Tese PHD Joana Arroz Albuquerque

Universidade Tcnica de Lisboa
Instituto Superior de Agronomia
CARACTERIZAO DA SUBTILISINA RELACIONADA COM A DEGRADAO DA RIBULOSE BISFOSFATO CARBOXILASE DE PLANTAS

Joana Arroz Correia Albuquerque
ORIENTADOR: Doutor Ricardo Manuel Seixas Boavida Ferreira JRI: Presidente: Reitor da Universidade Tcnica de Lisboa Vogais: - Doutora Maria Manuela Coelho Cabral Ferreira Chaves, professora catedrtica do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Tcnica de Lisboa; - Doutor Ricardo Manuel Seixas Boavida Ferreira, professor catedrtico do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Tcnica de Lisboa; - Doutora Maria Manuela Antunes Marques David, professora associada da Faculdade de Engenharia de Recursos Naturais da Universidade do Algarve; - Doutora Maria da Glria Ingls Calado Esquvel, professora auxiliar do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Tcnica de Lisboa; - Doutor Jos Domingos Cochicho Ramalho, investigador auxiliar do Instituto de Investigao Cientfica e Tropical.
Tese apresentada neste Instituto para obteno do grau de doutor Doutoramento em Engenharia Agronmica Lisboa 2009 1
ndice
NDICE DE FIGURAS NDICE DE TABELAS AGRADECIMENTOS RESUMO ABSTRACT ABREVIATURAS 1 1.1
1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4
v ix xi xiii xv xvii
INTRODUO............................................................................................................ 1 DEGRADAO DA RUBISCO ........................................................................................ 2

INIBIO DA DEGRADAO E SUSCEPTIBILIZAO DEGRADAO..............................................3 DEGRADAO CLOROPLSTICA DA RUBISCO ..............................................................................6 SENESCNCIA DO CLOROPLASTO ...............................................................................................8 DEGRADAO VACUOLAR .......................................................................................................10
1.2 1.3 2 2.1 2.2

2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4
PROTEASES DE SUBTILISINA......................................................................................15 OBJECTIVO ..............................................................................................................19 MATERIAL E MTODOS ..........................................................................................21 REAGENTES .............................................................................................................21 MATERIAL BIOLGICO ...............................................................................................21
CONDIES DE CULTURA DE LEMNA MINOR ..............................................................................22 CONDIES DE CULTURA DE TRITICUM AESTIVUM .....................................................................23 CONDIES DE CULTURA DE ARABIDOPSIS THALIANA ...............................................................24 CONDIES DE CULTURA DE ESCHERICHIA COLI .......................................................................24
2.3
2.3.1 2.3.2 2.3.3
DOSEAMENTO DE PROTENAS ....................................................................................25

MTODO DE LOWRY MODIFICADO .............................................................................................25 LEITURA DA ABSORVNCIA ......................................................................................................25 MTODO DE FLUOROPROFILE ..............................................................................................26
2.4
2.4.1 2.4.2 2.4.3
ELECTROFORESE .....................................................................................................26
ELECTROFORESE DESNATURANTE EM GEL DE POLIACRILAMIDA.................................................26 ELECTROFORESE NATIVA EM GEL DE POLIACRILAMIDA ..............................................................28 ELECTROFORESE EM GEL DE AGAROSE ....................................................................................29
2.5
2.5.1 2.5.2
IMMUNOBLOTTING................................................................................................. 29
TRANSFERNCIA DOS POLIPPTIDOS RESOLVIDOS EM SDS-PAGE PARA UMA MEMBRANA........ 29 COLORAO DE POLIPPTIDOS EM MEMBRANAS DE NITROCELULOSE COM PONCEAU S OU AMIDO ............................................................................................................................................. 30 IMUNODETECO ................................................................................................................... 30
BLACK
2.5.3
2.6
2.6.1 2.6.2 2.6.3
EXTRACO DE CIDOS NUCLEICOS .......................................................................... 31

EXTRACO DE DNA ............................................................................................................. 31 EXTRACO DE RNA ............................................................................................................. 32 QUANTIFICAO DE CIDOS NUCLEICOS .................................................................................. 33
2.7
2.7.1 2.7.2 2.7.3
AMPLIFICAO DE CIDOS NUCLEICOS POR PCR....................................................... 34

SNTESE DE CDNA POR RT- PCR .......................................................................................... 34 REACO DE PCR ................................................................................................................. 34 PURIFICAO DOS PRODUTOS DE PCR ................................................................................... 35
2.8
2.8.1
CLONAGEM DOS PRODUTOS DE PCR EM E. COLI ....................................................... 35

PURIFICAO DE PLASMDEOS ................................................................................................ 36
2.9
SEQUENCIAO DE DNA.......................................................................................... 36
2.10 ALINHAMENTO E ANLISE DE SEQUNCIAS ................................................................ 36 3 CARACTERIZAO BIOQUMICA DA SUBTILISINA, SBT_TRITICUM, QUE, IN
VITRO, DEGRADA PREFERENCIALMENTE A FORMA OXIDADA DA RUBISCO ...... 39 3.1 3.2

3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.2.5 3.2.6 3.2.7 3.2.8
INTRODUO ........................................................................................................... 39 MATERIAL E MTODOS ............................................................................................. 43

PURIFICAO DA FORMA NATIVA E DA FORMA OXIDADA DA RUBISCO ........................................ 43 MEDIO DA RADIOACTIVIDADE .............................................................................................. 46 DETERMINAO DA ACTIVIDADE PROTEOLTICA CONTRA A RUBISCO ......................................... 46 PURIFICAO DA PROTEASE SBT_TRITICUM ........................................................................... 47 PURIFICAO DA PROTEASE EM FPLC, SEM A SEPARAO DOS PICOS A E B .......................... 49 SEQUENCIAO INTERNA DE DOIS FRAGMENTOS DE UM POLIPPTIDO DO PICO A....................... 50 SEQUENCIAO DO CDNA DA PROTEASE SBT_TRITICUM ....................................................... 50 PRODUO DE ANTICORPOS POLICLONAIS ANTI-LSU, ANTI-SSU, ANTI-SBT_TRITICUM E ANTI-
SBT_AT............................................................................................................................................ 52
ii
3.3
3.3.1 3.3.2 3.3.3
RESULTADOS E DISCUSSO ......................................................................................59

PURIFICAO DA PROTEASE SBT_TRITICUM............................................................................59 SEQUENCIAO DO CDNA DE SBT_TRITICUM .........................................................................63 PRODUO DE ANTICORPOS POLICLONAIS: ANTI-LSU, ANTI-SSU, ANTI-SBT_TRITICUM E ANTI-
SBT_AT.............................................................................................................................................77 3.3.4 CARACTERIZAO BIOQUMICA DA SBT_TRITICUM...................................................................83
RELACIONAMENTO DA DEGRADAO DA RUBISCO COM A SUBTILISINA,
SBT_TRITICUM E SBT_AT ............................................................................................95 4.1 4.2

4.2.1
INTRODUO ............................................................................................................95 MATERIAL E MTODOS ..............................................................................................99

METODOLOGIA UTILIZADA PARA PESQUISAR PROTEASES ENVOLVIDAS NA DEGRADAO DA ARABIDOPSIS THALIANA. ..................................................................................................99
RUBISCO EM
4.2.2
AVALIAO DO TEOR DE RUBISCO E DE SBT_TRITICUM EM FOLHAS DE TRIGO COM CRESCIMENTO
EM MEIO COMPLETO OU SUJEITO A AUSNCIA DE AZOTO ......................................................................104
4.2.3 4.2.4 4.2.5 4.2.6
DETECO DE RUBISCO EM RAZES DE PINUS PINEA ...............................................................106 PURIFICAO DE CLOROPLASTOS ..........................................................................................106 PREPARAO DE LMINAS PARA MICROSCOPIA DE IMUNOFLUORESCNCIA .............................108 SELECO DE LINHAS DE ARABIDOPSIS THALIANA COM INSERO DE T-DNA NO LOCUS
AT3G14067 .....................................................................................................................................111
4.3
4.3.1
RESULTADOS E DISCUSSO ....................................................................................113

META-ANLISE DA EXPRESSO EM ARABIDOPSIS THALIANA DOS GENES ANOTADOS COMO
PROTEASE E DOS GENES RBCL E RBCS..........................................................................................113 4.3.2 4.3.3

