pemisahan (280C). Silika sejauh ini merupakan kemasan yang paling umum digunakan dalam LC. (Skoog, 1998) Injektor (Injector)

Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 500 L). Injeksi sampel dapat dilakukan melalui manual (menggunakan jarum suntik), step-flow injection, dan sampling value. Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum (Anonim, 1995). Yaitu : 1. Stopped Flow 2. Solvent Flowing Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan : 1. Stop-Flow : Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi 2. Septum : Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan. 3. Loop Valve : Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom (Anonim, 2001). GAMBAR SISTEM INJEKTOR RHEODYNE

Injektor Rheodyne posisi Load dan Inject (tampak depan)

Flowpath saat posisi Load dan Inject Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila INJECT difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom. GAMBAR FLOW CELL:

Penyuntikan Sampel pada KCKT Ketepatan pengukuran kromatografi cair ditunjukkan dengan reprodusibilitas pengepakan kolom. Terlebih lagi dengan adanya pengaruh injeksi sampel. Dengan demikian, volume sampel harus sangat kecil. Selanjutnya, akan lebih mudah untuk mampu mengukur sampel tanpa adanya penurunan tekanan. Metode yang paling banyak digunakan pengenalan sampel di LC berdasarkan sampling loop. Perangkat ini seringkali merupakan bagian integral dari kromatografi cair dan menyediakan loop untuk saling bertukar antara ukuran sampel dari 1 flL sampai 100 flL atau lebih. Loop sampling jenis ini memungkinkan penilaian sampel pada tekanan sampai 7000 psi dengan standar relatif deviasi persepuluh persen. Kebanyakan kromatograf saat ini dijual dengan autoinjectors. (Skoog, 1998) Pada saat pengisian sampel, sampel digelontorkan melalui keluk sampel dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontorkan sampel ke kolom. Presisi penyuntikan ditentukan dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1%. Penyuntik ini mudah digunakan untuk otomatisasi dan sering digunakan untuk autosampler pada KCKT. (Gandjar dan Rohman, 2007) Pompa

Peralatan yang digunakan sebagai pompa dalam sistem KCKT memiliki beberapa persyaratan : 1) Menghasilkan tekanan hingga 6000 psi 2) Keluaran yang bebas denyut 3) Kecepatan alir dalam kisaran 0, 1 10 ml/menit 4) Pengaturan kecepatan alir dengan keterulangan setara dengan 0,5 % atau lebih baik 5) Tahan terhadap korosi. Ada beberapa jenis pompa, antara lain : a. Reciprocating pump: Terdiri dari ruang kecil, dimana solvent dipompa dengan piston yang bergerak maju mundur. Tekanan yang dihasilkan dapat mencapai 10.000 psi. b. Displacement Pump: Terdiri dari semacam alat suntik (syring) yang besar dengan kapasitas biasanya 250 ml. Solvent dialirkan dengan menggerakkan piston. c. Pneumatic Pump: Terdiri dari container yang berisi solvent yang dapat ditekan dengan suatu gas. Tekanan yang dihasilkan kurang dari 2000 psi. Sistim pemompaan ini dapat diatur secara manual atau dengan menggunakan kontrol sistem komputer. Berkenaan dengan aliran fase gerak, jika komposisi solvent dibuat tetap maka disebut isocratic elution. Hal ini dapat dilakukan dengan mencampur lebih dulu dua atau lebih solvent. Kemudian langkah selanjutnya adalah menaruhnya dalam satu reservoir atau dapat juga dengan menaruh masing-masing solvent pada reservoir yang berbeda dengan pompa masing-masing. Jika komposisi solvent dibuat berubah-ubah dari waktu ke waktu, maka cara ini disebut gradient elution, yang pelaksanannya dapat diatur dengan control system. Pompa perlu dirawat dengan baik, antara lain: a. Menggunakan solvent yang bebas debu/ partikulat. b. Pompa jangan dibiarkan kering, sehingga tidak terjadi geseran yang bisa mengakibatkan kebocoran pompa. c. Bila dalam solvent terdapat garam-garam, maka setelah selesai menggunakan alat ini, pompa harus dialiri air (aquadest) sampai bersih kemudian dibilas dengan methanol agar tidak terjadi pengendapan garam dalam dinding pompa. d. Jangan menjalankan pompa dalam keadaan kering. Detektor Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif). Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respon linier yang luas, dan memberi

