A. Topik Kultur Kalus B.

Tujuan Mengetahui cara menghasilkan kalus dari umbi wortel yang ditumbuhkan pada media MS 2,4-D 1,5 ppm C. Dasar Teori Menurut teori sel yang dikemukakan oleh Schleiden dan Swann, sel mempunyai kemampuan totipotensi. Sel akan hidup apabila diletakkan pada suatu lingkungan yang sesuai sehingga akan tumbuh dan berkembang menjadi tanaman yang sempurna. Kultur jaringan merupakan pengembangan dari teori sel, yaitu dengan menumbuhkan sel atau kumpulan sel (jaringan) pada media makanan yang sesuai dengan kebutuhan sel atau jaringan tanaman yang ditanam pada media tersebut (Tim Dosen Kultur Jaringan, 2012). Kultur jaringan tanaman juga dapat diartikan sebagai teknik menumbuh-kembangkan bagian tanaman, baik berupa sel, jaringan, atau organ dalam kondisi asebtik secara in-vitro. Teknik ini dicirikan oleh kondisi kultur yang aseptik, pengggunaan media kultur buatan dengan kandungan nutrisi lengkap dan ZPT (zat pengatur tumbuh), serta ruang kultur yang suhu dan pencahayaannya terkontrol (Enzel, 2009). Kalus adalah suatu kumpulan sel amorphous yang terjadi dari sel-sel jaringan yang membelah diri secara terus menerus. Penelitian pembentukan kalus pada jaringan terluka pertama kali dilakukan oleh Sinnott pada tahun 1960. Pembentukan kalus pada jaringan luka dipacu oleh zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin endogen (Dodds & Roberts, 1983). Secara in vivo, kalus pada umumnya terbentuk pada bekas-bekas luka akibat serangan infeksi mikro organisme seperti Agrobacterium tumefaciens, gigitan atau tusukan serangga dan nematoda. Kalus juga dapat terbentuk sebagai akibat stress (George & Sherrington, 1984). Tujuan kultur kalus adalah untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali. Kalus diharapkan dapat memperbanyak dirinya (massa selnya) secara terus-menerus. Sel-sel penyusun kalus berupa sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang dengan sel-sel lain. Dalam kultur jaringan, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang telah steril, di dalam media yang mengandung auksin dan kadangkadang juga sitokinin. Organ tersebut dapat berupa kambium vaskular, parenkhim cadangan makanan, perisikle, kotiledon, mesofil daun dan jaringan provaskular. Kalus mempunyai pertumbuhan yang abnormal dan berpotensi untuk berkembang menjadi akar, tunas dan embrioid yang nantinya akan dapat membentuk plantlet. Beberapa kalus ada yang mengalami pembentukan lignifikasi sehingga kalus tersebut mempunyai 13

tekstur yang keras dan kompak. Namun ada kalus yang tumbuh terpisah-pisah menjadi fragmenfragmen yang kecil, kalus yang demikian dikenal dengan kalus remah (friable). Warna kalus dapat bermacam-macam tergantung dari jenis sumber eksplan itu diambil, seperti warna kekuning-kuningan, putih, hijau, atau kuning kejingga-jingaan. (karena adanya pigmen antosianin ini terdapat pada kalus kortek umbi wortel). Pada umumnya kemampuan pembentukkan kalus dari jaringan tergantung juga dari: 1. Umur fisiologi dari jaringan waktu diisolasi 2. Musim pada waktu bahan tanaman diisolasi 3. Bagian tanaman yang dipakai 4. Jenis tanaman Dalam perbanyakan mikro, produksi kalus biasanya dihindari karena dapat menimbulkan variasi dan terutama pada zona perakaran mengakibatkan diskontinyuitas dengan sitem berkas pengangkut utama. Kadang-kadang eksplan menghasilkan kalus, bukan tunas baru, khususnya jika diberikan hormon dengan konsentrasi tinggi pada media. Dalam hal lain, kalus sengaja diinduksi karena potensinya untuk produksi massal plantlet baru. Faktor pembatasnya adalah sulitnya menginduksi inisiasi tunas baru, terutama pada tanaman berkayu dan tingginya kejadian mutasi somatik. Potensi terbesar penggunaan kultur kalus adalah dimana sel-sel kalus dapat dipisahkan dan diinduksi untuk berdiferensiasi menjadi embrio somatic. Secara morfologi, embrio ini mirip dengan yang ada pada biji, tetapi tidak seperti embrio biji, mereka secara genetik bersifat identik dengan tanaman tetua sehingga segregasi seksual materi genetik tidak terjadi. Satu milimeter kalus berisi ribuan sel, masingmasing memiliki kemampuan untuk membentuk embrio sehingga kecepatan multiplikasi sangat tinggi (Anonim, 2008) Wortel (Daucus carota) adalah tumbuhan jenis sayuran umbi yang biasanya berwarna jingga dengan tekstur serupa kayu. Bagian yang dapat dimakan dari wortel adalah bagian umbi atau akarnya. Batang bunga tumbuh setnggi sekitar 1 m, dengan bunga berwarna putih. Berikut ini adalah klasifikasi dari Daucus carota. Kingdom Divisi Kelas Ordo Famili Genus Spesies : Plantae : Magnoliophyta : Magnoliopsida : Apiales : Apiaceae : Daucus : Daucus carota 14