AZOTO
DETECO DE RUBISCO EM RAZES DE PINUS PINEA ...............................................................127 AVALIAO DO TEOR DE SBT_TRITICUM E DE LSU EM FOLHAS DE TRIGO SUJEITO A AUSNCIA DE ............................................................................................................................................128 DETERMINAO DA LOCALIZAO CELULAR DA PROTEASE DE SUBTILISINA, SBT_TRITICUM ...136 AVALIAO DE PLANTAS DE ARABIDOPSIS THALIANA COM INSERO DE T-DNA NO LOCUS
4.3.4 4.3.5
AT3G14067 CODIFICANTE PARA A SUBTILISINA ..................................................................................147
5 6 7
DISCUSSO GERAL ..............................................................................................155 CONCLUSES........................................................................................................165 PERSPECTIVAS FUTURAS ...................................................................................167
iii
BIBLIOGRAFIA....................................................................................................... 169
ANEXO I: Lista dos primers utilizados neste trabalho ................................................................. 189 ANEXO II: Sequncia do cDNA dos polipptidos recombinantes ................................................. 193 ANEXO III: Correlao de Pearson entre os transcritos de RbcS e de cada uma das proteases analisadas de A. thaliana....................................................................................................... 195 ANEXO IV: Intensidade de transcrio dos loci seleccionados de A. thaliana.............................. 201 ANEXO V: Determinaes efectuadas nas amostras de folhas de trigo com crescimento em meio completo ou em meio sem azoto........................................................................................... 203
iv
ndice de figuras
Fig. 3.1 Purificao da rubisco nativa e da rubisco oxidada por cromatografia de troca aninica na coluna Resource Q. ..............................................................................45 Fig. 3.2 Esquema da purificao da protease de subtilisina, SBT_Triticum. ....................60 Fig. 3.3 Perfil da protelise da 3H-rubisco oxidada, em extractos de folhas de trigo em stresse, fraccionados, em FPLC, por cromatografia de troca catinica na coluna Resource S. .............................................................................................................61 Fig. 3.4 Anlise electrofortica em SDS-PAGE (12,5% (m/v) acrilamida) das fraces recolhidas na coluna Resource Q do FPLC, correspondentes ao pico A (A) e ao pico B (B).........................................................................................................................62 Fig. 3.5 Anlise electrofortica em gel de agarose 1% (m/v) do PCR que originou a sequncia 1..............................................................................................................65 Fig. 3.6 Montagem das sequncias parciais do cDNA que codifica a protease de subtilisina, SBT_Triticum..........................................................................................66 Fig. 3.7 Sequncia parcial para o cDNA da protease de subtilisina, SBT_Triticum (EU431190)..............................................................................................................67 Fig. 3.8 Clculo do teor em G+C para o cDNA de Sbt_Triticum, RbcL_Triticum e RbcS_Triticum. ........................................................................................................68 Fig. 3.9 Modelos da estrutura secundria do mRNA de Sbt_Triticum, RbcL_Triticum e RbcS_Triticum. ........................................................................................................70 Fig. 3.10 rvore da distncia entre as subtilisinas semelhantes a SBT_Triticum. ............72 Fig. 3.11 Alinhamento das sequncias de resduos de aminocidos das subtilisinas dos grupos 1 e 2 (ver Fig. 3.10). .....................................................................................75 Fig. 3.12 Estudo de expresso de protenas recombinantes em E. coli ...........................78 Fig. 3.13 Purificao na coluna de afinidade dos polipptidos recombinantes produzidos em E. coli. ................................................................................................................79 Fig. 3.14 Determinao do ttulo dos anticorpos anti-LSU e anti-SSU, produzidos em coelhos ....................................................................................................................80 Fig. 3.15 Determinao do ttulo dos anticorpos anti-SBT_Triticum e anti-SBT_AT, produzidos em ratos.................................................................................................81 Fig. 3.16 "Immunoblotting" do extracto total de bactrias recombinantes para o polipptido T1800 (SBT_Triticum) revelado com anticorpos anti-SBT_Triticum. ........................82
Fig. 3.17 Actividade proteoltica da protease, SBT_Triticum, contra a forma nativa e oxidada da 3H-rubisco.............................................................................................. 83 Fig. 3.18 Anlise bidimensional da subtilisina, SBT_Triticum. ......................................... 85 Fig. 3.19 Reconhecimento da protease de subtilisina, presente no pico A e no pico B, pelos anticorpos produzidos. ................................................................................... 86 Fig. 3.20 Reconhecimento, pelo anticorpo anti-SBT_Triticum, de polipptidos presentes em extractos de protena solvel de folhas de trigo sujeito a stresse....................... 89 Fig. 3.21 Determinao da massa molecular da subtilisina (A e B), em condies no desnaturantes, por filtrao em gel.......................................................................... 90 Fig. 3.22 Immunoblot do fraccionamento da protease SBT_Triticum por nova filtrao em gel na coluna Superose 12. ............................................................................... 91 Fig. 3.23 Efeito do tratamento da protease com fosfatase cida de batata, na sua actividade proteoltica para a rubisco oxidada. ........................................................ 93 Fig. 4.1 Relao entre a expresso dos genes de RbcS e RbcL (A), e entre a expresso dos genes RbcS e SAG12 (B), em A. thaliana....................................................... 102 Fig. 4.2 Observao de cloroplastos purificados em microscpio ptico. ...................... 107 Fig. 4.3 Espectro de fluorescncia dos vrios fluorforos e filtros utilizados.................. 109 Fig. 4.4 Imagem do programa SeqViewer (TAIR) da cadeia complementar do cromossoma 3, mostrando o gene AT3G14067.1.................................................. 112 Fig. 4.5 Esquema do mtodo utilizado para a seleco de proteases. .......................... 114 Fig. 4.6 Distribuio do coeficiente de correlao de Pearson (r2 Log2(n)) entre os nveis de transcritos de RbcS e de cada um dos loci anotados como protease, em A. thaliana.................................................................................................................. 116 Fig. 4.7 Meta-anlise, por anatomia, dos 52 loci que apresentam uma correlao de Pearson (Log2(n)) com o transcrito de RbcS superior a 0,3. .................................. 118 Fig. 4.8 Agrupamento dos 14 transcritos presentes nos tecidos fotossintticos, induzidos nas folhas da inflorescncia e nas folhas senescentes.......................................... 120 Fig. 4.9 Variao do sinal dos 14 transcritos seleccionados entre as folhas da roseta senescentes e as folhas da roseta no senescentes. ............................................ 122 Fig. 4.10 Relao entre a expresso do transcrito da subtilisina SBT_AT e da protease de cistena RD21-A em folhas de A. thaliana.............................................................. 125 Fig. 4.11 Correlao entre os transcritos de RbcS e de Sbt_AT em folhas de A. thaliana. .............................................................................................................................. 126
vi
Fig. 4.12 Deteco de LSU em razes de pinheiro manso..............................................127 Fig. 4.13 Plantas de trigo com 27 dias de idade, com crescimento em meio completo (I) ou com crescimento em meio sem azoto durante os ltimos 15 dias (II)................129 Fig. 4.14 Protena total solvel (mg.g-1 p.f.) determinada em cada parte da folha n 2 e da folha n 3 ao longo do perodo experimental. .........................................................131 Fig. 4.15 Protena total solvel (mg.g-1 p.f.) determinada para a folha inteira.................132 Fig. 4.16 Avaliao do teor de SBT_Triticum e de rubisco em folhas de trigo com crescimento em meio completo ou em meio sem azoto. ........................................135 Fig. 4.17 Imunofluorescncia de cortes de folhas de trigo incubados com soro pr-imune de rato e com soro pr-imune de coelho. ...............................................................138 Fig. 4.18 Aspecto geral dos cortes de folhas de trigo com crescimento em meio completo (A) ou em meio sem azoto (B)................................................................................140 Fig. 4.19 Imunofluorescncia de cortes de folha de trigo com crescimento em meio completo. Visualizao de protuberncias nos cloroplastos e provavelmente, de um estrmulo. ..............................................................................................................141 Fig. 4.20 Imunofluorescncia de cortes de folha de trigo com crescimento em meio completo. Possvel marcao de SBT_Triticum perto da parede celular. ...............142 Fig. 4.21 Imunofluorescncia de cortes de folha de trigo com crescimento em meio sem azoto. Possvel marcao de SBT_Triticum perto da parede celular......................143 Fig. 4.22 Imunofluorescncia de cortes de folha de trigo. Possvel marcao de SBT_Triticum na vizinhana dos cloroplastos. .......................................................144 Fig. 4.23 Imunofluorescncia de cortes de folha de trigo com crescimento em meio sem azoto. Possvel marcao em vesculas associadas senescncia SAV. .............145 Fig. 4.24 Imunofluorescncia de cortes de folha de trigo com crescimento em meio completo. Possvel marcao em vesculas associadas senescncia SAV.........146 Fig. 4.25 Electroforese em gel de agarose dos produtos de PCR das famlias A1, A2 e A3. .........................................................................................................................148 Fig. 4.26 Electroforese em gel de agarose dos produtos de PCR da famlia B1. ...........150 Fig. 4.27 Germinao das sementes de A. thaliana em meio selectivo, contendo canamicina.............................................................................................................150 Fig. 4.28 Aspecto geral de plantas de A. thaliana com 35 dias de idade........................152 Fig. 4.29 immunoblots do extracto de protena total de vrias plantas de A. thaliana revelado com os anticorpos anti-SBT_AT e anti-LSU.............................................153
vii
Fig. 5.1 Modelo proposto para a degradao da rubisco ............................................... 162
viii
ndice de tabelas
Tabela 1 Caractersticas de algumas subtilisinas.............................................................16 Tabela 2 Primers e tamanho esperado dos polipptidos recombinantes. ......................55 Tabela 3 Seleco de experincias de microarray por anatomia .................................100 Tabela 4 Descrio das amostras de folhas recolhidas. ................................................104 Tabela 4-5 Percentagem de plantas sobreviventes em meio com canamicina depois de terem germinado. ...................................................................................................151
ix
Agradecimentos
Quero agradecer a tod@s os que me acompanharam ao longo destes anos. Ao Professor Ricardo Ferreira agradeo o apoio e a oportunidade que me deu de trabalhar em cincia e a ousadia de explorar o desconhecido. Professora Sara Amncio agradeo o apoio, uso do laboratrio, equipamento e mesmo de alguns reagentes. Agradeo Professora Lusa Falco a cedncia das instalaes zootcnicas para coelhos e o apoio do Sr. Jos Antnio na manuteno, execuo das injeces e colheita do soro de coelhos. Engenheira Belmira Carrapio, do biotrio da Faculdade de Medicina Veterinria (UTL), agradeo a forma profissional como apoiou a produo dos anticorpos policlonais em rato. Professora Wanda Viegas e Leonor Morais agradeo a possibilidade de utilizar o equipamento de microscopia. Teresa Ribeiro por me ajudar e esclarecer na preparao de amostras e sua visualizao em microscopia de epifluorescncia. Augusta Baro agradeo o ensino da manufacturao de cortes de folhas de trigo, para visualizao em microscopia. Ao professor Jorge Almeida pelo ensino da numerao de plantas com pedrigree. professora Gloria Esquvel agradeo os primeiros e rigorosos ensinamentos das tcnicas laboratoriais quando iniciei o estudo cientfico, agradeo tambm as conversas sobre a rubisco e o uso dos anticorpos por ela produzidos. Agradeo tambm aos amigos do Lab pela ajuda, pacincia e companhia, Regina, Sara, Lusa, Joo, Alxis, Slvia, Lus, Sofia, Ana Cristina, Maria Jos e Maria Joo. Agradeo tambm ao Departamento de Botnica e ao ISA por tornarem este trabalho realizvel. Agradeo minha me a grande confiana que me transmite e me permite continuar. minha filha, a quem espero conseguir apoiar. xi
Ao Alexandre agradeo a pacincia de me aturar nos momentos impossveis. E, tambm, minha famlia e amigos: Lusa, Joo, Pedrocas, Joozinho, Tia T, Pai, Av, Av, Quim, So, Filipe, Pedro, Renata, Sofia, Teresinha, Joo, Julieta, Pandora, Diogo, Xana, Goulo, Spread, Pompeu, Ins e Quiqui...
Agradeo tambm o apoio da FCT (SFRH/BD/8974/2002) que pagou quase todas as propinas deste doutoramento e me dotou de um subsdio de manuteno mensal, em co-financiamento do FSE e do POCI 2010:
A tod@s muito obrigada, Joana
xii
UNIO EUROPEIA Fundo social Europeu
Resumo
Foi identificada, caracterizada e isolada de folhas de trigo uma subtilisina que tem a capacidade de degradar, in vitro, a ribulose bisfosfato carboxilase (EC4.1.1.39; rubisco), exibindo uma maior afinidade para a forma oxidada da enzima. A auto-degradao da subtilisina confirma a presena da forma activa e detectada em condies de ausncia de azoto, correlacionando-se com a degradao da rubisco. A degradao da rubisco foi detectada, simultaneamente, na parte basal e terminal da folha de trigo em stresse de ausncia de azoto, dissociando-se do progresso da senescncia, onde a degradao da rubisco no foi detectada na parte basal. Os resultados obtidos sugerem que a subtilisina se localiza na vizinhana dos cloroplastos, provavelmente dentro de vesculas. As subtilisinas das plantas so proteases abundantes que actuam sobre diversos substratos. No entanto, a sua expresso induzida em determinadas fases de desenvolvimento, onde apresentam funes fisiolgicas especficas. Condies de stresse ou de senescncia promovem a formao de numerosas vesculas que contm outras proteases. A anlise do transcriptoma de Arabidopsis thaliana demonstra que esta subtilisina expressa preferencialmente nas folhas, com aumento de expresso durante a senescncia. A protease de cistena, RD21A correlaciona-se com a protease de subtilisina em estudo, evidenciando que ambas as proteases devem ter um papel importante na degradao de rubisco. Os resultados sugerem que a degradao da rubisco pode ocorrer fora dos cloroplastos, nas vesculas associadas senescncia.
PALAVRAS-CHAVE: degradao, rubisco, senescncia, stresse, subtilisina.
xiii
xiv
TTULO DA TESE: Characterization of the subtilisin correlated with rubisco proteolysis
Abstract
A subtilisin was identified, characterized and isolated from wheat leaves. In vitro, it has the ability to degrade ribulose bisphosphate carboxylase (EC4.1.1.39; rubisco), showing enhanced proteolytic activity towards the oxidized form of the enzyme. During nitrogen starvation, the presence of the active form is confirmed by detection of its autocatalytic products, which are correlated with rubisco degradation. Rubisco proteolysis is detected in both the basal and the tip segments of the stressed wheat leaf blade, which indicates independence from senescence progression. This subtilisin is located in the vicinity of chloroplasts, probably inside vesicles. Plant subtilisins are abundant proteases that exhibit broad substrate specificity. However, they may be induced in particular developmental stages, where they perform specific tasks. Stress conditions or senescence can lead to the formation of numerous vesicles-containing proteases. Analysis of Arabidopsis thaliana transcriptome reveals that the subtilisin under study is preferentially expressed in leaves, and its expression is enhanced during senescence. The cysteine protease RD21A correlates with this subtilisin, both at transcriptional level and cellular localization, suggesting that both proteases participate in rubisco degradation. The results suggest that the degradation of rubisco may occur outside the chloroplasts in the senescence associated vesicles.
KEY-WORDS: proteolysis, rubisco, senescence, stress, subtilisin.
xv
xvi
Abreviaturas
ATH1:22k BCIP bp BSA CBB-R Clp CTAB DAPI DK-MTP-1-P DNA dNTP DPM DTT EBI EDTA Em Ex FEN FPLC FtsH GFP GSH GSSG Hepes IgG IPTG LB, meio LSU LTP ME Affymetrix ATH1 GeneChip probe array Fosfato de 5-bromo-4-cloroindoxilo Pares de bases Albumina de soro bovino Coomassie Brilliant Blue R-250 Casein lytic proteinase Brometo de cetiltrimetilamnio Di-hidrocloreto-4,6-diamina-2-fenilindole 2,3-diceto-5-metiltiopentil-1-fosfato cido desoxirribonucleico Mistura equilibrada de desoxinucletidos (dA, dT, dC, dG) trisfosfatados Desintegraes por minuto Ditiotreitol European Bioinformatics Institut cido etilenodiaminatetractico Comprimento de onda de emisso Comprimento de onda de excitao 1,10- Fenantrolina Fast protein liquid chromatography Filamentous temperature sensitive H peptidase Green fluorescent protein Glutationa reduzida Glutationa oxidada cido N-2-hidroxietil-piperazina-N-2-etanossulfnico Imunoglobulina G Isopropil--D-tiogalactopiransido Meio Luria-Broth, utilizado no crescimento de bactrias Subunidade grande da rubisco Lipid transfer protein 2-mercaptoetanol
xvii
MS, Meio Mt1 Mt2 Mt3 NASC NBT NCBI NEM Nt p. f. PBS
Meio de Murashige e Skoog Polimorfismo SALK_063823 Polimorfismo SALK_054778.56.00.x Polimorfismo SALK_022941.10.65.x The European Arabidopsis Stock Centre Azul de tetrazlio National Center for Biotecnhology Information N-Etilmaleimida Nucletidos Peso fresco Soluo tampo Phosphate Buffer Saline 1,5 mM KH2PO4, 8,1 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,01% (m/v) NaN3 Soluo tampo de PBS contendo Tween 20 a 0,05% (v/v; T0,05%) ou 0,1% (v/v; T-0,1%)
PBS_T
PCR PFA PMSF Primer PSA PSII PTOX PVDF RbcL RbcS RCB RLP RNA rpm Rubisco RuBP SAIS SAV
Polymerase Chain Reaction p-Formaldedo Fluoreto de fenilmetilsulfonilo Oligonucletido para iniciar uma reaco de PCR Persulfato de amnio Fotossistema II Plastid terminal oxidase Difluoreto de polivinilideno Gene que codifica a subunidade grande da rubisco Gene que codifica a subunidade pequena da rubisco Rubisco containing Bodies Rubisco Like Protein cido ribonucleico Rotaes por minuto Ribulose bisfosfato carboxilase / oxigenase (EC 4.1.1.39)
D-ribulose-1,5-bisfosfato
Soluo de sais composta por 10 mM Na2HPO4, 1 M NaCl e 0,5% (v/v) Tween 20 Senescence associated vesicle
xviii
SBM SBT_AT SBT_Triticum SDS SDS-PAGE SIGnAL SSU Ta TAIR Taq polimerase TCA TEMED TPCK Tris Tween
Tampo de amostra para electroforese SDS-PAGE Protease do tipo subtilisina de Arabidopsis thaliana codificada no locus AT3G14067 Protease do tipo subtilisina de Triticum aestivum Sulfato dodecilo de sdio Electroforese desnaturante em gel de poliacrilamida Salk Institute Genomic Analysis Laboratory Subunidade pequena da rubisco Temperatura de emparelhamento numa reaco de PCR The Arabidopsis Information Resource Enzima de DNA polimerase de Thermophilus aquaticus cido tricloroactico N, N, N, N, -tetrametilenodiamina N--Tosil-L-fenilalanina clorometilcetona Tris(hidroximetil)aminometano Monolaurato de polioxilenossorbitano
xix
1 INTRODUO
A ribulose bisfosfato carboxilase / oxigenase (rubisco; E.C. 4.1.1.39) a protena mais abundante da Terra. A sua principal funo a fixao de CO2 na ribulose-1,5-bisfosfato (RuBP), podendo tambm fixar oxignio na reaco que constitui o primeiro passo da fotorrespirao; outras funes tm-lhe sido atribudas, como a de protena de reserva (para uma perspectiva histrica consultar o jornal Photosynthetic Research vol: 73, 2002). A rubisco uma das protenas responsveis por todo o carbono orgnico existente na planta e, sozinha, pode constituir entre 25% a 60% da protena total solvel numa folha de uma planta em C3 e 8 a 23% numa folha de uma planta em C4 (Ku et al., 1979). Recentemente, foi demonstrado o aumento da eficincia do uso de carbono originado pela actividade da rubisco, numa actividade independente do ciclo de Calvin e durante a formao de lpidos, no desenvolvimento do embrio em Brassica napus (Schwender et al., 2004). A sua presena foi recentemente detectada em razes de arroz (Koller et al., 2002), de Arabidopsis thaliana (Mooney et al., 2006) e de trigo (Song et al., 2007), sugerindo que a sua influncia no metabolismo celular poder no se reduzir aos papis que desempenha no ciclo de Calvin e na fotorrespirao. A rubisco das plantas, e de grande parte dos procariotas autotrficos, constituda por oito subunidades grandes (LSU Mr entre 50 e 60), que contm o centro cataltico, e por oito subunidades pequenas (SSU Mr entre 12 e 20), formando uma estrutura quaternria hexadecamrica (Mr 550) do tipo L8S8, designada por forma I da enzima (Knight et al., 1990). A LSU est codificada no genoma do cloroplasto e a SSU est codificada no genoma nuclear (Barraclough e Ellis, 1979). A rubisco uma das protenas mais estudadas das plantas, a sua sntese e actividade so conhecidas com algum detalhe, mas permanecem lacunas importantes no conhecimento do seu catabolismo, desconhecendo-se, com rigor, quais as enzimas ou mecanismos responsveis pela sua degradao e o local onde esta ocorre. Trabalhos efectuados pelo nosso grupo de investigao conduziram ao isolamento de uma protease do tipo subtilisina que degrada, in
Caracterizao da subtilisina relacionada com a degradao da ribulose bisfosfato carboxilase de plantas
vitro, a rubisco (Albuquerque et al., 2001; Albuquerque, 2002). Neste trabalho pretendeu-se esclarecer a identidade e caracterizar esta subtilisina, relacionandoa com a degradao in vivo da rubisco.
1.1 Degradao da rubisco

Em condies metablicas normais, o padro de degradao da rubisco parece depender das espcies consideradas (Esquvel et al., 1998). Por exemplo, em plantas de Lemna minor, a enzima parece no sofrer degradao enquanto est a ser sintetizada (Ferreira e Davies, 1987a; 1987b), mas em plantas de trigo, milho e sorgo parece estar sujeita a uma degradao contnua e com diferentes taxas em cada uma das espcies (Simpson et al., 1981; Esquvel et al., 1998). A rubisco rapidamente degradada durante a senescncia natural (Feller et al., 2007). A senescncia um tipo de morte celular programada que pode, at certo ponto, ser reversvel ou atenuada (Gan e Amasino, 1997). O silenciamento individual de alguns genes envolvidos na senescncia, nomeadamente aqueles que promovem a degradao dos constituintes celulares, no bloqueia o processo de senescncia, sugerindo a existncia de vrios processos alternativos. Por exemplo, o mutante de A. thaliana homozigtico sag12, que no forma a protease de cistena especificamente expressa durante a senescncia (Lohman et al., 1994), no apresenta nenhuma alterao fenotpica detectvel durante a senescncia (Otegui et al., 2005). A imposio de certos tipos de stresse induz a oxidao e/ou a degradao da rubisco. Ferreira e Teixeira (1992) agruparam as situaes de stresse em quatro categorias, de acordo como seu efeito na rubisco: (i) Situaes de stresse que no provocam a degradao da enzima nem a modificam quimicamente (e. g. ausncia de azoto, fsforo, potssio, magnsio ou ferro em L. minor). (ii) Situaes de stresse que no causam a degradao da enzima, mas convertem-na a uma forma oxidada e cataliticamente inactiva (rubisco oxidada). A exposio prolongada a este tipo de stresse conduz a um maior grau de oxidao e a uma polimerizao covalente das subunidades da rubisco, com o aparecimento de agregados de massa 2
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molecular elevada (rubisco polimerizada); durante este processo, acumula-se um polipptido com 65 kDa (P65), formado pela ligao covalente de uma subunidade grande a uma subunidade pequena; estas alteraes estruturais so acompanhadas por uma reduo gradual no nmero de grupos -SH livres (Ferreira e Davies, 1989; Ferreira e Shaw, 1989; Ferreira et al., 1996). A dimerizao covalente, no-enzimtica e no-dissulfdrica das subunidades de rubisco, seguida da formao de agregados de massa molecular elevada, foi descrita para algumas espcies de plantas tratadas com radiao ultravioleta, sabendo-se hoje que ocorre numa variedade de situaes biolgicas (Wilson et al., 1995; Ferreira et al., 1996; Wilson e Greenberg, 1999), tais como a radiao ultravioleta, o choque osmtico, a ausncia de clcio e, aparentemente, todas as situaes que afectam a integridade das membranas em L. minor (Franco et al., 1992) e, tambm, stresse por ozono em folhas de choupo (Landry e Pell, 1993). (iii) Situaes de stresse que provocam a degradao da enzima, conduzindo morte das plantas (e. g. ausncia total de nutrientes, luz ou no escuro, em L. minor, senescncia natural ou induzida em cereais (Peterson e Huffaker, 1975; Wittenbach, 1978; , 1979). (iv) Situaes de stresse que provocam a degradao da enzima, mas no conduzem morte das plantas (e. g. ausncia de azoto em trigo, milho e sorgo, ausncia de enxofre em L. minor, trigo, milho e sorgo (Esquvel et al., 2000)).
1.1.1 Inibio da degradao e susceptibilizao degradao

