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GARANTA

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BIOTOOLS Pfu DNA POLYMERASE 1 U/l


REF. FORMATO CONTENIDO

Fabricado por: BIOTOOLS, Biotechnological & Medical Laboratories, S.A. han sido evaluados y certificados en cuanto a cumplimiento de los requisitos de la ISO 9001:2000 para las siguientes actividades: investigacin y desarrollo de productos de biotecnologa, fabricacin de productos de biotecnologa y fabricacin de productos para diagnstico in vitro (IVDs). Valle de Tobalina 52 Nave 39, 28021 Madrid Spain 2009 BIOTOOLS, Biotechnological & Medical Laboratories, S.A. Todos los derechos reservados

10.501 10.502 10.511 10.512

100 U 250 U 100 U 250 U

BIOTOOLS Pfu DNA Polymerase (1 U/l) 10X Standard Reaction Buffer with MgCl2 BIOTOOLS Pfu DNA Polymerase (1 U/l) 10X Standard Reaction Buffer with MgCl2 BIOTOOLS Pfu DNA Polymerase (1 U/l) 10X Reaction Buffer MgCl2 FREE BIOTOOLS Pfu DNA Polymerase (1 U/l) 10X Reaction Buffer MgCl2 FREE

BIOTOOLS B&M Labs, S.A. Valle de Tobalina - 52 - Nave 39 28021 Madrid Spain Tel. (34) 91 710 00 74 Fax (34) 91 505 31 18 E-mail: info@biotools.eu www.biotools.eu

Almacenar a -20C
Aviso a usuarios: Algunas de las aplicaciones que pueden llevarse a cabo con este producto estn cubiertas por patentes aplicables en ciertos pases. La adquisicin de este producto no incluye o provee de una licencia para realizar aplicaciones patentadas. En algunos casos, los usuarios tienen la obligacin de adquirir una licencia, dependiendo del pas y/o la aplicacin. Ed 11.Marzo 2010

1. DESCRIPCIN DEL PRODUCTO


BIOTOOLS Pfu DNA Polymerase es una polimerasa termfila con actividad correctora de errores (proof-reading) debido a su actividad 3-5 exonucleasa. Es una protena recombinante procedente de la bacteria hipertermfila Pyrococcus furiosus, expresada en E. coli (ver Nota 1). BIOTOOLS Pfu DNA polimerasa est indicada para todas aquellas aplicaciones que requieren una polimerasa con actividad proof-reading, altamente termoestable y procesiva, adecuada para reacciones de amplificacin o similares (p.ej. primer extension). Esta enzima posee una tasa de error un orden de magnitud menor que la tasa de error de otras polimerasas que carecen de actividad proof-reading. Esta enzima no presenta actividad endonucleasa, de tipo nicking, ni actividad 5-3 exonucleasa. Tampoco presenta actividad nucleotidil transferasa terminal por lo cual los productos de amplificacin de Pfu se pueden utilizar directamente para clonar en cualquier vector con extremos romos.
La enzima incluida se suministra a una concentracin 1 U/l en el buffer de almacenamiento. Esta concentracin facilita el pipeteo sin error de pequeas cantidades de Pfu DNA Polymerase, de forma que no es necesario llevar a cabo diluciones ulteriores.

4. ESPECIFICACIONES DEL PRODUCTO


Definicin de Unidad- cantidad de enzima que incorpora 10 nanomoles de
dNTPs en ADN cido-insoluble en 30 minutos a 72 C.

Buffer de almacenamiento- Tris-HCl 20 mM (pH 8.0), KCl 50 mM, NP40,


0.25%, Tween 20 0.25%, glycerol 40% (v/v). El buffer llamado 10X STANDARD REACTION BUFFER with MgCl2 incluye, adems 20 mM de MgCl2en su composicin.

10X Reaction Buffer- Tris HCl 750 mM (pH 9.0), KCl 500 mM, (NH4)2SO4 200 mM.