Tanaman wortel berupa rumput dan menyimpan cadangan makanannya di dalam umbi. Mempunyai batang pendek, basah, berakar tunggang, sekumpulan tangkai daun yang keluar dari ujung umbi bagian atas yang bentuk dan fungsinya berubah menjadi umbi bulat dan memanjang. Umbi berwarna kuning kemerah-merahan, berkulit tipis, dan jika dimakan mentah terasa renyah dan agak manis. Daun majemuk berganda, pangkal tangkai melebar menjadi upih, lonjong, tepi bertoreh, ujung runcing, pangkal berlekuk, panjang 15-20 cm, lebar 10-13 cm, pertulangan menyirip, berwarna hijau. Bunga berkumpul dalam payung majemuk, mahkota berbentuk bintang, halus, berwarna putih. Batang bunga tumbuh setinggi sekitar 1 m. Tanaman wortel banyak ragamnya, tetapi bila dilihat bentuk umbinya ada 3 golongan, yaitu : a) Tipe Chantenay, berbentuk bulat panjang dengan ujung yang tumpul. b) Tipe Imperator, berbentuk bulat panjang dengan ujung runcing. c) Tipe Nantes, merupakan pengabungan antara imperator dan chantenay. Menurut Daisy (1994), proses kultur kalus harus melalui beberapa tahapan. Tahapan tersebut antara lain adalah pemilihan eksplan, sterilisasi umbi wortel, dan pemilihan media pengkulturan. Ekspan yang digunakan untuk kultur jaringan adalah umbi akarnya, dan lebih baik jika memakai jaringan cambium dan sekitarnya. Sterilisasi terhadap umbi wortel yang akan dipakai sebagai eksplan dalam kultur jaringan sangat penting dilakukan sebab umbi yang berasal dari tanah umumnya mudah sekali terkontaminasi dan biasanya lebih sulit sterilisasinya. Langkah-langkah sterilisasi untuk umbi wortel adalah sebagai berikut: Umbi wortel dicuci bersih dengan detergent, kemudian disterilisasi secara fisik dengan pembakaran. Sebelum dibakar, umbi wortel terlebih dahulu dicelup dalam spiritus sebanyak tiga kali. Sterilisasi dengan pembakaran ini umumnya sudah cukup, tetapi kadang-kadang umbi wortel tersebut masih perlu disterilisasi lagi dengan menggunakan 0,1 sublimat. Umbi yang telah dibakar kemudian dikupas kulit luarnya. Pengupasan dilakukan dalam laminair air flow dan kondisi steril. Umbi dipotong-potong selebar 2 cm dan dimasukkan dalam larutan sublimat sekitar tiga menit. Setelah itu, umbi wortel dicuci dengan air steril 3-4 kali untuk menghilangkan sisa sublimat yang masih menempel. Setelah dipotong-potong dengan ukuran 2x2x2 mm, maka umbi wortel tersebut siap ditanam. Medium yang digunakan untuk induksi kalus adalah medium MS padat yang diberi tambahan 2,4 D dan Kinetin dengan perbandingan 2:3 (Daisy, 1994). Asam 2,4-diklorofenoksiasetat (2,4-D) merupakan senyawa yang disintesis olehahli kimia yang mampu menimbulkan banyak respon fisiologis, biasanya senyawa inidianggap sebagai auksin. Senyawa ini tidak disintesis oleh tumbuhan, maka tidak disebutsebagai 15