Ao centro activo da rubisco podem ligar-se alguns steres fosfricos de acares que inibem a sua actividade cataltica, bem como o prprio substrato quando se liga ao centro activo no carbamilado (comportando-se,nestas condies, como inibidor; (Jordan e Chollet, 1983) ou a xilulose-1,5-bisfosfato (McCurry e Tolbert, 1977). Outro ster que tambm se liga ao centro activo o 2carboxi-D-arabinitol-1-fosfato (CA1P), sintetizado durante a noite. Contudo, o
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CA1P, liga-se aos centros activos carbamilados e s est presente em algumas espcies de plantas (Vu et al., 1984; Seemann et al., 1985; Salvucci, 1989). A ligao do CA1P ao centro activo da rubisco protege-a contra a degradao por proteases exgenas; o mesmo acontece com a RuBP (Chen e Spreitzer, 1991; Houtz e Mulligan, 1991; Khan et al., 1999). A proteco da degradao da rubisco causada por espcies reactivas de oxignio (ROS) tambm, foi observada quando ocorreu a incubao prvia da enzima com RuBP ou CABP (2-carboxi-Darabinitol-1,5-bisfosfato) (Ishida et al., 1999). Este processo de controlo da degradao poder estabelecer uma relao directa entre a quantidade de acar disponvel e a quantidade de rubisco no cloroplasto. Modificaes ps-traduo da LSU em algumas espcies, como a trimetilao da lisina 14 em tabaco, dificultam a degradao da enzima por proteases exgenas, como a tripsina (Houtz et al., 1989). Esta lisina desempanha um papel fulcral relativamente a um primeiro corte da rubisco por proteases, como mais adiante se comentar. A ligao de steres fosfricos de acares ao centro activo da rubisco induz uma conformao da enzima que a torna menos susceptvel oxidao e protelise. Moreno e colaboradores tm estudado a influncia dos resduos de cistena na estrutura, actividade e susceptibilidade protelise da rubisco. Estes investigadores sugeriram a hiptese de que a oxidao da rubisco seria controlada pelo estado redox do cloroplasto, nomeadamente pelo par cisteamina/cistamina (CSH/CSSC), que determinaria o estado de oxidao de resduos crticos de cistena (Garcia-Ferris e Moreno, 1993; Moreno et al., 1995). Um dos resduos crticos identificados a cistena 172 de Chlamydomonas reinhardtii (Moreno e Spreitzer, 1999); estudos em outros resduos de cistena revelaram que so locais de destabilizao da enzima e a cistena 172 aparece como o que confere maior potencial de regulao do estado de oxidao da enzima, visto que a sua troca por um resduo de serina confere a maior proteco contra a protelise in vivo (Moreno et al., 2008). Marn-Navarro e Moreno (2003) efectuaram estudos, in vitro, sobre a protelise da rubisco de C. reinhardtii por aco de uma subtilisina externa e identificaram dois tipos de fragmentos (bandas I e II) da LSU, ambos produzidos a 4
Introduo
partir da holoenzima. A banda I, com 53 kDa, produzida pela degradao da extremidade N-terminal at ao resduo de lisina 18 e a banda II, com 47 kDa, originada exclusivamente aps oxidao da enzima, sendo produzida por degradao at um loop conservado formado entre a serina 61 e a treonina 68. a oxidao da enzima e uma consequente modificao estrutural que permitem o acesso da protease a este loop. Aps o corte, a enzima dissocia-se nas suas subunidades, ocorrendo ento a sua degradao total. A banda II , tambm, formada in vivo, aps a aplicao de um stresse salino, onde se observa a formao de agregados de massa molecular elevada associados,
maioritariamente, fraco membranosa. A induo de um stresse fortemente oxidativo, como a aplicao directa de H2O2, origina produtos de degradao da enzima diferentes, com o aparecimento de produtos de degradao menores: 44, 42, 37 (predominante) e 28 kDa (Esquvel et al., 2006). A susceptibilizao da degradao da rubisco por oxidao foi tambm estudada por outros autores (Albuquerque et al., 2001; Marcus et al., 2003). Existem, tambm, outras modificaes que causam perda de actividade da rubisco e a tornam mais susceptvel degradao, como a glicosilao da enzima (Yamauchi et al., 2002). Metha et al. (1992) observaram a oxidao da rubisco, em plantas de Spirodela oligorrhiza e de trigo, induzidas a senescer pela imposio de um stresse oxidativo causado pelo io Cu2+, tendo detectado a formao de um entrecruzamento por pontes de enxofre (S-S) entre as LSU da holoenzima e a sua translocao especfica para as membranas do cloroplasto, processo este que culmina com a degradao da enzima. A formao de agregados de massa molecular elevada (rubisco polimerizada) foi observada em condies de stresse prolongado (Franco et al., 1992). Estes agregados so principalmente detectados na fraco membranar (Marin-Navarro e Moreno, 2006). A rubisco foi tambm detectada no envelope dos cloroplastos, aps a sua purificao e revelao do proteoma por espectrometria de massa; no entanto, estes autores admitem a hiptese de contaminao, mas afirmam que pode ser um processo de ocorrncia natural em condies in vivo (Ferro et al., 2003).
1.1.2 Degradao cloroplstica da rubisco

Actividade proteoltica contra a rubisco e os seus produtos de degradao foi detectada em folhas submetidas a vrias condies ambientais e em extractos de vacolos ou de cloroplastos. Um padro de degradao especfico para cada local de catabolismo (vacolos ou cloroplastos) difcil de determinar. No entanto, um fragmento de 37 kDa parece caracterstico da ocorrncia de degradao nos cloroplastos causada por espcies reactivas de oxignio (ROS). A degradao nos cloroplastos por ROS foi observada por Ishida et al. (1999), originando um fragmento predominante com 37 kDa. A degradao por ROS (induzidos por FeSO4 ou H2O2) origina diferentes fragmentos (45, 43, 40, 37, 33, 30,5 e 20 kDa, os maiores), que resultam de diferentes locais de corte na enzima e no de uma degradao sequencial. Estes locais esto localizados prximo do centro activo da enzima, sendo a degradao evitada por activao do centro activo e subsequente ligao de CABP, ou pela enzima catalase, mas no pela enzima superxido dismutase (Luo et al., 2002). Nakano et al. (2006) observaram o mesmo padro de degradao ao incubarem discos foliares de Cucumis sativus a luz elevada e frio e observaram inibio da degradao pelo uso de sequestradores fortes de ROS (n-propilgalato, para o radical hidroxilo, e cido 1,2-di-hidroxibenzeno-3,5-dissulfnico, para o radical superxido). Padres semelhantes degradao da rubisco por espcies reactivas de oxignio foram, tambm, observados por outros autores (Casano et al., 1994; Desimone et al., 1996; Desimone et al., 1998; Roulin e Feller, 1998; Carvalho et al., 2005; Esquvel et al., 2006). As espcies reactivas de oxignio tm sido implicadas em diversos processos celulares, como reaces de hipersensibilidade, que conduzem morte das clulas, e tambm durante a senescncia natural (Gechev et al., 2006; Van Breusegem e Dat, 2006). No entanto, a sua funo no est completamente esclarecida. As plantas de tabaco que no expressam o gene cloroplstico ndhF, uma NADH desidrogenase, apresentam um atraso de 30 dias no desenvolvimento da senescncia (Zapata et al., 2005). Esta protena integra o complexo NADH desidrogenase presente nas membranas dos tilacides. Este complexo poder
Introduo
estar envolvido na reduo da plastoquinona, sem envolvimento do fotossistema II (PSII), num processo no-fotoqumico, dependente de uma cadeia de electres, denominado clororrespirao. A plastoquinona reduzida poder ser oxidada pelo complexo citocromo b6/f (via comum fotossntese) ou ser oxidada pela oxidase terminal do plastdeo, PTOX, conduzindo ao consumo de O2 e formao de um gradiente de protes no lmen dos tilacides (Bennoun, 1982; Peltier e Cournac, 2002). Outros produtos derivados da actividade deste complexo so a formao de espcies reactivas de oxignio (Friedrich et al., 1995; Casano et al., 2000), sugerindo-se que o atraso na senescncia, observado no mutante de tabaco sem ndhF, se deve diminuio da produo de superxido (Zapata et al., 2005). Outros produtos de degradao da rubisco so detectados em cloroplastos isolados ou aps a incubao da enzima com extractos dos cloroplastos, como o fragmento de 44 kDa originado pelo corte entre a fenilalanina 40 e a arginina 41 de trigo (Kokubun et al., 2002). Zhang et al. (2007) observaram, em lisados de cloroplastos de trigo sujeitos a escurido, a formao de um fragmento da LSU com 51 kDa, produzido pelo corte na lisina 14 (Banda I; (Marin-Navarro e Moreno, 2003). A produo deste corte foi detectada, para valores de pH de 7,5, 8,0 e 8,5, por uma enzima do tipo serina que usa um metal como cofactor. Recentemente, Sakamoto (2006) fez uma reviso das proteases existentes nos plastdeos, uma das quais o complexo Clp (casein litic protease) com algumas subunidades homlogas em E. coli. A sua actividade dependente do consumo de ATP e o complexo constitudo por subunidades proteolticas do tipo serina e por subunidades reguladoras. Este complexo tem uma massa de 325 a 350 kDa, est localizado no estroma dos cloroplastos e a sua estrutura central formada por cinco subunidades que tm actividade cataltica, ClpP1, ClpP3, ClpP4, ClpP5, ClpP6, e por quatro subunidades sem actividade cataltica, ClpR1, ClpR2, ClpR3, ClpR4. Esta estrutura nuclear pode ainda associar-se a outras subunidades, como sendo o ClpS1, o ClpS2 ou outras (Peltier et al., 2004a). A composio deste complexo apresenta-se semelhante em tipos diferentes de plastdios e a expresso destes genes parece ser constitutiva, com pequenas alteraes durante situaes de stresse especficas ou durante a senescncia (Shanklin et al., 1995; Crafts-Brandner et al., 1996; Nakabayashi et al., 1999). 7
Peltier et al. (2004a) sugerem que a regulao da protelise por este complexo efectuada por mecanismos de reconhecimento dos substratos e por regulao da interaco do substrato com molculas do tipo "chaperone" e destas com o complexo (ClpS, ClpC entre outras), mas no por alterao da composio das suas subunidades (Sakamoto, 2006). Em linhas antisense clpP6 de A. thaliana, observou-se que este gene est envolvido no desenvolvimento correcto do cloroplasto, especialmente durante a fase juvenil das folhas; nos casos em que se detecta o fentipo (nas folhas interiores da roseta), observa-se um contedo menor de protenas essenciais ao desenvolvimento do cloroplasto, como a protena D1, a 1-ATPase, a LHCII, a PsaL e a LSU, desconhecendo-se se so o resultado de uma menor taxa de transcrio. Outras protenas tm o seu contedo aumentado, como a frutose-bisfosfato aldolase e a ribose-5-fosfato isomerase, entre outras. Os autores sugerem que estas protenas so substratos deste complexo, que compreendem protenas constitutivas com funes de housekeeping (Sjogren et al., 2006). Um fentipo semelhante foi obtido para as linhas antisense da subunidade ClpP4 em Arabidopsis (Zheng et al., 2006). Por enquanto, no de excluir o possvel envolvimento deste complexo na degradao cloroplstica da rubisco. Outra enzima solvel, presente no nucleide dos cloroplastos, a enzima CND41, que se liga inespecificamente ao DNA e parece estar envolvida na regulao negativa da transcrio do DNA nos cloroplastos (Nakano et al., 1997). Alm do domnio de ligao ao DNA, esta enzima possui um domnio de protease asprtica e capaz de degradar a rubisco aps a sua desnaturao (Kato et al., 2004); in vivo, o seu processamento correlaciona-se com o decrscimo de rubisco (Kato et al., 2005).
1.1.3 Senescncia do cloroplasto

Durante a senescncia, os cloroplastos transformam-se gradualmente em gerontoplastos, perdendo a organizao interna das membranas dos tilacides, acompanhada da degradao da clorofila, degradao da rubisco, aumento de plastoglbulos e diminuio do seu tamanho, sugerindo que a compartimentao se mantm at aos ltimos estgios de senescncia (Peoples et al., 1980; 8
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Gepstein, 1988; Hashimoto et al., 1989; Matile, 2004). Estes processos ocorrem simultaneamente durante a senescncia e esto interligados, mas so independentes (Thomas e Stoddart, 1975; Akhtar et al., 1999). No existe um consenso quanto diminuio do nmero de cloroplastos por clula durante a senescncia, existindo alguns trabalhos em que a reduo do nmero de cloroplastos no foi detectada seno na fase final da senescncia (Martinoia et al., 1983; Mae et al., 1984; Wardley et al., 1984) e outros em que se observa uma diminuio do nmero de cloroplastos por clula, seguida de uma maior reduo na fase final da senescncia (Lamppa et al., 1980; Wittenbach et al., 1982; Kura-Hotta et al., 1990; Ono et al., 1995). Quando plantas de trigo cresceram com doses suficientes de nutrientes, a reduo do nmero e tamanho de cloroplastos foi substancialmente menor (Ono et al., 1995). Ford e Shibles (1988) acompanharam a reduo da funo dos cloroplastos, aps a expanso completa das folhas em vrias variedades de soja, e sugeriram a existncia de duas fases: a primeira fase, que decorre durante 37 dias aps a expanso completa das folhas, em que se observa a reduo da capacidade fotossinttica (e.g. reduo da clorofila, reduo da protena total) sem reduo do nmero de cloroplastos e a segunda fase, que decorre durante os ltimos 11 dias, em que se observa a reduo do nmero de cloroplastos. Inada et al. (1999) descreveram o processo de senescncia no coleptilo e na segunda folha de arroz observando o progresso longitudinal da senescncia, desde a ponta da folha at sua base, e sincronizado, numa seco transversal, segundo uma sequncia ordenada de eventos: (i) degradao do DNA do cloroplasto, (ii) diminuio do tamanho dos cloroplastos e degenerao da sua membrana interna e (iii) condensao e desorganizao do ncleo. Os gerontoplastos formados durante a senescncia podem rediferenciar-se, de novo, em cloroplastos, re-estruturando as membranas dos tilacides e sintetizando nova clorofila (Greening et al., 1982; Pyliotis et al., 1975; Huber e Newman, 1976). Zavaleta-Mancera et al. (1999) estudaram o processo em folhas senescentes na planta Nicotiana rustica, observando a diferenciao em gerontoplastos, com reduo do nmero de plastdeos ao longo da senescncia. Aps a decapitao das flores, detectaram o re-esverdeamento das folhas e a 9
rediferenciao dos gerontoplastos em cloroplastos, acelerada pela aplicao de citocinina (6-benzilaminopurina), observando a reorganizao das membranas internas dos cloroplastos mas, durante este processo, no detectaram nenhum aumento do nmero de plastdeos. A reduo do tamanho e a manuteno do nmero de cloroplastos por clula do mesfilo durante a senescncia tem sido utilizada como indcio de que a degradao da rubisco ocorre no interior dos cloroplastos. No entanto, pode pensar-se que, na primeira fase (reversvel), em que se observa a diminuio do tamanho dos cloroplastos com perda de capacidade fotossinttica, ocorre a mobilizao dos seus constituintes para o exterior dos cloroplastos, enquanto na segunda fase (irreversvel), os cloroplastos seriam absorvidos pelo vacolo maior ou transformar-se-iam, eles prprios, em vesculas de degradao. Os cloroplastos seriam assim degradados por processos de autofagia. Este tipo de processo foi recentemente demonstrado por Wada et al. (2009). Diferentes tipos de stresse causam diferentes fragmentos na degradao da rubisco, como o j referido stresse salino ou o stresse por H2O2 (Esquvel et al., 2006; Marin-Navarro e Moreno, 2006), o que parece indicar a existncia de vrias vias de degradao. Na degradao da rubisco em folhas inteiras ou aps incubao com extractos vacuolares so, muitas vezes, detectados fragmentos proteolticos com um tamanho ligeiramente inferior ao da LSU e maiores do que os fragmentos caractersticos da degradao por ROS, entre 55 e 41 kDa: fragmentos em extractos vacuolares (Thayer e Huffaker, 1984; Bhalla e Dalling, 1986; Yoshida e Minamikawa, 1996) e fragmentos em clulas inteiras (Cercos et al., 1992; Hildbrand et al., 1994; Hortensteiner e Feller, 2002; Feller et al., 2007; Thoenen et al., 2007); neste caso, a origem da degradao in vivo (cloroplasto ou vacolo) impossvel de determinar.
1.1.4 Degradao vacuolar