5. ASPECTOS GENERALES DE LOS COMPONENTES DE LA REACCIN


Concentracin de Enzima
Biotools Pfu DNA Polymerase es apta para su uso tanto en aplicaciones PCR estndar como aquellas ms especializadas. Como gua inicial se recomienda utilizar las siguientes cantidades de enzima por reaccin.
Volumen de Reaccin Final Unidades de enzima recomendadas Hasta 2.5 Unidades 1-1.25 Unidades 0.5-0.75 Unidades

Aplicaciones del producto:


Reacciones de PCR estndar u otras reacciones que requieran sntesis de ADN a alta temperatura. PCR Multiplex PCR in situ

100 l 50 l 25 l

2. CARACTERSTICAS DE LA ENZIMA
Concentracin: ........................................... Actividad ptima: Concentracin de enzima .. pH...................................... Temperatura de extensin . Concentracin de MgCl2 .... Tamao de los productos de PCR: ............. Tipo de clonaje: .......................................... Actividad endonucleasa: ............................. Actividad reverso transcriptasa: .................. Actividad 53exonucleasa: ..................... Actividad 35exonucleasa: ..................... Actividad tipo nicking .................................. 1 U/l 20-40 mU/l 8-9 72C 2 mM Hasta 5 Kb Extremos romos No No No Si No

El aadir mayor cantidad de enzima no asegura un mayor rendimiento de la reaccin, solamente en algunas aplicaciones como PRIND (Primed In Situ Syntesis) o cuando se amplifica fragmentos de ADN de gran tamao (mayores de 2 Kb de ADN genmico) puede ser necesario aumentar el contenido de la enzima.

ADN Molde
Tanto la calidad como la cantidad de ADN molde afectan la sensibilidad y la eficiencia de la reaccin de amplificacin La utilizacin de altas concentraciones de ADN puede favorece el aumento de productos de reaccin inespecficos. La reaccin de PCR puede ser inhibida por varios componentes ej. detergentes inicos, fenol, dyes, etc. Si el ADN molde contiene trazas de inhibidores, reduzca su presencia diluyendo el ADN molde o utilizando menor cantidad de ADN molde. En ciertos casos puede ser necesario repurificar el ADN molde mediante precipitacin con etanol seguido de varios lavados.

Concentracin de dNTPs
Generalmente se utilizan cantidades equimolares de dNTPs. La concentracin de cada dNTP es de 50-500 M, siendo la concentracin ms usual 200 M. La concentracin de dNTPs puede disminuirse (ej. cuando existen amplificaciones inespecficas) o aumentarse (cuando se amplifican fragmentos de gran tamao), incluso se pueden desequilibrar a favor de algn dNTP en concreto (ej. experimentos de mutagnesis in vitro). Si se incrementa la concentracin de dNTPs en una reaccin de amplificacin, se deber aumentar en paralelo la concentracin de MgCl2, pues los dNTPs se comportan como potentes quelantes del catin Mg2+. Biotools Pfu DNA Polymerase puede emplearse en reacciones de amplificacin con dNTPs modificados con marcajes radioactivos o con fluorescena. Tambin puede utilizarse con dUTP u otros anlogos.

Nota 1: Esta enzima no est recomendada para experimentos que utilicen secuencias homlogas a E. coli o amplificaciones con temperaturas de annealing muy bajas (p.ej. RAPDs, Random Amplified Polymorphic DNAs)

3. CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO
Conservar a -20C en un congelador que garantice una temperatura constante (no se recomiendan congeladores frost-free). En estas condiciones, la enzima es estable durante 24 meses. El glicerol del tampn de almacenamiento evita que la enzima se congele a -20C. En cualquier caso, si se congela, su actividad no se ver afectada.

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Buffer de Reaccin
El buffer incluido ha sido especialmente formulado para llevar a cabo todo tipo de reacciones de amplificacin. El objetivo del buffer es crear las condiciones de reaccin apropiadas para que los primers hibriden en un amplio rango de temperatura. En la composicin del Standard Reaction Buffer se incluye MgCl2 a la concentracin ptima para la mayora de experimentos (2 mM final).

7. GUA PARA EL PROGRAMA DE AMPLIFICACIN


Desnaturalizacin Inicial- Si el paso de desnaturalizacin inicial es incompleto la eficiencia del primer ciclo de amplificacin se ver afectado y como consecuencia el rendimiento final de la reaccin. La desnaturalizacin inicial no debe prolongarse ms de lo estrictamente necesario a fin de evitar que la enzima se inactive. Generalmente una temperatura de 94C durante 3-5 minutos suele ser suficiente. Cuando el ADN molde posea un elevado contenido de G+C se recomienda incrementar el tiempo de desnaturalizacin hasta 10 minutos. Paso de Desnaturalizacin- El producto de amplificacin obtenido es menor que el ADN molde por lo cual el periodo de desnaturalizacin es ms corto que el de desnaturalizacin inicial. Un periodo de desnaturalizacin de 5-30 segundos a 94C suele ser suficiente. Paso de Anillamiento- Si los primers tienen <20 bases, la temperatura de
anillamiento es igual a la del primer con menor Tm. Para calcular la temperatura ptima de anillamiento se puede emplear un gradiente de temperatura. Comience utilizando una temperatura de anillamiento 5 C inferior de la Tm calculada de ambos primers. Si los primers tienen una temperatura de anillamiento elevada se puede reducir el nmero de pasos del ciclo de amplificacin a dos.