hormon, tetapi dikelompokkan sebagai zat pengatur tumbuh tanaman. Asam 2,4-D mempunyai susunan cicin yang mengandung ikatan rangkap sebagai inti, sedangkan cincinitu terdapat rangkaian yang mempunyai gugus karbosil (Dwidjoseputro 1990). D. Alat dan Bahan 1. 2. 3. Laminar Air Flow (LAF) Petridish steril Pinset panjang dan pinset pendek steril 4. 5. 6. Scalpel steril Lampu spiritus Botol berisi alkohol 70% tempat scalpel dan pinset 7. Gelas ukur 8. Detergent/ sunlight 9. Alkohol 70 % 10. Aquadest steril 11. Media MS 2,4-D 1,5 ppm 12. Eksplan (umbi wortel) 13. Plastik 14. Karet 15. Alumunium foil

E. Cara Kerja 1. Mencuci umbi wortel dengan menggunakan sabun dan sedikit menggosok-gosoknya dengan sikat gigi agar kotoran di kulit umbi bersih kemudian bilas dengan air mengalir. 2. Menghidupkan lampu dan blower LAF kemudian membersihkan meja LAF dengan cara menyemprotkan alkohol 70% dan mengelapnya dengan tissue. 3. Menyemprotkan alkohol 70% pada kedua tangan kemudian megusap-usapnya hingga merata untuk mensterilkan tangan. 4. Masukkan alat dan bahan yang akan digunakan untuk penanaman ke dalam LAF dengan terlebih dahulu menyemprotnya menggunakan alkohol 70%. 5. Mencelupkan umbi wortel ke dalam alkohol 70% kemudian membakarnya pada lampu spiritus. 6. Meletakkan umbi wortel yang telah dibakar pada petridish. 7. Membuang bagian pangkal dan ujung umbi wortel 2cm 8. Memotong umbi wortel setebal 1cm dan memotong bagian luar dari umbi wortel sehingga menyisakan bagian dalam umbi dengan ukuran 1x1cm. 9. Mencelupkan kembali potongan umbi wortel ke dalam alkohol 70% kemudian membakarnya pada lampu spiritus. 10. Membuka botol yang berisi media MS 2,4D 1,5 ppm dan memasukkan potongan umbi wortel ke dalamnya.

16

11. Menutup kembali botol yang telah berisi eksplan dengan alumunium foil atau plastik kemudian dikareti dan diberi label. 12. Menyimpan botol yang berisi eksplan tersebut pada rak inkubasi. 13. Mengamati pertumbuhan kalus pada eksplan. F. Hasil Pengamatan Tabel 2.1 Hasil Pengamatan Kultur Kalus Umbi Wortel No. Kelompok Penanaman keKontaminasi Kontaminasi Tidak kontaminasi 1. I 1 2 2. II 1 2 3. III 1 2 4. IV 1 2 10 2 11 10 6 5 8 4 0 8 0 1 5 1 2 6 Semua praktikan melakukan penanaman ke-2 Semua praktikan melakukan penanaman ke-2 Penanaman ke-2 hanya oleh praktikan yang kontaminasi Semua praktikan melakukan penanaman ke-2 Keterangan