Nas clulas animais, a autofagia uma via de degradao normal que envolve o sequestro de pores citoplasmticas e de organitos numa membrana vacuolar denominada de autofagossoma. Estas vesculas fundem-se com os lisossomas e o material , ento, degradado (Munafo e Colombo, 2001). Nas 10
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plantas, os vacolos assumem esta funo. Nestes organitos, existe uma grande variedade de proteases (endo e exoproteases, amino e carboxipeptidases, metaloproteases, proteases asprticas, de cistena e de serina) com uma actividade ptima a pH cido (3 a 6), uma condio que ocorre nos vacolos in vivo, e que no so dependentes do consumo de energia (Callis, 1995; Vierstra, 1996). Neste caso, a selectividade de degradao faz-se por compartimentao celular, tendo sido demonstrado que os vacolos possuem capacidade para absorver e degradar protenas intracelulares (Canut et al., 1985). Os vacolos das plantas so organitos multifuncionais e desempenham funes centrais ao desenvolvimento celular. Partilham propriedades bsicas com os vacolos das algas e dos fungos e com os lisossomas dos animais. So compartimentos de degradao, funcionam como reservatrio de ies e metabolitos, incluindo pigmentos, e so cruciais em processos de desintoxicao e homeostasia celular. Esto envolvidos na resposta celular a factores ambientais e a factores biticos que provocam stresse. Nos rgos vegetativos, actuam em combinao com a parede celular na formao da turgescncia celular. Em sementes e tecidos de reserva especializados so locais de reserva, acumulando protenas e hidratos de carbono (Marty, 1999). Os vacolos podem ser definidos como compartimentos celulares que se formam como ltimo produto da via secretora1 (secretory pathway) (Marty, 1999). Nas clulas existem vrios tipos de vesculas, como os corpos proteicos (PB), os vacolos de armazenamento de protenas (PSV) e compartimentos prvacuolares (PVC), entre outras. Estas vesculas podem ou no ser integradas no vacolo maior, dependendo do desenvolvimento celular (Muntz, 2007). A natureza destes vacolos pode ser distinguida com base na presena das isoformas (, e ) da protena intrnseca do tonoplasto (TIP). Por exemplo, nos vacolos de degradao, s se encontra a aquaporina -TIP (Jauh et al., 1999). Em cultura de clulas em suspenso de tabaco, sujeitas a ausncia de sacarose, observou-se o aumento (3 a 7 vezes) na degradao inespecfica de protenas celulares com a
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Moreira Moreira, I. (1983). Histologia Vegetal. Lisboa, Didtica Editora. refere-se a tecidos secretrios e citando (...) distinguem a secreo intracelular, em que a eliminao das substncias segregadas se efectua em compartimentos limitados por membrana, da secreo extracelular, quando h descarga de substncias secretrias para o exterior da clula (...).
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formao de muitos autofagossomas. A degradao proteoltica nestes compartimentos foi inibida pelo E-64, inibidor de proteases de cistena, impedindo a importao dos autofagossomas para o vacolo central (Moriyasu e Ohsumi, 1996). O desenvolvimento de muitos vacolos associados senescncia (SAV) foi observado em folhas de A. thaliana e de soja durante a senescncia. Na planta transgnica com o gene artificial pr-SAG12:GFP (sequncia N-terminal da protease de cistena, SAG12, seguida da protena verde fluorescente (GFP)), a protena fluorescente foi detectada nos SAVs e a sua expresso foi detectada apenas nas clulas que contm os SAVs (Otegui et al., 2005). A selectividade deste modo de degradao faz-se pela seleco das molculas que vo ser integradas nesses vacolos (Marty, 1999). Toyooka et al. (2006) mostraram que a autofagia pode ser um processo selectivo. Estes autores introduziram, em clulas de tabaco, o gene artificial composto pelo citocromo b6/f mitocondrial seguido da protena vermelha fluorescente (RFP) e observaram a formao de agregados de massa molecular elevada. A RFP foi encontrada no lmen do vacolo maior quando as clulas se encontravam na fase estacionria de crescimento ou aps um stresse nutritivo (ausncia de sacarose, ausncia de azoto ou ausncia de fsforo). Ao sujeitarem as clulas a uma deficincia de azoto, observaram a formao de vrios autofagossomas e os agregados foram degradados de forma preferencial. De novo, a protelise foi inibida pelo inibidor de proteases de cistena, E-64, e a importao da RFP para o vacolo maior foi inibida. A formao de vesculas e de protuberncias na membrana do cloroplasto foi observada por Hatta et al. (1973), em estudos da fractura da membrana dos cloroplastos aps a congelao. A formao de vesculas de endocitose a partir da membrana interna dos cloroplastos em direco membrana dos tilacides foi detectada por vrios autores e pensa-se que constitui a forma de sntese destas membranas (Westphal et al., 2001). Identificaram-se algumas das protenas essenciais a este processo: uma metaloprotease da famlia da FtsH de Capsicum annuum (Hugueney et al., 1995), uma protena indutora de vesculas presente quer na membrana interna dos cloroplastos quer na membrana dos tilacides, 12
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VIPP1 (Kroll et al., 2001), uma diamina ADL1, protena essencial separao da recm formada vescula da restante membrana (Park et al., 1998), entre outras (Andersson e Sandelius, 2004). Protuberncias identificadas anteriormente em microscpio ptico por Wildman et al. (1962), e tambm por Laflche e Bov (1969), foram recentemente redescobertas e designadas por stromule. Os estrmulos so tubos que esto ligados ao cloroplasto e que contm estroma, aumentando a superfcie especfica dos cloroplastos. Os estrmulos so especficos dos tecidos celulares, esto presentes em maior nmero e tamanho em tecidos no fotossintticos e so regulados pelo desenvolvimento das plantas (Kohler e Hanson, 2000). Estudos em frutos de tomate revelaram que o desenvolvimento dos estrmulos est dependente da diferenciao, do tipo de clula e que a sua presena est inversamente correlacionada com a densidade dos cloroplastos (Waters et al., 2004). O seu aparecimento e desenvolvimento em clulas do mesfilo de Arabidopsis thaliana dependente da temperatura: a 5 oC no so detectadas nenhumas protuberncias, a 20 oC observam-se algumas protuberncias e estrmulos, e a 45 oC observam-se muitas protuberncias e estrmulos (Holzinger et al., 2007). Estas estruturas foram, tambm, visualizadas por microscopia electrnica em folhas de arroz, onde a rubisco foi detectada com anticorpos (Bourett et al., 1999). Kwok et al. (2004) introduziram, em plantas de tabaco, o gene artificial composto pela SSU seguido de GFP, e mostraram que esta subunidade da rubisco era incorporada na holoenzima circulando nos estrmulos. O mesmo aconteceu para o produto do gene artificial composto pelo aspartato aminotransferase seguido de GFP. Os estrmulos ou protuberncias, quando mais pequenos, podem funcionar como sensores do ambiente celular, facilitadores de troca de contedos celulares entre o cloroplasto e a clula, e estar envolvidos no movimento dos cloroplastos (Natesan et al., 2005; Block et al., 2007). No entanto, desconhece-se se os estrmulos esto envolvidos na formao de vesculas contendo rubisco. A degradao da clorofila comea nos cloroplastos, com a converso da clorofila em catabolitos fluorescentes que so transportados para o vacolo, por uma via desconhecida, onde se transformam em catabolitos da clorofila no 13
fluorescentes (Matile et al., 1996; Hortensteiner, 2006). Guiamet et al. (1999) descrevem o xodo dos cloroplastos de plastoglbulos fluorescentes (contendo catabolitos fluorescentes de clorofila, lpidos e protena) para o citoplasma, onde adquirem um revestimento e so transportados para o vacolo, onde o seu interior sujeito a catabolismo. A degradao vacuolar da rubisco foi observada em condies de stresse extremas, onde cloroplastos inteiros so integrados dentro do vacolo, ocorrendo ento a sua degradao inespecfica (Minamikawa et al., 2001). Em C. reinhardtii, foi detectada a presena de rubisco em grnulos densos dentro do vacolo, observando-se protuberncias na membrana do envelope do cloroplasto contendo o estroma sem membranas dos tilacides (Park et al., 1999). Em plantas de trigo, Chiba et al. (2003) detectaram a rubisco fora dos cloroplastos, encerrada na dupla membrana dos cloroplastos e outras membranas a que chamaram rubisco containing bodies- RCB. Estes corpos proteicos contm outras protenas presentes no estroma, como a glutamina sintetase, mas no protenas presentes nas membranas dos tilacides. Os RCB aumentam em nmero aps a expanso foliar, quando o teor de rubisco comea a diminuir e onde atingem o mximo, decaindo logo depois. Estes autores referem ainda que estes corpos proteicos so diferentes dos estrmulos devido s membranas adicionais que detectaram.
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Introduo
1.2 Proteases de subtilisina

As proteases da famlia das subtilases so proteases de serina pertencentes famlia S8, cujo centro activo composto por trs resduos de aminocidos ordenados, aspartilo, histidilo e serilo. De acordo com a classificao da base de dados MEROPS (Rawlings et al., 2008), esta famlia subdivide-se em S8A, com proteases do tipo subtilisin Carlsberg (Bacillus licheniformis), e S8B, com proteases do tipo kexin (Saccharomyces cerevisiae). Na subfamlia S8A esto includas as subtilisinas das plantas e na S8B esto as subtilases caractersticas dos mamferos. Seizen e Leunissen (1997) construram outra rvore e dividiram as subtilases em 6 grupos, estando as plantas no grupo das pirolisinas (uma protease de Pyrococcus furiosus), que compartilhado por proteases de bactrias e de leveduras. Um dos outros grupos o kexin, que corresponde ao grupo S8B, onde esto as convertases dos mamferos (convertem as proprotenas inactivas em protenas activas ou pptidos bioactivos), as furinas (mamferos e insectos) e algumas proteases de leveduras. Nos mamferos, as kexin esto envolvidas na formao/processamento de hormonas, factores de crescimento, neuropptidos e protenas receptoras; o nmero de substratos que podem processar grande e a sua influncia no metabolismo depende das clulas onde so produzidas (Taylor et al., 2003). Rautengarten et al. (2005) analisaram as 56 subtilisinas de A. thaliana e, baseados na semelhana entre as suas sequncias, dividiram-nas em 6 famlias. Dependendo dos seus nveis de expresso, detectaram dois grupos, um grupo com expresso ubqua e um grupo com expresso condicional. Estes autores propem trs funes para as subtilisinas: (i) controlo do desenvolvimento, (ii) turnover de protenas e (iii) componentes da sinalizao em cascata (e.g. morte celular programada). A maioria das subtilisinas de arroz (63 subtilisinas) e de A. thaliana possuem trs domnios em comum: o domnio N-terminal, que removido para activao da enzima, o domnio S8, que as caracteriza como subtilisinas, e o domnio PA (protease associated), supostamente envolvido na interaco protena-protena ou no reconhecimento do substrato. Entre as subtilisinas de arroz, s foram detectados 16 genes ortlogos (genes entre 15
espcies que derivam de um antepassado comum), sugerindo-se que alguns dos outros tenham emergido por duplicao (Tripathi e Sowdhamini, 2006). A funo das subtilisinas nas plantas permanece largamente desconhecida. Na Tabela 1 esto reunidas caractersticas de algumas subtilisinas de plantas. Para a maioria das subtilisinas, as funes fisiolgicas atribudas so circunstanciais: as evidncias surgem de situaes de stresse, da sua presena em determinados tecidos ou durante uma determinada fase do desenvolvimento. A funo sugerida atribuda pela observao de alteraes na expresso das subtilisinas, sem a existncia de uma clara causa-efeito (Schaller, 2004).
Tabela 1 Caractersticas de algumas subtilisinas

Identificador 2 subtilisina SDD1 At1g04110 Arabidopsis thaliana da Caractersticas bioqumicas 63 kDa
Localizao celular Membrana plasmtica Funo/contexto celular Expressa na parte area da planta, sobretudo junto epiderme e nos cotildones. Os mutantes que no expressam esta protena tm 2 a 3 vezes mais estomas, distribudos de forma heterognea. Os mutantes que expressam esta protease em demasia tm 2 a 3 vezes menos estomas. Actua em conjunto com o receptor TMM (too many mouth), determinando a distribuio dos estomas. (Berger e Altmann, 2000; Von Groll et al., 2002) 76,1 kDa; a 90 C retm 65% da actividade; actividade o ptima a pH 5,0, 80 C
o
Referncias ARA12 At5g67360 Arabidopsis thaliana Caractersticas bioqumicas
Localizao celular Extracelular; espao intercelular Funo/contexto celular Referncias Caracterizao do proteoma da parede celular. Presente nas silquas e caules, mas no em razes. Envolvimento na morfognese. (Hamilton et al., 2003; Boudart et al., 2005)
Este indentificador constitudo, em primeiro lugar, pelo nome atribudo subtilisina em destaque, depois pelo respectivo locus quando a espcie A. thaliana, seguindo-se, em itlico, o nome da espcie em que foram efectuados os estudos.
16
Introduo
AIR3 At2g04160 Arabidopsis thaliana
Caractersticas bioqumicas
____
Localizao celular ____ Funo/contexto celular Expressa exclusivamente nas camadas laterais das razes, nos locais de formao de novas razes laterais. Envolvida na fragilizao das conexes clula-clula e em facilitar a emergncia das razes laterais. (Neuteboom et al., 1999) ____
Referncia XSP1 At4g00230 Arabidopsis thaliana Caractersticas bioqumicas
Localizao celular Extracelular Funo/contexto celular Referncias Caracterizao do proteoma da parede celular. expressa no xilema das razes. (Zhao et al., 2000; Boudart et al., 2005) ____
ALE1 At1g62340 Arabidopsis thaliana
Localizao celular ____ Funo/contexto celular Expressa durante o desenvolvimento do embrio e em plntulas. A mutao deste gene origina uma forma anormal das folhas. Os mutantes apresentam um desenvolvimento rudimentar da cutcula que resulta na fuso dos rgos. Necessria ao desenvolvimento da cutcula. (Tanaka et al., 2001) ____
Referncia SBT_AT AT3G14067 Arabidopsis thaliana Caractersticas bioqumicas
Localizao celular Vacolos Funo/contexto celular Referncias Caracterizao do proteoma do vacolo. (Carter et al., 2004; Jaquinod et al., 2007) 73 kDa (proprotena), 68 kDa (forma activa); capacidade autocataltica dependente do pH, actividade ptima a pH 4-5 e inactiva para valores de pH acima de 7,0.
LeSBT1 Lycopersicum esculentum
Localizao celular ____ Funo/contexto celular Referncia Presente em razes, caules e flores. Envolvida no processamento de protenas. (Janzik et al., 2000)
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P69A Lycopersicum esculentum
69 kDa, glicosilada.
Localizao celular ____ Funo/contexto celular Expressa nas folhas e induzida aps infeco com Pseudomonas syringae pv. syringae. Envolvida em eventos proteolticos especficos durante o desenvolvimento ou aps estados patognicos. (Jorda et al., 1999) ____
Referncia Ag12 Alnus glutinosa Caractersticas bioqumicas
Localizao celular ____ Funo/contexto celular Referncia LIM9 Lilium longiflorum Caractersticas bioqumicas Expressa nos ndulos das razes, sobretudo na fase inicial do desenvolvimento de micorrizas. Envolvida em processos de desenvolvimento. (Ribeiro et al., 1995) 82 kDa, glicosilada.
Localizao celular Extracelular Funo/contexto celular Referncia RSP1 Oryza sativa Caractersticas bioqumicas Expressa nas anteras, na fase final da microsporognese. Envolvida na formao do plen. (Taylor et al., 1997) ____
Localizao celular ____ Funo/contexto celular Referncia SBT_Triticum* Triticum aestivum Caractersticas bioqumicas Expressa nos caules e meristemas apicais. (Yamagata et al., 2000) 72 kDa, glicosilada, resistente a 60 C e pH 3,5. o Actividade ptima a pH 7,5 e 35 C.
o
Localizao celular ____ Funo/contexto celular Referncia P1 Triticum aestivum Caractersticas bioqumicas Purificada por degradar a rubisco, presente em condies de stresse (ausncia de azoto). (Albuquerque, 2002) 59 kDa, resistente a 50 C, actividade ptima a pH 8-10.
o
Localizao celular ____ Funo/contexto celular Referncia Expressa especificamente durante a senescncia. Presente em folhas sujeitas a escurido. In vitro degrada a rubisco. Envolvida na senescncia. (Roberts et al., 2003)
18
Introduo
P2* Triticum aestivum
78 kDa, resistente a 40 C, actividade ptima a pH 10-11.
Localizao celular ____ Funo/contexto celular Referncia SAS1 Avena sativa Caractersticas bioqumicas Presente em folhas senescentes e no senescentes, induzida em condies de stresse (escurido e ausncia de azoto). (Roberts et al., 2006) 84 kDa, actividade autoproteoltica. ptima a pH 6,5, capacidade
Localizao celular Fluido extracelular Funo/contexto celular Tratamentos com a toxina do fungo Cochliobolus victoriae (victorin) deslocam a localizao celular desta protease para o espao extracelular. Envolvida na sinalizao em cascata que provoca a degradao da rubisco. (Coffeen e Wolpert, 2004) 70 kDa, actividade autoproteoltica. ptima a pH 3,5-4, capacidade
Referncia Protease C1 Glycine max Caractersticas bioqumicas
Localizao celular Vacolos de armazenamento de protenas (PSV), Funo/contexto celular Referncia Degrada a subunidade e da -conglicinina, actividade dependente do pH; inicia a degradao da -conglicinina. (Qi et al., 1992; Liu et al., 2001; He et al., 2007)
*Podero ser a mesma protena.
1.3 Objectivo
O objectivo deste trabalho a caracterizao de uma protease relacionada com a degradao da rubisco e constitui a continuao de um trabalho anterior cujo objectivo primordial era identificar a(s) protease(s) responsveis pelo catabolismo da rubisco. Durante a primeira investigao detectou-se, em plantas de trigo sujeitas a uma ausncia total de azoto, um sistema proteoltico capaz de degradar preferencialmente a forma oxidada da rubisco (Albuquerque et al., 2001). Posteriormente, utilizando-se as plantas de trigo sujeitas a uma ausncia de azoto, foi purificada uma protease do tipo subtilisina devido sua capacidade de, in vitro, degradar a forma oxidada da rubisco. Durante esta purificao, detectouse a existncia de vrias actividades proteliticas presentes em extractos de trigo. Efectuando uma separao proteica com base na carga positiva das protenas em pH cido, detectaram-se dois picos, A e B, com maior actividade. Estas fraces 19
foram subsequentemente purificadas, conduzindo determinao de duas sequncias internas da protease presente no pico A (Albuquerque, 2002). Neste trabalho pretende-se relacionar a subtilisina purificada com a degradao in vivo da rubisco. Para isso, tornou-se necessrio estender a caracterizao da protease e determinar a sequncia do seu cDNA, por forma a permitir a sua identificao exclusiva e identific-la noutras espcies vegetais, nomeadamente em Arabidopsis thaliana. A determinao da localizao celular desta subtilisina permitir coloc-la, ou no, junto da rubisco; por exemplo, se a protease se encontrar nos cloroplastos, provvel que possa degradar in vivo a rubisco. A anlise da expresso gentica poder, por exemplo, esclarecer se a protease mais expressa nas fases iniciais do desenvolvimento foliar ou se ela fortemente expressa nos tecidos meristemticos e relacionar a sua expresso com a expresso da rubisco nesses mesmos tecidos.
20
2 MATERIAL E MTODOS
2.1 Reagentes
O pH foi ajustado temperatura ambiente e todas as solues foram preparadas com gua desionizada e bacteriologicamente pura, obtida atravs do sistema Milli-Q plus, da Millipore (Bedford, USA). Todos os outros produtos qumicos utilizados tinham um grau de pureza pr-anlise. O aminocido radioactivo
L-[4,53
H] leucina (5,22 TBq.mmol-1) foi obtido na Amersham
International (Buckinghamshire, UK). O material de cromatografia, incluindo as colunas e o sistema de cromatografia "Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)", foi fornecido pela Pharmacia/LKB (Uppsala, Sucia).
2.2 Material biolgico