Concentracin de MgCl2
El usuario tiene que determinar experimentalmente la concentracin ptima de MgCl2 para su ensayo. Biotools recomienda comenzar los ensayos con una concentracin de MgCl2 de 1.5-2 mM, pues el ptimo para la mayora de experimentos testados ha sido de 2 mM. Concentraciones elevadas de MgCl2 pueden dar lugar a la formacin de productos de amplificacin inespecficos y baja fidelidad de copia; en tanto que bajas concentraciones de MgCl2 pueden reducir el rendimiento del producto deseado. Si las muestras incluyen en su composicin agentes quelantes de metales como EDTA, se recomienda aumentar la concentracin de MgCl2 en la reaccin.

Diseo de los Primers


Los primers utilizados en experimentos de PCR convencionales poseen un tamao de 15-30 nucletidos con un contenido en G+C de 40-60%. Para evitar la formacin de dmeros de primer o de horquillas, los primers no deben de ser complementarios consigo mismos o con otros primers de la reaccin. La temperatura de anillamiento de los primers debe de ser similar con un mximo de 5 C de diferencia entre ellos. Cuando se realice la seleccin de primers se debe tener en cuenta el contenido en G+C y el tamao de los mismos. El extremo 5 del primer puede contener bases desapareadas con el ADN molde, sin embargo no es recomendable que esto ocurra en el extremo 3.

Paso de Extensin- Los primers una vez que han hibridado con el ADN molde se extienden a 70-75C. El tiempo del paso de extensin est en funcin del tamao del producto de amplificacin esperado. Para la Pfu ADN polimerasa de Biotools se recomienda emplear aproximadamente 2 min por cada Kb a amplificar. Nmero de Ciclos- El nmero de ciclos del programa normalmente es de 25-35.
Este parmetro depende de la cantidad del material de partida y del rendimiento esperado. En algunos experimentos al aumentar el nmero de ciclos se aumenta la cantidad de productos inespecficos generados y se reduce la eficiencia de reaccin. Determine experimentalmente el nmero ptimo de ciclos.

Aditivos de la Reaccin de PCR


En algunos casos en los que la optimizacin de la reaccin de PCR presenta dificultades, la presencia de DMSO, betana, formamida u otros aditivos puede ser necesaria. Tanto la enzima como el buffer de reaccin incluidos son compatibles con la mayora de aditivos. Tener en cuenta que ciertos aditivos disminuyen la temperatura de melting de los primers.

Paso de Extensin Final- Una vez finalizado el ciclo de amplificacin la muestra se debe de incubar a 72C durante 5-15 min. La Pfu ADN polimerasa no aade oligonucletidos de adenina extra en el extremo 3de los amplicones formados.

6. PROTOCOLO DE USO
Las condiciones ptimas deben de ser determinadas para cada experimento.
Trabaje en el rea de preparacin de reactivos en una cabina de flujo laminar. Esta rea debe de encontrarse separada del rea de preparacin de ADN y del rea de PCR. Para evitar contaminaciones utilice guantes de examen y puntas de pipeta y tubos de reaccin estriles libres de DNasas y RNasas.

8. SOLUCIN DE PROBLEMAS
Problema Causa
Error de pipeteo o algn reactivo se ha olvidado

Recomendacin
Verifique la concentracin y condicin de almacenamiento de dNTPs, primers, etc. Repita el ensayo asegurndose de que no falta ningn reactivo y no hay errores de concentracin o pipeteo. Verifique la concentracin y calidad del material de partida. No utilice ADN degradado.