G. Pembahasan Praktikum dengan judul Kultur Kalus ini bertujuan untuk mengetahui cara menghasilkan kalus dari umbi wortel yang ditumbuhkan pada media MS 2,4-D 1,5 ppm. Kultur kalus ini bertujuan untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali. Kalus diharapkan dapat memperbanyak dirinya (massa selnya) secara terus-menerus. Alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah Laminar Air Flow (LAF), petridish steril, pinset panjang dan pinset pendek steril, scalpel steril, lampu spiritus, botol berisi alkohol 70% tempat scalpel dan pinset, gelas ukur, detergent/ sunlight, alkohol 70 %, aquadest steril, media MS 2,4-D 1,5 ppm, eksplan (umbi wortel), plastik, karet, dan alumunium foil. Pada praktikum kultur kalus wortel ini terdiri dari dua kegiatan yaitu sterilisasi umbi wortel, alat, dan bahan; serta penanaman umbi wortel pada media MS 2,4-D 1,5 ppm. Sterilisasi umbi wortel dilakukan dengan cara mengosok-gosok umbi wortel menggunakan sikat gigi yang telah diberi detergen/ sunlight, kemudian mencucinya dengan air mengalir. Setelah semua bahan diletakkan di dalam LAF, wortel kembali disterilisasi dengan cara 17

mencelupkannya ke dalam alkohol 70%, kemudian membakarnya di atas api lampu spiritus dan tunggu hingga nyala api mati sendiri. Sterilisasi bahan dapat dilakukan dengan cara filtrasi untuk bahan-bahan yang mudah rusak pada suhu tinggi (hormon), atau dengan autoclav untuk bahan-bahan yang tidak mudah rusak pada suhu tinggi seperti media. Sterilisasi menggunakan autoclav dilakukan dengan cara menutup botol yang telah berisi media menggunakan alumunium foil atau plastik kemudian diberi karet. Proses sterilisasi menggunakan autoclav ini dilakukan pada suhu 121oC selama 15 menit. Sterilisasi alat dilakukan dengan cara membungkus dengan menggunakan kertas payung (untuk petridish, scalpel dan pinset), serta menutup dengan alumunium foil atau plastik kemudian diberi karet (untuk botol-botol jam). Setelah semua alat terbungkus dengan rapi selanjutnya diautoclav pada suhu 121oC selama 30 menit. Penanaman eksplant (umbi wortel) pada media MS 2,4-D 1,5 ppm dilakukan dalam Laminar Air Flow (LAF). LAF adalah meja kerja steril untuk melakukan kegiatan inokulasi/ penanaman. LAF merupakan suatu alat yang digunakan dalam pekerjaan persiapan bahan tanaman, penanaman, dan pemindahan tanaman dari sutu botol ke botol yang lain dalam kultur in vitro. Alat ini diberi nama Laminar Air Flow Cabinet, karena meniupkan udara steril secara kontinue melewati tempat kerja sehingga tempat kerja bebas dari, debu dan sporaspora yang mungkin jatuh kedalam media, waktu pelaksanaan penanaman. Aliran udara berasal dari udara ruangan yang ditarik ke dalam alat melalui filter pertama (pre-filter), yang kemudian ditiupkan keluar melalui filter yang sangat halus yang disebut HEPA (High efficiency Particulate Air FilterI), dengan menggunakan blower. LAF digunakan sebagai ruangan untuk pengerjaan secara eseptis. Prinsip penaseptisan suatu ruangan berdasarkan aliran udara keluar dengan kontaminasi udara dapat diminimalkan. Sebelum semua alat dan bahan dimasukkan dalam LAF perlu dilakukan sterilisasi. Proses sterilisasi ini dilakukan dengan cara nyalakan bower pada LAF; sterilkan kedua tangan dengan menyemprotkan alkohol 70%; sterilisasi meja Laminar Air Flow (LAF) dengan alkohol 70%; serta alat dan bahan yang akan dipakai dimasukkan ke dalam Laminair Air Flow (LAF) setelah disterilisasi dengan membasahi bagian luarnya dengan menyemprotkan alkohol 70%. Penanaman dilakukan dengan cara potong wortel setebal 1 cm dengan scalpel steril dan buang bagian luarnya sehingga dipeoleh bagian dalam umbi yang berupa korteks, kambium, dan xilem; sebelum eksplant dimasukkan ke dalam media dilakukan sterilisasi dengan mencelupkan kembali potongan ekspant ke dalam alkohol, kemudian dibakar pada lampu bunsen, dan biarkan api pada umbi padam dengan sendirinya; masukkan potongan eksplan tersebut ke dalam botol yang berisi media MS 2,4-D 1,5 ppm dengan pinset steril; 18