Lemna minor As plantas de Lemna minor L. pertencem linha LM3, isolada em 1970 do seu habitat natural, o rio Yare, Norwich, Inglaterra, tendo sido esterilizadas por imerso em hipoclorito de sdio a 6% (v/v), durante 30 segundos, e mantidas em condies asspticas numa soluo nutritiva e ambiente controlado (Trewavas, 1970). As plantas de L. minor so plantas superiores, de fcil manuseamento laboratorial e que permitem obter elevadas quantidades de protena. Foram, por isso, utilizadas para purificar grandes quantidades de rubisco, quer na forma nativa, quer na forma oxidada. Triticum aestivum O Triticum aestivum L. utilizado um trigo mole da variedade Torero, gentilmente oferecido pela Pioneer Hi. As folhas de plantas de trigo foram utilizadas para a purificao e caracterizao da protease SBT_Triticum, cuja presena foi investigada em folhas e em cloroplastos isolados de folhas. Arabidopsis thaliana As sementes de Arabidopsis thaliana L. pertencentes ao ectipo Columbia-0 foram fornecidas pelo The European Arabidopsis Stock Centre- NASC. Estas plantas foram utilizadas porque so uma referncia em estudos fisiolgicos, conhecida toda a sequncia de DNA e existem numerosas linhas com genes 21
modificados. Esta planta foi utilizada para permitir inserir a protease proveniente de plantas de trigo num contexto mais global. Escherichia coli As bactrias de Escherichia coli L. foram utilizadas para clonar fragmentos de DNA com o objectivo de os sequenciar e, tambm, para expressar alguns desses fragmentos utilizados na produo anticorpos policlonais. Para isso, utilizaram-se duas estirpes diferentes, a estirpe TOP10 e a estirpe BL21 Star (DE3) (fornecidos pela Invitrogen) e, dois vectores diferentes, o pCR 2.1_TOPO e o pet151/D-TOPO (fornecidos pela Invitrogen).
2.2.1 Condies de cultura de Lemna minor

As plantas de L. minor cresceram em regime autotrfico a 25 oC, em condies estreis e sob luz contnua (Philips TLD 23W/33, 200 mol quanta.m2
.s-1) e em meio de cultura completo ou em meio de cultura completo contendo
0,5 M de D-manitol para originar um choque osmtico (Ferreira e Davies, 1989). O meio completo foi preparado de acordo com Ferreira e Davies (1987a), tendo a seguinte composio: KNO3 KH2PO4 CaCl2. 2H2O H3BO3 CuSO4.5H2O NaMoO4.2H2O KI 5 mM 2 mM 364 M 23 M 160 nM 206 nM 3 nM KCl MgSO4.7H2O EDTA.Na.Fe MnCl2.4H2O ZnSO4.7H2O CoCl2.6H2O 2,5 mM 1 mM 19 M 5 M 382 nM 52 nM
O pH foi ajustado a 5,8 com NaOH 0,2 M. O meio de cultura foi fraccionado em volumes de 400 mL para bales de Erlenmeyer de 1 L, rolhados com algodo envolto em gaze e autoclavados durante 20 min temperatura de 120 oC e presso de 0,2 MPa. As plantas de L. minor foram transferidas para novos meios, na fase exponencial de crescimento, numa bancada de fluxo laminar esterilizada (Telstar, Terrassa, Espanha). O meio de cultura contendo manitol foi utilizado para impor um stresse osmtico. Neste caso, as plantas cresceram durante 6 dias em meio completo, 22
Material e Mtodos
altura em que cobrem a superfcie do Erlenmeyer, e foram transferidas, em condies asspticas, para o meio contendo 0,5 M D-manitol durante 36 h.
2.2.2 Condies de cultura de Triticum aestivum

O trigo foi utilizado para purificar as proteases envolvidas na degradao da rubisco. Estas proteases foram detectadas em plantas com crescimento em soluo nutritiva sem azoto (Albuquerque et al., 2001). As condies de crescimento da cultura de Triticum aestivum foram efectuadas como descrito por Esquvel et al. (1998). As sementes foram desinfectadas com etanol a 70% (v/v) durante 2 minutos, mergulhadas numa soluo de hipoclorito de sdio a 1% (v/v) durante 20 minutos e lavadas 4 vezes com gua destilada. De seguida, foram colocadas sobre uma rede em tabuleiros para cultura hidropnica com 3 L de capacidade, cobertas com algodo embebido em gua e deixadas temperatura ambiente. Aps 2-3 dias foi retirada a cobertura de algodo e os tabuleiros foram cheios com soluo nutritiva completa e arejados por uma bomba de aqurio. Composio da soluo nutritiva completa: KNO3 (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O H3BO3 C6H5FeO7 ZnSO4.7H2O NH4VO3 (NH4)6Mo7O2 0,5 mM 0,05 mM 0,5 mM 46 M 36 M 170 nM 197 nM 18 nM Ca(NO3)2 KH2PO4 NaCl MnCl2.4H2O CuSO4.5H2O NiSO4.7H2O Na2CrO4 1,5 mM 0,1 mM 0,15 mM 9 M 316 nM 180 nM 192 nM
O pH da soluo foi acertado para 5,5. A soluo nutritiva sem azoto foi conseguida substituindo-se o KNO3, Ca(NO3)2, (NH4)2SO4 e o KH2PO4 por 1,5 mM CaCl2, 0,38 mM KH2PO4 e 0,25 mM K2SO4. As plantas cresceram em condies controladas com, ciclos de 24 h constitudos por 16 h luz (25 oC) e 8 h escuro (20 oC) (luz fluorescente- Philips TLD 23W/33, 200 mol quanta.m-2.s-1). Aps os primeiros 11 dias em crescimento 23
em meio completo, a soluo nutritiva ou foi substituda por soluo nutritiva sem azoto, ou foi respota nova soluo nutritiva completa. As plantas de trigo foram sujeitas a um perodo de stresse sem azoto durante 15 dias. De dois em dois dias, o volume de soluo foi perfeito at ao topo dos tabuleiros. Terminado o crescimento ao fim de 26 dias, os limbos de todas as folhas foram colhidos, pesados, imersos em azoto lquido e guardados a -80 oC at posterior utilizao.
2.2.3 Condies de cultura de Arabidopsis thaliana

As plantas de A. thaliana cresceram nas mesmas condies de luz e temperatura utilizadas para a cultura do trigo. As sementes de A. thaliana foram colocadas em Jiffy Pots que foram posteriormente colocados em vasos. Na altura de florao, os vasos foram deitados e as sementes colhidas para sacos de papel. Adicionalmente, utilizou-se um meio selectivo para plantas resistentes canamicina. Neste caso, as sementes foram colocadas em meio MS- Murashige e Skoog (1962) estril, contendo 30 g/mL de canamicina e cresceram sob luz contnua. Aps 3 a 4 semanas de crescimento, a sobrevivncia das plntulas foi avaliada.
2.2.4 Condies de cultura de Escherichia coli

As bactrias de E. coli foram cultivadas em meio LB (Luria-Broth) composto por 1% (m/v) triptona, 0,5% (m/v) extracto de levedura e 1% (m/v) NaCl, pH 7,0, contendo 1,5% (m/v) agar. O meio foi esterilizado em autoclave (30 min, 0,2 MPa e 120 oC) e, depois de arrefecido a ca. de 60 oC, foi adicionado o antibitico apropriado. Numa bancada de fluxo laminar, o meio foi vertido para placas de Petri esterilizadas. Aps a solidificao e arrefecimento as bactrias foram inoculadas no meio de cultura. A colnia de bactrias seleccionada foi colocada a crescer em meio LB, normalmente durante a noite, a 37 oC e com agitao de ca. 200 rpm. As bactrias foram guardadas a 80 oC em meio LB, contendo 15% (v/v) de glicerol esterilizado, quando se pretendia manter a viabilidade das bactrias, ou recolhidas por centrifugao a 5100 g, 5 min e guardadas a 80 oC, quando se pretendia utilizar o seu contedo.
24
Material e Mtodos
2.3 Doseamento de protenas

O doseamento das protenas foi realizado por trs mtodos: pelo mtodo de Lowry modificado (Bensadoun e Weinstein, 1976; Lowry et al., 1951), pela leitura da absorvncia a 280 nm e pelo mtodo FluoroProfiledescrito por Mackintosh et al. (2005). O mtodo de Lowry modificado e o mtodo FluoroProfile foram utilizados para determinar a quantidade de protena presente em amostras complexas. O mtodo FluoroProfile permite quantificar o teor de protena em amostras de volume reduzido e foi por isso utilizado. A leitura da absorvncia a 280 nm foi utilizado para a quantificao de amostras contendo rubisco purificada, pois, o seu coeficiente de extino conhecido (Esquvel et al., 1998).
2.3.1 Mtodo de Lowry modificado

s amostras a quantificar (contendo entre 0 a 30 g de protena) e s solues de albumina de soro bovino (BSA), utilizadas para construir uma recta de calibrao, contendo 0, 2,5, 5, 15, 25 e 30 g de protena, foi adicionada gua destilada e desionizada at perfazer 250 L Em seguida, adicionaram-se 50 L de desoxicolato de sdio 1 % (m/v) e 1 mL de cido tricloroactico (TCA) a 10% (m/v). Aps 10 min de repouso, as amostras foram centrifugadas durante 5 min a 8000 g e o sobrenadante foi desprezado. A protena foi suspensa em 1 mL de uma soluo contendo 20 mg de bicarbonato de sdio, 4 mg de hidrxido de sdio, 1,6 mg de tartarato de sdio, 10 mg de sulfato dodecilo de sdio (SDS) e 0,4 mg de sulfato de cobre. Depois de 10 min de incubao foi-lhe adicionado 0,1 mL de reagente de Folin-Ciocalteau, diludo em gua (1:1). As amostras foram agitadas e incubadas s escuras durante 30 min, findos os quais foi lida a absorvncia de cada uma das amostras a 750 nm.
2.3.2 Leitura da absorvncia

A leitura da absorvncia um mtodo bastante til visto ser simples, rpido e no destruir as amostras. Utilizou-se este mtodo para determinar a concentrao de rubisco purificada para a qual foi previamente estimado o factor de converso
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baseado nas propriedades do coeficiente de extino molar (E
1cm/M 280
) que,
para a rubisco nativa de L. minor, de 1,54 (Esquvel et al., 1998).
2.3.3 Mtodo de FluoroProfile

A protena foi doseada utilizando-se o fluorforo epicocconone presente no Kit FluoroProfileTM Protein Quantification fornecido pela empresa SigmaAldrich. O epicocconone uma molcula que se liga reversivelmente aos grupos amina das protenas alterando o seu espectro de emisso de verde fraco para laranja/vermelho quando excitadas com um comprimento de onda entre os 405 e os 530 nm. A intensidade de cor produzida directamente proporcional quantidade de protena presente na amostra, desde que esta no contenha substncias interferentes (Bell e Karuso, 2003; Mackintosh et al., 2003). A protena foi quantificada em 5 L de extracto total (com trs repeties) e utilizaram-se solues de concentrao crescente de BSA para construir uma recta de calibrao (5 L com 0, 5, 10, 15, 25, 35, 50 e 70 g de protena). As amostras foram colocadas em placas de microtitulao com 96 poos e, em seguida, adicionou-se 1 L de desoxicolato de sdio a 1% (m/v), esperou-se 10 min, adicionou-se 20 L de TCA a 12% (m/v) e incubou-se a 4 oC, durante 15 min. As placas foram ento centrifugadas (Allegra25R Beckman Coulter) a 4100 g, 20 min a 4 oC e lavadas por duas vezes com uma soluo de acetona fria a 25% (v/v). O precipitado foi ressuspendido em 50 L de gua, com o pH ajustado para 9,0, e 50 L da soluo tampo fornecida no referido kit (esta soluo contem um detergente e o fluorforo). As leituras foram efectuadas num fluormetro Synergy HT- Bio-Tek, com uma janela de excitao de 530/20 e emisso de 645/40, e com uma sensibilidade de 80.
2.4 Electroforese 2.4.1 Electroforese desnaturante em gel de poliacrilamida

