AISLAMIENTO DEL ADN

Para clonar ADN 1. 2. 3. 4. 5. 6. Obtener un fragmento de ADN a clonar Obtener y purificar el vector clonado Digerir y ligar molculas de ADN para crear la molcula recombinante. Introducir la construccin en el organismo hospedador Crecimiento y seleccin de los organismos Obtener y purificar nueva molcula de ADN.

Enzimas de restriccin En los procariotas existe un mecanismo de restriccin regulado por el husped que les permite a las bacterias distinguir lo propio de lo ajeno, este mecanismo tiene como objetivo controlar la entrada de ADN ajeno, los encargados de la degradacin son las endonucleasas de restriccin, la bacteria protege su propio ADN metilando las bases de ADN que son reconocidos por las enzimas de restriccin. Las enzimas de restriccin reconocen una secuencia nucleotida especifica de doble cadena en el ADN y lo cortan dejando extremos romos o cohesivos.

Las secuencias palindromicas tienen un eje de simetra de manera que ambas poseen la misma secuencia.

Plsmidos y clonacin Los plasmidos son molculas de ADN cerrados covalentemente CCC, poseen homogenizacin gentica, tamao constante y capacidad de recuperarse independientemente del cromosoma. El vector de clonacin las caractersticas son:

Bajo PM Contienen un origen de replicacin Capacidad de adquirir factores fenotpicos fcilmente seleccionables. Poseen un sitio de poli-linker o MCS el cual es una regin con una secuencia reconocible por varias endonucleasas de restriccin.

Para corrobar que el plsmido tiene el fragmento de ADN de inters: Se utiliza -gal: que codifica la enzima -galactosidasa y en el interior de este gen esta MCS por lo tanto el nuevo fragmento de ADN irrumpe la expresin de -galactosidasa y por lo tanto cuando hacems crecer en una placa las bacterias con x-gal el sustrato de dicha enzima da un producto azul al hidrolizarse se obtienen colonias azules sin inserto y colonias blancas recombinantes. Extraccin del ADN plasmdico 1. 2. 3. 4. 5. Crecimiento de bacterias Amplificacin de plasmidos Cosecha Lisis Purificacin del ADN plasmdico

Diferencias de ADN plasmdico vs. ADN cromosmico. Los plsmidos tienen menor tamao El ADN cromosmico de las bacterias es circular pero al extraerlo se obtiene fragmentado. Los plsmidos son molculas de ADN circular cerrado unido covalentemente. CCC

Desnaturalizacin alcalina Para la extraccin de ADN plasmdico se lisan las clulas por el agregado de SDS + NaOH, estas condiciones desnaturalizan el ADN en molculas lineales de ADN pero no a las CCC las cuales sufren una desnaturalizacin parcial. El ADN cromosmico se encontrara en forma fragmentada y el plasmdico se mantendr cerrada. Cuando se neutraliza con acido actico en condiciones de alta concentracin salina (acetato de potasio), el ADN cromosomal precipita. La extraccin mayoritaria de las protenas se realiza con cloroformo y finalmente se concentra el ADN purificado mediante precipitaciones alcoholicas.