tutup botol yang berisi eksplan dengan plastik yang kemudian diikat dengan karet atau menutupnya dengan alumunium foil dan diberi label; serta simpan dalam ruang inkubasi. Hasil dari kultur kalus umbi wortel ini adalah kalus, yaitu kumpulan sel-sel yang belum mengalami deferensiasi. Asam 2,4-diklorofenoksiasetat (2,4-D) merupakan senyawa yang

disintesis olehahli kimia yang mampu menimbulkan banyak respon fisiologis, biasanya senyawa inidianggap sebagai auksin. Senyawa ini tidak disintesis oleh tumbuhan, maka tidak disebutsebagai hormon, tetapi dikelompokkan sebagai zat pengatur tumbuh tanaman. Asam 2,4-D mempunyai susunan cicin yang mengandung ikatan rangkap sebagai inti, sedangkan cincinitu terdapat rangkaian yang mempunyai gugus karbosil (Dwidjoseputro 1990). Dari hasil pengamatan terlihat bahwa hasil kultur kalus umbi wortel ini banyak yang mengalami kontaminasi oleh mikroorganisme. Pada penanaman pertama dari semua kelompok yang mengalami kontaminasi sebanyak 35 botol dari 42 botol dengan presentase sebesar 83,33%, yaitu untuk kelompok I yang mengalami kontaminasi sebanyak 10 botol dari 10 botol, kelompok II sebanyak 11 botol dari 11 botol, kelompok III sebanyak 6 botol dari 11 botol, dan kelompok IV sebanyak 8 botol dari 10 botol; sedangkan yang tidak mengalami kontaminasi sebanyak 7 botol dari 42 botol dengan presentase sebesar 16,67%, yaitu untuk kelompok I yang tidak mengalami kontaminasi sebanyak 0 botol dari 10 botol, kelompok II sebanyak 0 botol dari 11 botol, kelompok III sebanyak 5 botol dari 11 botol, dan kelompok IV sebanyak 2 botol dari 10 botol. Akibat banyaknya kontaminasi yang terjadi dilakukan pengulangan pengkulturan somatik embrigenesis ini. Pengulangan dilakukan oleh semua praktikan pada setiap kelompok, kecuali kelompok III dimana hanya yang mengalami kontaminasi yang melakukan pengulangan pengkulturan.
12 10 8 6 4 2 0 kelompok I kelompok II kelompok III kelompok IV kontaminasi tidak kontaminasi

19

Grafik 2.1 Perbandingan hasil pengkulturan yang mengalami kontaminasi dan tidak mengalami kontaminasi untuk semua kelompok pada penanaman 1 Dari hasil pengamatan pada penanaman kedua dari semua kelompok diketahui bahwa yang mengalami kontaminasi sebanyak 21 botol dari 37 botol dengan presentase sebesar 56,76%, yaitu untuk kelompok I yang mengalami kontaminasi sebanyak 2 botol dari 10 botol, kelompok II sebanyak 10 botol dari 11 botol, kelompok III sebanyak 5 botol dari 6 botol, dan kelompok IV sebanyak 4 botol dari 10 botol; sedangkan yang tidak mengalami kontaminasi sbanyak 16 botol dari 37 botol dengan presentase sebanyak 43,24%, yaitu untuk kelompok I yang tidak mengalami kontaminasi sebanyak 8 botol dari 10 botol, kelompok II sebanyak 1 botol dari 11 botol, kelompok III sebanyak 1 botol dari 6 botol, dan kelompok IV sebanyak 6 botol dari 10 botol.
12 10 8 6 4 2 0 kelompok I kelompok II kelompok III kelompok IV kontaminasi tidak kontaminasi

Grafik 2.2 Perbandingan hasil pengkulturan yang mengalami kontaminasi dan tidak mengalami kontaminasi untuk semua kelompok pada penanaman 2
40 35 30 25 20 15 10 5 0 penanaman 1 penanaman 2 kontaminasi tidak kontaminasi