Recorreu-se tcnica de electroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis), em
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Material e Mtodos
sistema descontnuo (Laemmli, 1970), composto por um gel concentrador e um gel separador. Os polipptidos foram separados em gis de 12,5% (m/v) de acrilamida, de acordo com o mtodo descrito por Blose e Feramisco (1983), onde se adiciona SDS a todos os tampes e cuja composio era a seguinte: - Gel concentrador: 5% (m/v) acrilamida, 0,13% (m/v) bis-acrilamida (N, Nmetileno-bis-acrilamida), 125 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,1% (m/v) SDS, 0,1 % (m/v) persulfato de amonaco (PSA) e 0,05% (v/v) N, N, N, N-tetrametiletilenodiamida (TEMED); - Gel separador: 12,5% (m/v) acrilamida, 0,1% (m/v) bis-acrilamida, 375 mM Tris-HCl pH 8,8, 0,01% (m/v) SDS, 0,03 % (m/v) PSA e 0,03% (v/v) TEMED. O tampo de elctrodo catdico era constitudo por uma soluo 25 mM de Tris e 192 mM de glicina, pH 8,8, contendo ainda 0,1% (m/v) SDS. O tampo andico continha, alm disso, 0,1 M de acetato de sdio. As amostras e os marcadores de massa molecular foram preparados em tampo amostra (SBM), cuja composio e concentrao final na soluo de protenas foi a seguinte: tampo 0,08 M Tris-HCl, pH 6,8, 0,1 M 2-mercaptoetanol (ME), 2% (m/v) SDS, 15% (v/v) glicerol e 0,006 (m/v) m-cresol purpreo. As amostras foram precipitadas em 80% (v/v) de acetona durante 30 minutos a 20 oC, centrifugadas a 10000 g, 10 min e o sobrenadante desprezado. Depois da adio do tampo, as amostras foram agitadas no vortex e aquecidas a 100 oC durante 3 min. Quando no foram utilizadas de seguida, foram congeladas em azoto lquido e guardadas a -80 oC. Os marcadores de massa molecular usados foram fornecidos pela Sigma: - Marcadores de massa molecular elevada (29 kDa a 205 kDa): miosina (205 kDa), -galactosidase (116 kDa), fosforilase B (97,4 kDa), albumina de soro bovino (66 kDa), ovalbumina (45 kDa) e carbonato anidrase (29 kDa); - Marcadores de massa molecular baixa (14,2 kDa a 66 kDa): albumina de soro bovino (66 kDa), ovalbumina (45 kDa), subunidade da 3-fosfogliceraldedo desidrogenase (36 kDa), carbonato anidrase (29 kDa), tripsina (24 kDa), inibidor de tripsina (20,1 kDa) e -lactalbumina (14,2 kDa).
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A electroforese decorreu a corrente constante de 45 mA e tenso varivel, mas sempre inferior a 200 V, com uma fonte de alimentao modelo EPS 500/400 (Pharmacia/LKB). A migrao dos polipptidos foi interrompida quando o mcresol-purpreo se encontrava prximo da extremidade inferior do gel. Os gis foram revelados com "Coomassie Brilliant Blue R250 (CBB R-250) ou com nitrato de prata. Na colorao com CBB-R-250, os polipptidos foram fixados durante 15 min numa soluo de TCA a 10% (m/v). Aps uma lavagem com gua, o gel foi corado, durante um mnimo de 3 h, com uma soluo contendo 0,25 % (m/v) de CBB R-250, 25% (v/v) de 2- propanol e 10% (v/v) de cido actico glacial, e descorado, at ser possvel observar nitidamente as bandas, com uma soluo contendo 25% (v/v) de 2-propanol e 10% (v/v) de cido actico glacial, sempre com agitao. Posteriormente, o gel foi mergulhado numa soluo a 10% (v/v) de cido actico glacial e guardado a 4 oC. Na colorao com nitrato de prata, os polipptidos foram fixados durante 20 min em 50% (v/v) metanol, 12% (v/v) cido actico e 0,05% (v/v) formaldedo; de seguida, foram lavados 3x10 min com etanol a 50% (v/v), sofreram um prtratamento de 4 min com 0,02% (m/v) Na2S2O3.5H2O e foram lavados 3x 20 s com H2O. A colorao foi obtida pela imerso do gel em 0,2% (m/v) AgN03 e 0,075% (v/v) formaldedo durante 10 min, seguida de duas lavagens com H2O e nova imerso em 6% (m/v) Na2CO3, 0,05% (v/v) formaldedo e 0,4%o (v/v) Na2S2O3.5H2O at ao desenvolvimento da cor, lavagem rpida com H2O e paragem da colorao por imerso em 50% (v/v) metanol e 12% (v/v) cido actico durante 5 min; o gel foi, ento, colocado numa soluo com 50% (v/v) de metanol e seco ao ar, envolto em duas folhas de papel celofane.
2.4.2 Electroforese nativa em gel de poliacrilamida

A electroforese nativa ocorre em condies no- desnaturantes e no redutoras, por isso, no se adiciona SDS nem 2-mercaptoetanol a nenhum dos tampes utilizados durante a electroforesee as amostras no so fervidas. Os gis utilizados so semelhantes aos anteriores, mas, em que a concentrao de
28
Material e Mtodos
acrilamida e bis-acrilamida no gel de concentrao de 4% (m/v) e 0,13% (m/v) e no gel de separao de 5% (m/v) e 0,26% (m/v), respectivamente. A colorao destes gis foi realizada por imerso numa soluo com 0,3M CuCl2 durante 5 min e lavagem com gua para retirar o excesso de corante; as bandas proteicas permanecem incolores. As bandas contendo as protenas purificadas foram cortadas e lavadas 4x 5 min em 0,25 M Tris-HCl, pH 9,0 contendo 0,25 M de EDTA para eliminao do excesso de CuCl2. As protenas foram eludas passivamente, durante 1h a 37 oC, em 500 L de soluo contendo 50 mM Tris-HCl pH 7,9, 0,1 mM EDTA e 0,15 M NaCl e introduzidas numa coluna de filtrao em gel Sephadex G-25M (NAP-5; volume vazio 0,5 mL, fornecidas pela Amersham).
2.4.3 Electroforese em gel de agarose

Para resolver cidos nucleicos foram efectuadas electroforeses em gis horizontais de agarose a 1% (m/v), dissolvida em tampo 40 mM Tris-acetato pH 8,0 com 1 mM de cido etilenodiamina tetractico (EDTA) (TAE), contendo 0,05 g/mL (m/v) de brometo de etdio. Aps a liquidificao, verteu-se a mistura no tabuleiro do gel. Os marcadores de massa molecular foram fornecidos pela Invitrogen-1 kbp plus DNA Ladder e s amostras para electroforese foi adicionado 10x Gel Loading buffer (Invitrogen) diludo 1x. Os gis foram visualizados com o auxlio de um transiluminador UV (GelDoc, Bio-Rad) e as imagens processadas pelo programa Quantity One (Bio-Rad).
2.5
Immunoblotting
2.5.1 Transferncia dos polipptidos resolvidos em SDS-PAGE para uma membrana

A electrotransferncia foi efectuada num sistema semi-seco "TransBlot SemiDry Transfer Cell" (Bio-Rad), utilizando-se uma membrana de nitrocelulose com uma porosidade de 0,2 m (Millipore). Depois de decorrida a electroforese (efectuada em gis com 0,75 mm de espessura), o gel e a membrana foram
29
imersos, durante 15 min, em tampo de transferncia, constitudo por 50 mM Trizma base, 3,7 mM glicina, 0,04% (m/v) SDS e 20% (v/v) metanol. No elctrodo andico foram colocadas 4 folhas de papel 3 MM, embebidas no tampo de transferncia, sob as quais se sobrepuseram a membrana, o gel e mais 4 folhas de papel 3 MM, embebidas em tampo de transferncia. As bolhas de ar foram cuidadosamente eliminadas ao longo da montagem, colocando-se, por fim, o elctrodo catdico. A transferncia decorreu durante 38 min, a 15 V, sem limitar a intensidade da corrente elctrica que para as condies utilizadas pode atingir 400 mA (Towbin et al., 1979; Erlich et al., 1979). Os polipptidos foram fixados membrana, durante 10 min, numa incubao em gua a ferver, lavados com gua e corados com Ponceau S ou com Amido Black.
2.5.2 Colorao de polipptidos em membranas de nitrocelulose com Ponceau S ou Amido black

Aps a transferncia, os polipptidos fixados foram corados para se avaliar a eficincia de transferncia. Ponceau S As membranas foram incubadas, durante alguns segundos, com 0,2 % (m/v) Ponceau S dissolvido em 3 % (m/v) cido tricloroactico e 3 % (m/v) cido sulfosaliclico. De seguida, foram descorados com gua e inspeccionados. Amido Black As membranas foram incubadas com uma soluo de colorao contendo amido black 10B a 0,1% (m/v) dissolvido em 45% (v/v) de metanol e 9% (v/v) de cido actico. As membranas foram lavadas com gua e avaliadas. Antes de se continuar o processo de imunodeteco, as membranas foram incubadas com a soluo solvente durante 1 h e lavadas com gua.
2.5.3 Imunodeteco
A membrana foi bloqueada durante 1 h, ou durante a noite, com tampo PBS_T 0,05% (PBS- 137 mM NaCl, 1,5 mM KH2PO4, 8,1 mM Na2HPO4, 2,7 mM KCl, 0.01% (m/v) NaN3; T- Tween20 a 0,05% (v/v)) contendo 2% (m/v) de 30
Material e Mtodos
albumina de soro bovino (BSA). Esta soluo foi recolhida e a membrana incubada com o primeiro anticorpo especfico, diludo numa concentrao prpria, em tampo PBS_T 0,05%.e 2% (m/v) BSA. Aps a incubao com o primeiro anticorpo, a membrana foi lavada, para remover ligaes inespecficas, numa soluo com maior quantidade de Tween 20 e com maior fora inica. Assim, a membrana foi lavada 2 vezes, durante 5 minutos, com soluo PBS_T 0,1% e mais 2 vezes, durante 5 minutos, com uma soluo de SAIS (1 M NaCl, 10 mM Na2PO4 e 0,5% (v/v) Tween 20). Depois das lavagens, a membrana foi incubada com a PBS_T 0,05%, durante 10 minutos e incubada com o segundo anticorpo, ligado fosfatase alcalina e especfico para o primeiro anticorpo, diludo na concentrao recomendada pelo fabricante (Sigma-Aldrich). A membrana foi novamente lavada com PBS_T 0,1% durante 5 minutos, duas vezes, e com SAIS durante 10 minutos. Posteriormente, a membrana foi lavada com PBS durante um minuto e equilibrada em tampo de deteco (0,1 M NaCl e 0,1 M Tris-HCl pH 9,5) durante 5 minutos. A revelao foi efectuada pelo produto da reaco catalisada pela fosfatase alcalina, que origina um pigmento arroxeado e insolvel, segundo o mtodo descrito por Blake et al. (1984). A membrana foi incubada, durante ca. 15 a 20 min, com tampo de deteco contendo 5 mM de MgCl2, 0,3 mg.mL-1 azul tetrazlio (NBT) e 0,15 mg.mL-1 fosfato de 5-bromo-4-cloroindoxilo (BCIP).
2.6 Extraco de cidos nucleicos 2.6.1 Extraco de DNA

O DNA foi extrado de folhas de trigo com crescimento em meio completo ou de folhas de A. thaliana crescidas em vaso. Utilizou-se o mtodo descrito por Thomas et al. (1993). O material vegetal (~1 g) foi modo em azoto lquido, ao qual se adicionou 1 mL de tampo de extraco constitudo por 100 mM Tris-HCl pH 8,2, 0,35 M sorbitol, 5 mM EDTA, 0,1 % (v/v) ME e 3 mM NaHSO3; macerouse mais um pouco e adicionou-se 1 mL de 1 M Tris-HCl pH 7,5 contendo 0,25 M EDTA, 5 M NaCl, 2% Brometo de cetiltrimetilamonio (CTAB) e 2,5% (v/v) sarcosil. De seguida, o extracto foi incubado a 65 oC, aps 15 min, adicionou-se 2 mL de
31
clorofrmio: lcool isoamlico (24:1), misturou-se por inverso durante 5 min e centrifugou-se a 5100 g, 10 min. O sobrenadante foi, ento, transferido para um tubo novo e o DNA foi precipitado com 1,3 mL (v/v) de isopropanol gelado, incubado 15 minutos e centrifugado a 5100g, 10 min. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com 70% (v/v) de etanol. Aps a secagem do precipitado, o DNA foi ressuspendido em 100 L de tampo 10 mM Tris-HCl pH 7,5 contendo 1 mM EDTA.
2.6.2 Extraco de RNA EXTRACO DE RNA TOTAL

O RNA total foi extrado de folhas de plantas de trigo sujeitas a uma ausncia de azoto durante 15 dias. A extraco foi efectuada de acordo com o mtodo descrito por Chang et al. (1993). Assim, maceraram-se, num almofariz prarrefecido e com azoto lquido, 4 g de folhas de trigo at se obter um p fino. O macerado foi adicionado a 20 mL de tampo de extraco 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 25 mM EDTA, 2 M NaCl, 2% (v/v) ME e 2% (m/v) CTAB, previamente aquecido a 65 oC e misturado por inverso. Adicionou-se clorofrmio: lcool isoamlico (24:1 (v/v)) em igual volume ao do macerado mais tampo e misturouse por inverso durante 5 min. De seguida, centrifugou-se 15 min, 1000 g temperatura ambiente e recolheu-se o sobrenadante; este passo foi repetido e o volume do sobrenadante rigorosamente medido. Ao sobrenadante adicionou-se, exactamente, 0,25 volumes de LiCl 10 M e a soluo foi incubada durante a noite a 0 oC. Aps esta incubao, centrifugou-se durante 20 min, 10000 g, 4 oC e descartou-se o sobrenadante. O precipitado foi seco durante 20 min temperatura ambiente e ressuspendido em 1,5 mL de tampo 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5% (m/v) SDS, previamente aquecido a 37 oC. A soluo foi dividida por dois tubos de microcentrfuga, aos quais se adicionou igual volume de clorofrmio: lcool isoamlico (24:1 (v/v)); misturou-se por inverso durante 5 min, centrifugou-se durante 10 min, 10000 g temperatura ambiente e recolheu-se o sobrenadante. Ao sobrenadante foi adicionado 2,5 volumes de etanol e incubado a 20 oC durante a noite. Aps o perodo de incubao, centrifugou-se durante 30 min, 10000 g, 4 oC e descartou-se o 32
Material e Mtodos
sobrenadante. O precipitado foi lavado com 70% (v/v) etanol, centrifugado durante 20 min, 10000 g, 4 oC e ressuspendido no gelo, com 50 L de gua destilada, desionizada e autoclavada, durante 2 h. O RNA foi armazenado a 80 oC.
PURIFICAO DE mRNA
Aps extraco do RNA total, o mRNA foi purificado em gel de oligo-dT cellulose type 7 (Amersham), de acordo com o protocolo geral fornecido pelo fabricante. Um miligrama de RNA total foi diludo em tampo de ligao (concentrao final 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA e 0,05% (m/v) SDS), aquecido a 65 oC e hibridado num tubo de microcentrfuga com o gel de oligo-dT, previamente equilibrado em tampo de ligao, durante 10 minutos temperatura ambiente. Findo este perodo, realizou-se uma pequena
centrifugao e descartou-se o sobrenadante. O gel foi lavado, duas vezes, em tampo de ligao e mais duas vezes com tampo de lavagem (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,2 M NaCl, 1 mM EDTA e 0,05% (m/v) SDS). O mRNA foi eludo por duas vezes, aps uma incubao durante 5 min a 37 oC com 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA e 0,05% (m/v) SDS. O mRNA foi precipitado com 2 volumes de etanol gelado e 0,2 volumes de 2 M NaCl, e incubado a 20 oC, durante 2 h. Aps o perodo de incubao centrifugou-se durante 30 min, 10000 g, 4 oC e descartou-se o sobrenadante. O precipitado foi lavado com 70% (v/v) etanol, centrifugado durante 20 min, 10000g, 4 oC e ressuspendido no gelo, com 50 L de gua destilada, desionizada e autoclavada, durante 2 h. O RNA foi armazenado a 80 oC.
2.6.3 Quantificao de cidos nucleicos

Uma vez concludo o procedimento de purificao dos cidos nucleicos, procedeu-se sua quantificao e avaliao do seu grau de pureza. Estas medies foram efectuadas no espectrofotmetro GeneQuant (Pharmacia Amersham Biotech). A concentrao de cidos nucleicos foi determinada pela absorvncia a 260 nm e a sua pureza pela razo A260/A230 (que permite avaliar contaminaes com polissacridos) e pela razo A260/A280 (que permite avaliar contaminaes proteicas).
33
2.7 Amplificao de cidos nucleicos por PCR 2.7.1 Sntese de cDNA por RT- PCR
A sntese de cDNA foi efectuada a partir do RNA total (1 a 4 g) ou do mRNA (50 a 100 ng). Nas primeiras reaces utilizaram-se os primers ancorados oligodT18 (Invitrogen) e, mais tarde, primers especficos para a sequncia SBT_Triticum. As reaces foram efectuadas de acordo com as recomendaes do fabricante, com as enzimas de transcrio reversa, a SuperScript II (42 oC, 50 min) ou a ThermoScript (55 oC, 50 min), ambas fornecidas pela Invitrogen.
2.7.2 Reaco de PCR

A reaco de polimerizao em cadeia (PCR), descrita por Saiki et al. (1988), foi efectuada num termociclador MasterCycler Gradient da marca Eppendorf. As polimerases utilizadas neste trabalho foram a FastSart Taq DNA polymeraseRoche, a Taq DNA polymerase native or recombinant- Invitrogen e a Platinun Pfx polymerase- Invitrogen. A mistura de reaco consistia em 50 a 100 ng DNA, 200 M dNTPs, 200 nM de cada primer, tampo especfico para a DNA polimerase I na quantidade recomendada pelo fabricante e, por vezes, 20% (v/v) da soluo G-C Rich fornecida pela Roche, num volume final de 50 L. A soluo de reaco foi colocada no termociclador e iniciou-se a reaco de polimerizao que decorreu ao longo de 25 a 35 ciclos e, quando necessrio, com uma incubao prvia a 94 oC, 3 min: desnaturao do DNA- 94 oC, durante 30 s; emparelhamento dos primers- 48 a 65 oC (Ta) conforme os primers utilizados, durante 30 s; sntese do DNA- 68 ou 72 oC, conforme a enzima utilizada durante 45 s-90 s. Quando a reaco terminou, os tubos de PCR foram colocados a 4 oC at serem processados. A reaco foi analisada em gis de agarose e os tubos foram guardados a 20 oC at posterior utilizao.
34
Material e Mtodos
2.7.3 Purificao dos produtos de PCR