respon untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh. Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan rentang yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV. Detektor merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair yang modern. HPLC mempunyai keunggulan dibanding kromatografi lain, yaitu mempunyai banyak pilihan detektor yang dapat digunakan. Secara garis besar , detektor dalam HPLC dapat dikelompokan : Detektor yang digunakan dalam HPLC dibedakan menjadi 3 macam, yaitu: 1. Detektor spektrofotometrik Detektor spektrofotometri , biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan secara luas. Idealnya, spektrofotometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik, sel sample yang biasa akan digantikan dengan suatu alir untuk melewatkan larutan eluen kolom guna menembus berkas sample dari peralatan tersebut. Spektrofotometer ultraviolet yang modern merupakan salah satu detector yang sangat mahal, sehingga dibutuhkan suatu kompromi. Dibandingkan dengan ribuan dollar yang harus dikeluarkan untuk spektrofotometer yang hanya bahkan tergolong kelas dua saja, maka $2500 atau sekitar itu akan mendapatkan sebuah detector untuk memonitor larutan eluen kolom pada 254 atau 280 nm (harga-harga tahun 1989). Biaya yang lebih rendah mencerminkan penggunaan spektrum garis lampu uap merkuri dan bukan suatu sumber kontinyu dan monokromator, penyaring-penyaring yang sederhana mengisolasi garis yang diinginkan di dalam spektrum merkuri. Pemilihan panjang gelombang yang terbatas itu tampaknya membatasi, tetapi detektordetektor sederhana ini bekerja dengan baik pada banyak kasus. Contohnya, protein yang menyerap semua pada 280 nm akibat adanya rantai samping asam amino aromatik, dan hampir semua senyawa aromatik termasuk yang banyak diminati di bidang biologi (yakni: purin, pirimidin, nukleosida, nukleotida, dan asam nukleat) dapat dideteksi pada 254 nm. Sensitivitas bervariasi berdasarkan kecocokan antara lain pita absorpsi zat terlarut dan panjang gelombang detektor yang tersedia dan intensitas pita dan panjang jalan yang melewati sel detektor, tetapi sebagai pedoman kasar, detektor ultraviolet akan dapat melihat kuantitas nanogram, bisa kita katakan bahwa susunannya 1000 kali lebih sensitiv daripada detektor indeks bias. Sebagai tambahan, detektor ini relatif tidak sensitif terhadap temperatur. Detektor fotometer inframerah juga dapat digunakan pada HPLC. Dengan detektor ini dapat dibuat pola spektrum infra merah dari komponen sampel sehingga gugus-gugus fungsionalnya dapat diketahui.

2. Detektor Fluorometrik Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin biasa. Jenis yang paling serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variable yang terus menerus di sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang lebar dengan memanfaatkan sebuah sumber kontinyu dan monokromator, biasanya penyaring-penyaring yang sederhana digunakan untuk mentransmisikan emisi pendaran pada foto detektor sambil menahan radiasi eksitasinya. Versi yang lebih murah menggunakan penyaring pada sisi eksitasi maupun sisi emisi dan memanfatkan sumber dengan panjang gelombang eksitasi yang lebih terbatas. Banyak senyawa dapat dideteksi dengan fluoresens, termasuk diantaranya banyak pencemar lingkungan, seperti hidrokarbon aromatik polisiklik, dan yang diminati dalam bidang biologi, seperti vitamin, obatobatan dan neurotransmitter. Kadang-kadang fasa bergerak melewati suatu reaktor pasca kolom dimana komponen-komponen sample nonfluoresensnya dikonversikan menjadi turunan berpendar. Suatu contoh yang paling terkenal adalah pendeteksian asam-asam amino pada tingkat subnanogram setelah reaksi dengan reagen fluoresamin (fluorescamin). 3. Detektor Elektrokimia Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik (konduktometri) dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solute-solut yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organic maupun anorganik. Pada detektor ini, larutan eluen dari kolom memasuki sebuah sel di mana larutan tersebut mengalir di atas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada suatu harga, dimana komponen-komponen smpel mengalami reaksi transfer electron. Pendeteksian jenis ini telah digunakan, misalnya untuk neurotransmitter dan metabolisme mereka di dalam ekstra selular dari jaringan otak hewan percobaan, senyawa-senyawa seperti dopamin, norepinefrin, serotonin dan asam homovanilik menghasilkan arus oksidasi pada elektroda karbon mirip yang diberi potensial +0,60 V vs. Sebuah elektroda referensi perak-perak klorida. Elektroda referensi pada umumnya melewati semacam jembatan garam. 4. Detektor Spektra Massa Sejumlah fraksi kecil cairan dari kolom dimasukkan ke dalam spektrometer massa pada kecepatan alir 10 50 l per menit atau menggunakan termospray. Analat akan diionisasikan, dipisahkan pada analisator, dibaca oleh detektor dan menghasilkan spektrum massa. 5. Detektor Refraksi Indeks Detektor jenis ini bekerja dengan mengukur nilai indeks bias yang senyawa yang melalui sel. Sel akan mengukur indeks bias solven fasa gerak sebagai blanko dan sampel secara bersamaan untuk mendapatkan nilai indeks bias relatif. Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luas penggunaannya setelah detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, sehingga dapat dianggap sebagai detektor yang