20

Grafik 2.3 Perbandingan hasil pengkulturan yang mengalami kontaminasi dan tidak mengalami kontaminasi secara keseluruhan antara penanaman 1 dan penanaman 2 Kontaminasi yang terjadi pada kultur kalus umbi wortel ini dapat terjadi karena beberapa faktor. Faktor yang paling utama adalah proses sterilisasi yang tidak sempurna baik saat proses sterilisasi umbi wortel; dan saat proses sterilisasi media, scalpel, pinset, LAF dll. Selain itu dapat disebabkan karena mikroorganisme terutama jamur yang terbawa dari

eksplant (umbi wortel) karena umbi wortel berasal dari tanah sehingga kemungkinan besar dapat membawa berbagai macam mikroorganisme, penutupan botol yang kurang rapat, air yang digunakan tidak steril, LAF yang sudah tidak berfungsi dengan baik, atau akibat kesalahan praktikan seperti terlalu banyaknya praktikan yang berada di dalam ruang inkubasi dan praktikan yang tetap berbicara saat proses penanaman. Kontaminasi dapat disebabkan oleh mikroorganisme seperti jamur dan bakteri. Tanda-tanda kontaminasi yang disebabkan oleh jamur adalah nampak adanya benang-benang hifa yang umumnya berwarna putih sedangkan tanda-tanda kontaminasi yang disebabkan oleh bakteri adalah nampak adanya cairan berlendir dengan warna yang bermacam-macam. Berdasarkan hasil pengamatan pada hasil kultur yang tidak mengalami kontaminasi diketahui bahwa potongan umbi wortel yang ditanam pada media MS 2,4-D 1,5 ppm menghasilkan kalus. Kalus merupakan kumpulan sel-sel yang belum mengalami deferensiasi. Selain itu, dari hasil pengamatan juga terlihat adanya perubahan warna umbi wortel dari kejingga-jinggaan (oranges) menjadi putih. Perubahan warna tersebut dapat terjadi akibat adanya pengaruh hormon yang terdapat pada media, dan sel-sel pada umbi wortel mengalami kematian akibat terlalu lamanya pembakaran saat proses sterilisasi. Pada hasil pengamatan ini juga terlihat beberapa kultur yang mengalami browning (pencoklatan media). Browning ini dapat terjadi karena adanya senyawa fenol yang mengalami oksidasi yang dikeluarkan oleh eksplant ke media sehingga mengnyebabkan media berwarna kecoklatan. Senyawa fenol ini timbul akibat stress mekanik yang dialami eksplant yang dapat timbul akibat pelukaan pada waktu proses isolasi eksplan dari tanaman induk. Senyawa fenol tersebut bersifat toksik, menghambat pertumbuhan atau bahkan dapat mematikan jaringan eksplan.

21

H. Kesimpulan Berdasarkan hasil pengamatan dan pembahasan di atas dapat disimpulkan bahwa kultur kalus pada umbi wortel dilakukan dengan menggunakan media MS 2,4-D 1,5 ppm dan menghasilkan kalus. Selain itu, beberapa eksplan umbi wortel juga mengalami perubahan warna menjadi putih, kemungkinan terjadi akibat pengaruh pemberian hormon pada media, dan kematian sel-sel akibat terlalu lamanya pembakaran saat sterilisasi. Selain itu juga terjadi browning akibat produksi senyawa fenol dari eksplant. Pada praktikum ini banyak terjadi kontaminasi oleh mikroorganisme terutama jamur. Hal ini dapat terjadi karena beberapa faktor diantaranya adalah proses sterilisasi eksplant (umbi wortel), media, scalpel, pinset, LAF dll yang digunakan tidak sempurna, eksplant yang telah mengandung mikroorganisme terutama jamur, ruang inkubasi yang tidak steril, dan kesalahan praktikan seperti terlalu banyaknya praktikan yang berada di dalam ruang inkubasi dan praktikan yang tetap berbicara saat proses penanaman. I. Saran Pada praktikum kultur jaringan, praktikan lebih menjaga kebersihan ruangan yang akan digunakan untuk kultur, menjaga alat dan bahan agar tetap steril ketika akan digunakan, dan melakukan kultur sesuai dengan prosedur sehingga dapat memperkecil kemungkinan terjadinya kontaminasi.

22