1. Descongele los reactivos a temperatura ambiente o en hielo. Despus de descongelar mezcle bien con ayuda de un vortex y centrifugue. Mantenga los reactivos en hielo. 2. Prepare la master mix en un tubo de reaccin estril siguiendo las instrucciones de la Tabla 1. En cada experimento incluya al menos un control negativo (NTC sin ADN molde). Para tener suficiente volumen, prepare la master mix para varias reacciones ms de las necesarias.
Se recomienda incorporar la Pfu DNA polimerasa al final a fin de evitar que su actividad 35 exonucleasa degrade los primers (sobre todo si se aade en ausencia de los dNTPs). TABLA 1. Preparacin de la Master Mix COMPONENTE Master Mix 10X REACTION BUFFER MgCl2 solution (50 mM)* dNTP Mix 10 mM each Primers Pfu DNA Polymerase (1 U/l) Agua bidestilada estril ADN Molde 1X 1.5-4 mM 200 M de cada dNTP variable 20-40 mU/l Variable 5 l 1.5-4 l 1 l variable 1-2 l Hasta vol final Variable 2 l 0.6-1.6 l 0.4 l variable 0.4-0.8 l Hasta vol final Variable CONC FINAL VOL FINAL 50 l rxn 20 l rxn
Baja eficiencia de amplificacin o ausencia de amplificacin

Problemas con el ADN molde

Si el ADN molde presenta cierta complejidad ej. alto contenido en secuencias GC se recomienda aadir DMSO a la reaccin. Repita la reaccin de PCR con una dilucin del material de partida o con otra alcuota del ADN molde.. Revise el diseo de los primers y las condiciones en que se encuentra. Evite aquellos diseos proclives a la formacin de dmeros.

Problemas con los primers

Repita la PCR con diferente concentracin de primers de 0.10.5 M en incrementos de 0.1. Verifique que el primer no se encuentre degradado mediante un gel de poliacrilamida.

Concentracin de Mg no ptima

2+

Repita la PCR con diferente concentracin de Mg de 1.5-4 mM en incrementos de 0.25 mM. Aumente la concentracin de enzima en incrementos de 0.2 Unidades Verifique los amplificacin: siguientes parmetros del programa de

2+

Baja concentracin de enzima

Desnaturalizacin- aumente la temperatura y el tiempo de la desnaturalizacin inicial. Programacin no ptima Anillamiento- optimice la temperatura de anillamiento y el tiempo (vase seccin 8). Para aumentar la especificidad utilice el programa touchdown or stepdown. Tiempo de extensin- incremente el periodo de extensin en incrementos de 30 seg. Nmero de ciclos- incremente el nmero de ciclos en incrementos de 5 ciclos. Incluya el periodo de elongacin final en el programa de amplificacin.. La temperatura de anillamiento es baja Aumente la temperatura de anillamiento en incrementos de 1C. Revise el diseo de los primers as como su condicin. Normalmente la concentracin de los primers es equimolar. Revise la concentracin de ambos primers si es necesario titlelos. Repita la PCR con una concentracin diferente de primers de 0.1-0.5 M en incrementos de 0.1. Verifique que los primers no se hayan degradado en un gel de poliacrilamida. Exceso de ADN molde Diluya el ADN molde y utilice una dilucin del mismo. Prepare siempre un control negativo (NTC no template control) Si en el control negativo aparecen bandas o smear cambie de reactivos. Optimice la concentracin de enzima para su ensayo. Utilice el programa touchdown or stepdown del termociclador. Reduzca el nmero de ciclos. Repita la PCR con diferente concentracin de Mg de 1.5-4 mM en incrementos de 0.25 mM.
2+

*no es necesario para 10X Standard Reaction Buffer, pues este buffer incluye MgCl2 3. Mezcle bien la master mix y mantngala en hielo. Distribuya el volumen apropiado en cada vial.
Proceda a trabajar en el rea de purificacin de ADN separada de otras fuentes de ADN.

4. Aada el ADN molde a cada vial de reaccin. Cierre los viales y mezcle cuidadosamente. Para termocicladores sin tapa calefactora, aadir aceite mineral en los tubos de reaccin.
Proceda al rea de amplificacin o PCR

Problema con los primers

5. Programe el termociclador segn la gua de la tabla 2. Coloque los viales en el termociclador y ejecute el programa de PCR seleccionado.
TABLA 2. Programa de Amplificacin Estndar

Aparecen bandas de amplificacin inespecficas o smear

PASOS Desnaturalizacin Inicial Desnaturalizacin Anillamiento Extensin Extensin Final Enfriamiento

N CICLOS 1 25-35* 1

TEMPERATURA 94C 94C Tm-5C 72C 72C 4C

TIEMPO 3-10 min** 5-30 seg 30-60 seg 2 min/1 Kb 5-15 min
Amplificacin en el control negativo

Contaminacin Concentracin de enzima muy elevada Baja especificidad de la reaccin Concentracin no 2+ ptima de Mg Contaminacin

*Optimice el tiempo, la temperatura y el nmero de ciclos de la PCR. **Dependiendo del molde.

Cambie todos los reactivos utilizados

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