universal pada HPLC. Detektor ini kurang sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet dan sangat peka terhadap perubahan suhu. Pemilihan detektor Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya didasarkan pada persyaratan sebagai berikut : a. b. c. d. e. cukup sensitive stabilitas dan keterulangan tinggi respon linear terhadap solute waktu respon pendek sehingga tidak bergantung kecepatan alir relibilitas tinggi dan mudah digunakan

f. tidak merusak cuplikan. Dari berbagai macam detector yang ada detektor indeks bias merupakan satu-satunya detektor pada HPLC yang universal, tetapi kurang sensitiv dan sangat peka tehadap perubahan suhu. Detektor ultraviolet dengan panjang gelombang yang variabel merupakan pilihan yang paling baik bagi sekelompok besar obat-obatan. Dalam hal-hal yang sangat spesifik dapat digunakan detektordetektor fluorometer dan elektrokimia. Elusi Gradien Elusi gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerak selama analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi gradient dijelaskan oleh Snyder. Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan, yaitu : 1. 2. 3. 4. and error. Fase gerak Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau fase gerak adalah salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat disukai, yaitu fase gerak harus (Anonim, 1995) : 1. Murni, tidak terdapat kontaminan 2. Tidak bereaksi dengan wadah (packing) 3. Sesuai dengan detektor Total waktu analisis dapat direduksi Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing) Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak

Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi gradien dapat dipilih dengan cara trial

4. Melarutkan sampel 5. Memiliki visikositas rendah 6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery" 7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price) Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk sampel normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan methanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik. (Gandjar dann Rohman, 2007) Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk KCKT yang menggunakan pompa bolak balik (reciprocating pump) sangat diperlukan terutama bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang tidak dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detector sehingga data yang diperoleh tidak dapat digunakan. Menghilangkan gas (degassing) juga sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitive terhadap udara (contoh : kolom berikatan dengan NH2) (Snyder and Kirkland, 1979). Wadah fase gerak harus bersih dan inert. Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Pada saat membuat pelarut fase gerak, maka sangat dianjurkan untuk menggunakan pelarut, buffer, dan reagen dengan kemurnian yang sangat tinggi. Adanya pengotor dapat mengganggu sistem kromatografi. (Gandjar dan Rohman, 2007) Fase Diam pada KCKT Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase gerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Penurunan ukuran partikel penunjang stasioner tidak

selalu

menguntungkan.