A purificao dos produtos de PCR foi efectuada com o kit High pure PCR product purification Kit, fornecido pela empresa Roche. Este kit permite a recuperao de cidos nucleicos superiores a 100 bp. Os produtos de PCR foram purificados directamente da soluo de reaco de PCR ou aps separao dos produtos de PCR por electroforese em gel de agarose (2.4.3); neste ltimo caso, a banda de interesse foi extrada do gel e purificada com o referido kit.
2.8 Clonagem dos produtos de PCR em E. coli

Os vectores e as bactrias necessrios para a clonagem foram fornecidos pela Invitrogen e foram utilizados segundo as instrues do fabricante. Os produtos de PCR foram ligados a dois tipos de vectores, dependendo do objectivo da utilizao subsequente. Quando se pretendeu enviar os produtos de PCR para sequenciao, utilizouse o vector pCR2.1. Este vector usa uma ligao T-A, baseada na adio de uma base de adenina extremidade 3' da cadeia de DNA nascente, por parte da enzima Taq polimerase, desde que esta no possua actividade de exonuclease (TA-cloning). Este vector foi introduzido nas bactrias do tipo One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli, conferindo resistncia canamicina e permitindo a seleco de bactrias com plasmdeos contendo algum produto de PCR. Quando se pretendeu expressar os produtos de PCR, utilizou-se o vector pET151/D-TOPO. Este vector um pouco mais complexo, usa uma ligao baseada na adio da sequncia CACC na extremidade 5' do primer fwd, o que permite uma ligao direccional do produto. Contm, entre outras caractersticas, uma sequncia que confere resistncia ampicilina, uma sequncia que permite controlar a expresso da protena, uma sequncia que codifica seis histidinas na extremidade 5' do produto inserido e uma sequncia reconhecida pela protease TEV-Tobacco etch virus e que permite cortar a cauda de histidinas. Este plasmdeo foi primeiramente introduzido nas bactrias do tipo TOP10, para seleco, sequenciao e multiplicao e, depois de purificado, foi introduzido nas
35
bactrias BL21 Star(DE3) One Shot Chemically Competent E. coli, para expresso do produto introduzido.
2.8.1 Purificao de plasmdeos

Os plasmdeos inseridos em E. coli foram purificados com o kit Jetstar plasmid kit na verso mini ou midi (Genomed), seguindo-se as instrues do fabricante. Neste kit, os plasmdeos so purificados em colunas de troca aninica e esto em condies para se efectuar uma reaco de sequenciao. Para anlises electroforticas, com ou sem uso de enzimas de restrio, o plasmdeo foi purificado como no mtodo descrito por Sal et al. (1989). Assim, as bactrias contendo o plasmdeo foram recolhidas, por centrifugao (10000 g, 1 min), num tubo de microcentrfuga e foram ressuspendidas em 300 L de tampo 50 mM Tris-HCl pH 8,0, contendo 50 mM EDTA, 5% (v/v) Triton X-100, 8% (m/v) de sacarose e 0,5 (m/v) lisozima. A soluo foi fervida a 100 oC durante 30 segundos. De seguida, centrifugou-se a 10000 g, 20 min, retirou-se o precipitado e ao sobrenadante adicionou-se 360 L de isopropanol. Efectuou-se uma nova centrifugao a 10000 g, 20 min e o precipitado foi lavado com 70% (v/v) etanol. Depois de seco o precipitado contendo os plasmdeos foi ressuspendido em 50 L de gua destilada, desionizada e autoclavada, e guardado a 20 oC.
2.9 Sequenciao de DNA

Os produtos de PCR purificados ou inseridos em plasmdeos foram enviados para a empresa Stabvida, de acordo com as especificaes da empresa, que realizou a reaco de sequenciao e produziu os cromatogramas. Os cromatogramas foram visualizados num dos programas compatveis, como sendo o TraceViewer (Helmbold et al., 1990).
2.10 Alinhamento e anlise de sequncias

As sequncias determinadas foram montadas com o programa CodonCode Aligner, em verso demo, fornecido pela CodonCode Corporation. As sequncias foram comparadas com outras sequncias depositadas nas bases de 36
Material e Mtodos
dados
disponibilizadas
pelo
NCBI-
National
Center
for
Biotecnhology
Information, pelo EBI- European Bioinformatics Institut e pelo TIRG- Wheat genome database, utilizando o programa BLAST- Basic Local Alignment Search Tool (Altschul et al., 1997). Os domnios presentes nas protenas estudadas foram pesquisados na base de dados PROSITE (Hulo et al., 2008) e na Conserved Domain Database- NCBI (Marchler-Bauer et al., 2005). A previso da localizao subcelular e locais de corte das protenas foi efectuado recorrendo aos programas TargetP e SignalP (Emanuelsson et al., 2007), situados no servidor do Center for Biological Sequence Analysis, Technical University of Denmark.
37
38
3 CARACTERIZAO BIOQUMICA DA SUBTILISINA, SBT_TRITICUM,
QUE, IN
VITRO, DEGRADA PREFERENCIALMENTE A FORMA OXIDADA DA RUBISCO
3.1 Introduo
A(s) protease(s) que degrada(m), in vivo, a rubisco permanecem
desconhecidas. Algumas proteases endgenas apresentam, in vitro, capacidade proteoltica contra a rubisco. Por forma a purificar o sistema proteoltico responsvel pela degradao fisiolgica da rubisco, partiu-se da hiptese de esta enzima sofrer uma oxidao antes de ser degradada (Ferreira et al., 2000). Esta hiptese sustentada pelo aumento de susceptibilidade degradao, aps a imposio de stresses que conduzem a modificaes oxidativas na rubisco. Quando plantas de Lemna minor so submetidas a um choque osmtico (0,5 M de
D-manitol),
a rubisco no se degrada, mas sofre uma srie de
alteraes estruturais que envolvem a oxidao da enzima a uma forma acdica, cataliticamente inactiva, a que se segue uma polimerizao das suas subunidades conducente formao de agregados de massa molecular elevada (Ferreira e Shaw, 1989). A imposio de um choque osmtico provoca, tambm, o aparecimento do P65 (Franco et al., 1992), um polipptido de 65 kDa formado pela ligao covalente de uma subunidade grande a uma subunidade pequena da rubisco e que foi purificado em conjunto com a forma oxidada da enzima (Ferreira et al., 1996). A rubisco das folhas de trigo est sujeita a taxa de turnover varivel consoante as condies metablicas em que se encontra: em condies metablicas normais observa-se um turnover contnuo da enzima, o qual fortemente induzido em condies de deficincia de azoto (Esquvel et al., 2000). Nestas condies detectou-se, tambm, a existncia de um sistema proteoltico capaz de degradar preferencialmente a forma oxidada da rubisco, relativamente sua forma nativa (Albuquerque et al., 2001). Com o objectivo de purificar a protease envolvida nesta degradao, procedeu-se ao fraccionamento da protena total solvel de folhas de trigo, privado de azoto, e, em cada etapa do fraccionamento, mediu-se a actividade proteoltica contra a forma oxidada da 3H-
39
rubisco. O polipptido responsvel pela degradao in vitro da rubisco foi digerido com tripsina e foram sequenciados dois fragmentos internos, identificando-se uma protease do tipo subtilisina (Albuquerque, 2002). Este processo encontra-se aqui descrito, para melhor clareza dos resultados obtidos, porque vai ser necessrio para a compreenso das propriedades da protease em estudo e, finalmente, porque o processo de purificao foi repetido para continuar o processo de caracterizao da protease. A caracterizao prvia da actividade proteoltica contra a forma oxidada da rubisco foi efectuada para uma gama de valores de pH entre 4,5 e 9,0, utilizandose diferentes tampes com sobreposio de valores de pH: obteve-se uma actividade mxima para valores de pH entre 6,5 e 7,5. A avaliao da actividade para temperaturas superiores a 35 oC encontra-se comprometida, pois a forma oxidada da rubisco relativamente estvel a temperaturas entre os zero e os 25 oC, durante 15 h, comeando a apresentar degradao para temperaturas superiores a 35 oC. A temperatura de actividade ptima da SBT_Triticum, tomando em considerao a degradao da 3H-rubisco, foi de 35 oC. A actividade da protease inibida por 2 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (soluo preparada na altura) ou por uma mistura de inibidores (N-tosil-L-fenilalanina clorometilcetona (TPCK), 1,10-fenantrolina (FEN) e N-etilmaleimida (NEM)), mas no por cada um individualmente, indicando que se trata de uma protease do tipo serina. O facto de no ser inibida pelo TPCK, sugere tratar-se de uma protease do grupo das subtilisinas (Albuquerque, 2002). As sequncias peptdicas determinadas foram utilizadas para sequenciar o cDNA da protease, em Triticum aestivum, e identific-lo de forma nica. Estima-se que possam existir cerca de 60 proteases do tipo subtilisina em trigo, uma vez que em arroz existem 63 sequncias distintas para proteases do tipo subtilisina (Tripathi e Sowdhamini, 2006). No caso das subtilisinas, a determinao da sequncia do cDNA fundamental para a identificar de forma nica na espcie de origem e determinar a subtilisina correspondente noutras espcies. Assim, a determinao da sequncia do seu DNA permitiu identificar a subtilisina correspondente em Arabidopsis thaliana e encontrar formas potenciais de
40
Caracterizao bioqumica da subtilisina, SBT_Triticum, que, in vitro, degrada preferencialmente a forma oxidada da rubisco
regulao da sua actividade, como sendo a possibilidade de fosforilao dos seus resduos de serina, treonina ou tirosina. Para melhor caracterizar a protease, produziram-se anticorpos policlonais em rato, para a protease de Triticum aestivum e para a sua homologa em Arabidopsis thaliana. Os antignios fornecidos aos animais provieram da expresso de polipptidos recombinantes para o Triticum aestivum e Arabidopsis thaliana induzidos em Escherichia coli. Estes anticorpos foram utilizados no estudo de caracterizao da protease, em termos de massa molecular nativa e em SDSPAGE.
41
42
3.2 Material e mtodos 3.2.1 Purificao da forma nativa e da forma oxidada da rubisco 3.2.1.1 Material vegetal
Utilizaram-se plantas de Lemna minor com crescimento em meio completo (forma nativa) ou em meio completo contendo 0,5 M de D-manitol (forma oxidada), como descrito em 2.2.1.
3.2.1.2 Marcao radioactiva

A marcao radioactiva foi efectuada por exposio das plantas a L-[4,53
H]leucina. Este aminocido facilmente absorvido pelas plantas e incorporado
nas protenas de L. minor que, em 24 h, absorvem cerca de 44% da radioactividade adicionada ao meio (Esquvel et al., 1998).
A
3
H-RUBISCO NATIVA
A rubisco nativa foi purificada a partir de plantas de L. minor com crescimento
em meio completo. Trs ou quatro exemplares de L. minor foram transferidos, em condies asspticas, para bales de Erlenmeyer contendo 400 mL de meio completo, onde cresceram, nas condies descritas em 2.2.1, durante 4 dias, altura em que cobriam ca. 2/3 da superfcie livre do meio. Foi ento adicionado, a cada frasco, 0,92 MBq de 3H-leucina. As plantas foram colhidas 48 h aps a adio do aminocido radioactivo.
A 3H-RUBISCO OXIDADA
Depois das plantas de L. minor terem crescido durante 6 dias em meio completo, tendo-se adicionado 0,92 MBq de 3H-leucina nas ltimas 48 h, as plantas foram transferidas, em condies asspticas, para bales de Erlenmeyer contendo 400 mL de meio completo com 0,5 M de D-manitol, sendo colhidas ao fim de 36 h (Franco et al., 1992; Ferreira e Davies, 1989). A rubisco oxidada foi extrada destas plantas.
43
3.2.1.3 Purificao de rubisco nativa e de rubisco oxidada

As duas formas da rubisco, nativa e oxidada, foram purificadas de modo semelhante e tendo como base o mesmo mtodo de purificao (Esquvel et al., 1998). O processo de purificao decorre ao longo de um dia e, sempre que possvel, na cmara fria a 4oC, sendo composto pelas seguintes trs etapas principais:
EXTRACO DA PROTENA TOTAL SOLVEL

Todo o processo de extraco foi realizado na cmara fria, a 4 oC. As plantas de L. minor, previamente congeladas em azoto lquido, foram maceradas num almofariz at serem reduzidas a p. A extraco decorreu em tampo (2,5 mL por grama de peso fresco) 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, contendo 1 mM de PMSF; o homogenato obtido foi filtrado atravs de trs camadas de gaze e clarificado por uma centrifugao a 44000 g, 15 min, 2 oC. O sobrenadante foi dessalinizado em colunas de filtrao em gel Sephadex G-25M (PD-10; volume total 9,1 mL; volume vazio 2,5 mL), previamente equilibradas com tampo 20 mM Tris-HCl, pH 7,5.
CROMATOGRAFIA DE TROCA ANINICA EM FPLC

A cromatografia foi executada no sistema de FPLC. O extracto dessalinizado foi filtrado atravs de uma membrana de acetato de celulose (porosidade 0,22 m), tendo sido injectados 6 mL de extracto numa coluna Resource Q 1 mL, previamente equilibrada com tampo 20 mM Tris-HCl, pH 7,5; as protenas foram eludas a um fluxo de 1,5 mL.min-1, com um gradiente de NaCl (0 a 1 M). O valor da absorvncia a 280 nm do eluente foi continuamente lido e registado. Os picos correspondentes rubisco e aos cidos nucleicos foram, em cada cromatograma, identificados pelas suas propriedades de ligao coluna e, por analogia, com cromatogramas idnticos, em que se monitorizou a actividade da rubisco e onde os cidos nucleicos foram identificados pela relao de absorvncias a 260 nm e a 280 nm (Ferreira e Davies, 1987a). A rubisco nativa foi eluda com cerca de 0,3 M de NaCl e a rubisco oxidada entre 0,6 a 0,85 M de NaCl (Fig. 3.1); a confirmao foi obtida por anlise electrofortica em SDS-PAGE. Os picos correspondentes rubisco foram dessalinizados nas colunas PD-10, previamente 44
equilibradas com tampo 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, e, depois de medida a absorvncia a 280 nm, foram congelados em azoto lquido e armazenados a 80 oC at posterior utilizao.
CROMATOGRAFIA DE FILTRAO EM GEL EM FPLC

O pico correspondente rubisco nativa foi concentrado por centrifugao a 14500 g, 1h 45 min, 4 oC, em Centricon-10 (Amicon; limite de excluso molecular de 10 kDa), at um volume final de 2 mL. Seiscentos microlitros foram introduzidos numa coluna de filtrao em gel, Superose 12 HR 10/30, equilibrada em tampo 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, e o pico correspondente rubisco foi recolhido. Foi lida a absorvncia a 280 nm e a soluo foi congelada em azoto lquido e guardada a 80 oC. A
1,0 1,0
1
0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0,8 0,6 0,4 0,2 0,0
50
55
60
65
70
75
Volume (mL)
B
1,0 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Volume (mL) 50 55 60 65 70 75 0,4 0,2 0,0 0,8 0,6
Fig. 3.1 Purificao da rubisco nativa e da rubisco oxidada por cromatografia de troca aninica na coluna Resource Q.
A e B- Foram injectados, na coluna Resource Q, 6 mL de extracto dessalinizado de L. minor, com crescimento em meio completo (A) ou com crescimento em meio contendo 0,5 M de manitol, durante 36 h (B). Pico 1- Rubisco nativa; Pico 2- c. nucleicos; Pico 3- Rubisco oxidada. C- Analise electrofortica, em SDS-PAGE, da rubisco nativa (coluna 1) e da rubisco oxidada (coluna 3). Colunas 4 e 5, marcadores de massa molecular (kDa). P65, polipptido P65; LSU e SSU, subunidades grande e pequena da rubisco, respectivamente.
45
3.2.2 Medio da radioactividade

A determinao da radioactividade das amostras foi feita num contador de cintilaes LS 3801 (Beckman), usando 5 mL de Ready Safe da Beckman, como cocktail de cintilaes. Todas as amostras foram contadas para o trtio, durante 5 min e com 3 repeties. Os resultados so expressos em becquerel, obtido a partir da leitura do n. de cintilaes por minuto, emitidas pelas molculas de flor em consequncia da radioactividade das amostras, e com correco automtica do quenching, i.e., do n. de emisses radioactivas da amostra que no chegam a ser contabilizadas.
3.2.3 Determinao da actividade proteoltica contra a rubisco

A determinao da actividade proteoltica baseia-se no uso de 3H-rubisco como substrato e parte do pressuposto que os produtos de degradao originrios da hidrlise efectuada pelas fraces com actividade proteoltica, provenientes de trigo privado de azoto, permanecem em soluo aps a precipitao das protenas com um cido forte. A determinao da actividade proteoltica decorreu a 25 oC, pH 7,5, na presena de 2 mM ATP e 5 mM MgCl2; a reaco foi interrompida ao fim 6 h pela adio de 10% (m/v) TCA. As amostras foram ento centrifugadas a 10000 g, 10 min, 4 oC e a radioactividade foi medida no precipitado e no sobrenadante. A actividade proteoltica expressa pela percentagem parcial da radioactividade presente no sobrenadante, relativamente soma da radioactividade presente no precipitado e no sobrenadante (Albuquerque et al., 2001):
Bq no sobrenadante x 100 Bq no precipitado + Bq no sobrenadante
% radioactividade =
46
3.2.4 Purificao da protease SBT_Triticum 3.2.4.1 Material Vegetal