Kromatografi

cair

kinerja

tinggi

atau

high

performance

liquid

chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 nm; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi (Khopkar, 2003). Parameter HPLC Parameter baik atau tidaknya suatu kromatografi didasarkan pada beberapa faktor, antara lain waktu retensi, faktor kapasitas, efisiensi kolom, dan resolusi. Waktu retensi didefinisikan sebagai waktu yang diperlukan untuk membawa keluar suatu komponen dari dalam kolom kromatografi sehingga yang keluar dari kolom adalah tepat konsentrasi maksimum. Faktor kapasitas (k) juga merupakan ukuran retensi suatu komponen dalam kolom. Jika nilai k kecil, maka komponen tertahan sebentar dalam kolom. Dan jika nilai k yang lebih besar, maka pemisahan baik tetapi waktu yang dibutuhkan untuk analisis lebih lama dan dan puncaknya melebar. Sehingga ditentukanlah nilai k optimum, yaitu antara 1 sampai 10. Kolom dinyatakan baik jika cukup selektif artinya mampu menahan berbagai komponen dengan kekuatan yang cukup berbeda. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai selektivitas () harus lebih besar daripada 1, semakin besar nilai maka pemisahannya akan semakin baik. Nilai dapat diubah-ubah dengan cara, mengubah fase gerak (misalnya dengan memperbesar polaritas), mengubah fase diam, mengubah temperatur karena pada umumnya kenaikan temperatur akan memperkecil waktu retensi, dan mengubah bentuk komponen. Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil yang diinginkan dengan hasil yang memuaskan dan dalam waktu yang singkat. Keterpisahan antara dua puncak kromatogram dinyatakan dengan resolusi R (ukuran besar kecilnya pemisahan). Jika nilai R 1,5 maka senyawa terpisah dengan baik. Kromatogram HPLC merupakan relasi antara tanggapan detektor sebagai koordinat dan waktu sebagai absis dalam sistem koordinat Cartesian, dimana titik nol dinyatakan sebagai saat dimulainya injeksi sampel. Keuntungan HPLC KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih besar bagi para analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada KCKT karena teknik ini dapat digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang

umumnya digunakan. KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik, antara lain : 1. Cepat Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit, waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua fase dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan fase diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fase diam dan fase gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan (Rucker, G 1988). 2. Sensitivitas detektor Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumLah nanogram (10 - 9 gram) dari bermacam-macam zat. Detektor-detektor fluoresensi dan elektrokimia dapat mendeteksi jumLah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT (Rucker, G 1988). 3. Kolom yang dapat digunakan kembali Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable). Banyak analisis yang bias dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat zat yang tidak bias dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah, biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat zat tersebut (Rucker, G 1988). 4. Mudah merecovery sampel : Umumnya selektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan kecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus (Rucker, G 1988) Beberapa keunggulan HPLC dibanding alat lain: a). HPLC dilengkapi dengan adanya pompa, Pompa ini menghasilkan tekanan sekitar 400 atm untuk mengalirkan eluen dengan tekanan tinggi dan konstan sehingga memperingan kerja kolom dan juga pemisahan sehingga waktu lebih sedikit. pada pompa dikenal dua sistem dalam teknik pemisahan yaitu isokratik dan gradient,namun gradient lebih bersifat akurat karena masingmasing pompa mengatur laju alir larutan yang berbeda. b). HPLC memiliki keunggulan kolom, Dimana kolom HPLC ini lebih pendek dan lebih kecil dibanding GC misalnya. Diameter untuk internal kolom HPLC 4.6 mm sehingga dapat

memberikan permukaan kontak yang lebih luas diman mempengaruhi sempurnanya pemisahan yang semakin baik. Dan panjang kolom HPLC adalah 150-250 mm. dan yang perlu diingat adalah kolom HPLC dapat digunakan kembali dengan cara direnerasi dengan mencucinya hingga bersih dengan pelarut yang sesuai. c). HPLC mempunyai detektor yang amat sangat sensitif dan peka. HPLC memiliki beberapa detector misalnya: Detektor ultraviolet, detektor fluorometrik, dan detektor elektrokimia. d). Waktu retensi, waktu yang dibutuhkan senyawa untuk melalui kolom hingga ke detektor disebut waktu retensi yang diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.biasanya dipengaruhi oleh : tekanan yang digunakan, kondisi dari fase diam, komposisi pelarut yang tepat, dan temperatur kolom. e). Kromatogram, kromatogram menunjukkan hasil yang didapat. Kromatogram yang diinginkan adalah kromatogram yang lurus tinggi dengan lebar sekecil mungkin. Bukan dengan bentuk lainnya,karena bentuk tersebut menandakan pemisahan dilakukan dengan sangat baik. Namun dalam kromatogram kita menemukan beberapa puncak kecil atau yang mengganggu dan disebut denga noise. Noise muncul jika sampel kita ataupun pelarut yang kita gunakan belum pure,belum murni dari pengotor-pengotor yang mungkin tidak sengaja masuk kedalamnya.