Utilizaram-se plantas de trigo com crescimento em meio sem azoto, durante 15 dias, como descrito em 2.2.2.
3.2.4.2 Pr-fraccionamento da protena total solvel de trigo privado de azoto 3.2.4.2.1 Extraco da protena total solvel
As folhas de trigo, de plantas com 26 dias de idade, mas sujeitas, durante 15 dias, a uma ausncia de azoto, foram homogeneizadas em tampo 100 mM TrisHCl, pH 7,5, contendo 1 mM de ditiotreitol (DTT) (2,5 mL por g de peso fresco). O extracto foi clarificado por centrifugao (44000 g, 20 min, 2 oC) e o sobrenadante dessalinizado numa coluna PD-10, previamente equilibrada em gua destilada e desionizada, pH 7,5.
3.2.4.2.2
Aquecimento a 60 oC
O extracto da protena total solvel foi aquecido em banho-maria, durante 10 min, a 60 oC, centrifugado a 44000 g, 10 min, 4 oC, e o sobrenadante congelado em azoto lquido e guardado a 80 oC.
3.2.4.2.3
Liofilizao
O extracto anterior foi liofilizado num liofilizador Micro Modulyo acoplado a uma bomba de vcuo, modelo E2M2, da Edwards. Aps a liofilizao, as amostras foram armazenadas a 80 oC at posterior utilizao.
3.2.4.2.4
Incubao a pH 3,5
As amostras liofilizadas foram ressuspendidas em tampo 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 (0,05 mL.g-1 p.f.), clarificadas por centrifugao (44000 g, 20 min, 4 oC) e introduzidas em colunas PD-10, previamente equilibradas em tampo 20 mM cido frmico, pH 3,5. O eludo foi centrifugado nas mesmas condies e o sobrenadante recolhido.
47
3.2.4.3 Fraccionamento por cromatografia 3.2.4.3.1 Cromatografia de troca catinica em FPLC
O extracto pr-fraccionado foi injectado numa coluna de troca catinica, Resource S 1 mL do sistema FPLC, previamente equilibrada em tampo 20 mM cido frmico, pH 3,5. As protenas foram eludas a um fluxo de 1,5 mL.min-1, com um gradiente de NaCl de 0,025 M por mL de tampo at aos 0,5 M de NaCl e de 0,125 M por mL at 1 M de NaCl. A absorvncia a 280 nm do eluente foi continuamente registada e a actividade proteoltica foi medida em fraces de 1 mL. Observou-se o aparecimento de dois picos com actividade proteoltica: um primeiro pico, eludo dos 0,275 M aos 0,375 M de NaCl (pico A), e um segundo pico, eludo dos 0,4 M aos 0,475 M de NaCl (pico B).
3.2.4.3.2
Cromatografia de afinidade em gel de concanavalina A Sepharose
Neste tipo de coluna de cromatografia de afinidade separam-se dois tipos de fraces: fraco no ligada, fraco que contm protenas que no se ligam ao gel de concanavalina A (Pharmacia); fraco ligada, que contm protenas glicosiladas que se ligam ao gel de concanavalina A e que so eludas com 0,3 M metil--D-glucopiransido. As fraces com actividade proteoltica contra a forma oxidada da rubisco, recolhidas da cromatografia de troca catinica, foram transferidas para tampo 20 mM Tris-HCl contendo 0,5 M NaCl, 1 mM MgCl2 e 1 mM CaCl2, pH 7,4 (tampo de ligao) e introduzidas numa coluna de 1 mL de concanavalina A Sepharose (Pharmacia), previamente equilibrada no mesmo tampo. A coluna foi lavada com 5 mL de tampo de ligao, tendo-se recolhido a fraco no ligada. Foi ento adicionado 12 mL de tampo 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, contendo 0,5 M NaCl e 0,3 M do glucopiransido (tampo de eluio) e a fraco ligada foi recolhida. Para ambos os picos, A e B (ver seco 3.2.4.3.1), a actividade proteoltica foi detectada na fraco ligada.
48
3.2.4.3.3
Cromatografia de filtrao em gel em FPLC
As duas fraces eludas da coluna de concanavalina A, pico A e pico B, foram concentradas por centrifugao a 14500 g, 1h 45 min, 4 oC, em Centricon10, de um volume de 12 mL para um volume final de 1 mL. A fraco de 1 mL foi introduzida numa coluna de filtrao em gel, Superose 12 HR 10/30, equilibrada em tampo 100 mM Tris-HCl, pH 8,0. Durante toda a cromatografia, a absorvncia a 280 nm foi medida e registada. Foram colhidas fraces de 1 mL e a actividade proteoltica medida em cada uma delas.
3.2.4.3.4
Cromatografia de troca aninica em FPLC
As fraces com actividade proteoltica, provenientes da coluna Superose 12, foram injectadas numa coluna de troca aninica Resource Q (1 mL), previamente equilibrada em tampo 20 mM Tris-HCl, pH 8,0. As protenas foram eludas, a um fluxo de 1,5 mL.min-1, com um gradiente de NaCl, de 0,025 M por mL de tampo at aos 0,5 M de NaCl, e de 0,125 M por mL at 1 M de NaCl. A absorvncia a 280 nm do eluente foi continuamente registada e a actividade proteoltica foi medida em fraces de 1 mL. A fraco "pico A" foi eluda entre 0,175 e 0,27 M de NaCl e a fraco "pico B" foi eluda entre 0,2 e 0,27 M de NaCl.
3.2.5 Purificao da protease em FPLC, sem a separao dos picos A e B

Foi efectuada outra purificao da protease, sem utilizao da coluna Resource S e, por isso, sem separao dos picos de actividade proteoltica designados por pico A e pico B. Esta purificao foi efectuada a partir de 230 g de folhas de trigo crescido na ausncia de azoto. A extraco da protena total solvel foi efectuada em 1,25 L de tampo 100 mM Tris-HCl pH 7,5 contendo 4 mM de PMSF. O extracto foi filtrado, aquecido a 60 oC (10 min), centrifugado (44000 g, 20 min, 4 oC), dessalinizado para gua pH 7,5 (PD-10), liofilizado, dessalinizado para tampo 20 mM cido frmico pH 3,5, centrifugado (44000 g, 20 min, 4 oC), dessalinizado para tampo 20 mM Tris-HCl pH 8,0, centrifugado (44000 g, 10 min, 4 oC) e introduzido, por quatro vezes, numa coluna de troca aninica (Resource Q), onde a fraco eluda entre os 175 mM e os 275 mM de
49
NaCl foi recolhida. Esta fraco foi concentrada a 100 L, em Centricon-10, por centrifugao (14500 g, 4 oC), e foram introduzidos 50 L numa coluna de filtrao em gel- Tricorn Superose 12 (Amersham). O eludo foi recolhido em fraces de volume varivel (aproximadamente de 0,5 mL, nas fraces com actividade proteoltica), com base na leitura contnua da absorvncia a 280 nm, sendo a actividade proteoltica foi medida em cada uma das fraces.
3.2.6 Sequenciao interna de dois fragmentos de um polipptido do pico A

A fraco pico A, proveniente da cromatografiade troca aninica em FPLC, foi separada por electroforese e transferncia para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (Applied Biosystems). Para prevenir o bloqueamento da extremidade N-terminal foram efectuadas algumas mudanas na electroforese e transferncia. Todas as solues foram feitas de novo e o SDS utilizado tinha um grau de pureza "ultra-pure". Os gis de poliacrilamida foram sujeitos a uma prelectroforese, durante 30 min a 200 V, contendo 50 M de glutationo no tampo catdico. A electroforese foi depois efectuada com tampo catdico contendo 0,1 mM de cido tiogliclico. A transferncia foi efectuada como descrito em 2.5.1, mas com um tampo de transferncia diferente, constitudo por 10 mM de cido 3-ciclo-hexilamino-1-propanossulfnico em 10 % (v/v) de metanol. A membrana foi corada com Ponceau S e o polipptido A cortado e enviado para: "Microchemical Facility, Emory University School of Medicine, Room 4336 Clinic Building B, Atlanta, GA 30322, USA"; aqui foi efectuada a sequenciao interna de dois fragmentos.
3.2.7 Sequenciao do cDNA da protease SBT_Triticum 3.2.7.1 Material vegetal

Para a sequenciao do cDNA da protease SBT_Triticum utilizaram-se plantas de trigo sujeitas a ausncia de azoto, como descrito em 2.2.2.
50
3.2.7.2 "Primers utilizados

Os primeiros primers utilizados foram desenhados para as sequncias polipeptdicas previamente determinadas para a protease: a sequncia I, composta por 18 resduos de aminocidos "SALMTTAYNLDNSGEIIK", e a sequncia II, composta por 17 resduos de aminocidos
"SGDLNYPAFAAVFEEYK (Albuquerque, 2002). Devido existncia de bases de dados com protenas semelhantes, foi possvel saber que a sequncia 1 se encontrava mais prxima da extremidade N da protena e, por isso, originava um primer do tipo fwd- forward, e que a sequncia 2 originava um primer do tipo rev- reverse. Os primers desenhados resultaram de um compromisso entre o menor nmero de bases degeneradas e o maior nmero de bases: trg+ 5GAYTCNGGNGARATHATHAA-3, para a sequncia I e trg- 5-
AANGCNGGRTARTTNARRTC-3, para a sequncia II. ainda de salientar que as duas ltimas bases dos primers no so degeneradas. No ANEXO I apresenta-se uma lista de todos os primers construdos para a realizao deste trabalho.
3.2.7.3 Metodologia
A metodologia utilizada para a sequenciao da protease encontra-se descrita nas seguintes seces: Extraco de cidos nucleicos (ver seco 2.6); Amplificao de cidos nucleicos por PCR (ver seco 2.7); Clonagem dos produtos de PCR em E. coli (ver seco 2.8); Sequenciao de DNA (ver seco 2.9); Alinhamento e anlise de sequncias (ver seco 2.10). Para alm destes mtodos foram utilizadas as tcnicas 5 RACE (Schaefer, 1995), Tail-PCR (Singer e Burke, 2003) e Inverse PCR (Ochman et al., 1988), tal como descrito nas respectivas publicaes; estas ltimas tcnicas ao contrrio das primeiras, no esto descritas detalhadamente, pois no produziram resultados satisfatrios. O BLAST apresentado nesta tese foi efectuado, com a sequncia final de 571, resduos de aminocidos na base de dados non-redundant protein
51
sequences (nr) do NCBI, com os restantes parmetros em default3, excepto o nmero mximo de sequncias-alvo, que foi elevado para o valor mximo: 20000 sequncias. Estas sequncias foram utilizadas pelo programa Distance tree of results, que efectua um pairwise alignment das sequncias que so visualizadas em rvore pelo mtodo Fast minimun evolution (Desper e Gascuel, 2002) e com 0,55 de diferena mxima entre as sequncias. As sequncias pertencentes ao ramo da SBT_Triticum (grupo 1) e da ARA12 (AT5G67360) (grupo 2) foram seleccionadas para efectuar um novo alinhamento pelo programa ClustalW (Higgins e Sharp, 1989; Thompson et al., 1994), usando a matriz identidade com uma penalizao de 20 para o open gap penalty, com os restantes parmetros em default4. O alinhamento foi editado no programa de visualizao BioEdit, desenvolvido por Tom Hall (Bioedit, 1997).
3.2.8 Produo de anticorpos policlonais anti-LSU, anti-SSU, antiSBT_Triticum e anti-SBT_AT

Os anticorpos so extremamente teis no estudo de protenas, pois, permitem identificar o antignio correspondente numa mistura complexa, como o caso, por exemplo, de um extracto total celular. Por forma a identificar a rubisco e a subtilisina em estudo, foram produzidos anticorpos em coelho e em rato, respectivamente. Os anticorpos produzidos em duas espcies animais diferentes possibilitam o estudo, em simultneo, das duas protenas, pois cada um dos segundos anticorpos seleccionados ser especfico para os IgG de cada um dos animais. Para identificar a rubisco foram produzidos anticorpos em coelho, especficos para cada uma das suas subunidades (anti-LSU abs e anti-SSU abs), aps se proceder purificao da enzima a partir de frondes de Lemna minor. Para se identificar a subtilisina (SBT) produziram-se anticorpos em rato, para as espcies vegetais T. aestivum e A. thaliana; apesar de serem genes muito
Parmetros em default utilizados no programa BLAST: automatically adjust parameter for short input sequences: thicked; expect threshold: 10; word size: 3; matrix: BLOSUM62; gap costs: existence-11, extension 1; conditional compositional score matrix adjustments; no filter; no mask. 4 Parmetros em default utilizados pelo programa ClustalW: end gap penalty: -1, separation gap distance- 4; extending gap penalty- 0.2.
52
semelhantes (3.3.2.1) considerou-se mais prudente utilizar esta estratgia. A purificao da subtilisina de trigo um processo moroso, pouco eficiente, resultando na obteno de quantidades diminutas de protease. Recorreu-se, por isso, produo de polipptidos recombinantes, em E. coli, para o fornecimento dos antignios. Os polipptidos recombinantes produzidos foram purificados e utilizados na imunizao de ratos. Ambos os anticorpos foram produzidos segundo as indicaes de (Harlow e Lane, 1988).
3.2.8.1 Produo de anticorpos anti-LSU e anti-SSU

Os anticorpos para a subunidade grande (LSU) e pequena (SSU) de rubisco foram produzidos como descrito por Esquvel (1995), com pequenas
modificaes.
3.2.8.1.1
Purificao de rubisco nativa
A rubisco nativa foi purificada a partir de frondes de Lemna minor, crescidas em meio completo (ver seco 2.2.1), por cromatografia de troca aninica (coluna Resource Q), seguida de cromatografia de excluso molecular (coluna Superose 12), como descrito em 3.2.1.3. A soluo purificada de rubisco foi quantificada, pela leitura da absorvncia a 280 nm (ver seco 2.3.2). Quatro mg de rubisco purificada foi sujeita a SDS-PAGE em gis de 3 mm de espessura (2.4) e as bandas correspondentes LSU e SSU foram cortadas e maceradas.
3.2.8.1.2
Imunizao em coelhos
Os anticorpos foram produzidos em coelhos adultos nas instalaes do Departamento de Produo Agrcola e Animal do Instituto Superior de Agronomia. Foram imunizados dois coelhos com o antignio para a LSU e dois coelhos com o antignio para a SSU. A primeira imunizao foi efectuada por injeco subcutnea, administrando-se 0,6 mg de cada subunidade em gel de acrilamida com adjuvante de Freund completo e incompleto, na proporo de 1:0,6:0,4 (v/v/v) (respectivamente). Nos restantes reforos, administraram-se 0,6 mg de cada subunidade em gel de acrilamida contendo adjuvante de Freund incompleto,
53
na proporo de 1:1 (v/v). As imunizaes foram efectuadas de acordo com o seguinte calendrio: Dia 0- Recolha de soro pr-imune e 1 inoculao; Dia 19- 1 reforo; Dia 39- 2 reforo; Dia 51- Recolha de soro para teste; Dia 58- 3 reforo; Dia 70- Recolha do soro final por puno cardaca.
3.2.8.1.3
Recolha do soro contendo os anticorpos
Doze dias aps o ltimo reforo (dia 70), foi efectuada a puno cardaca e colhida a mxima quantidade possvel de sangue. O sangue foi deixado a coagular temperatura ambiente durante 30 minutos, findos os quais foi colocado a 4 oC, durante 2 h. Com uma pipeta de Pasteur retirou-se o soro, centrifugou-se a 1000 g, 5 min, e recolheu-se o sobrenadante que, depois de homogeneizado, foi fraccionado, congelado em azoto lquido e guardado a 80 oC. A este soro chamou-se soro A. O cogulo restante foi colocado em cima de um funil de Buckner, incubado durante a noite a 4 oC e o exsudado foi recolhido. Este soro foi tratado como o anterior e denominado tipo B.
3.2.8.2 Produo de anticorpos anti-SBT_Triticum e anti-SBT_AT 3.2.8.2.1 Produo dos antignios, polipptido de SBT_Triticum e polipptido de SBT_AT
Os antignios foram expressos como protenas recombinantes em E. coli, utilizando-se o kit Champion pET Directional TOPO expression KitsInvitrogen. Para isso, foi necessrio clonar o cDNA que codifica os diferentes polipptidos. Este foi obtido em reaco de PCR, utilizando-se como cadeia molde o DNA extrado de trigo, para o antignio SBT_Triticum, ou o DNA extrado de A. thaliana, para o antignio SBT_AT (2.6.1). Utilizaram-se primers fwd, modificados na extremidade 5 de modo a conterem a sequncia CACC, e primers rev que continham o cdo stop (Tabela 2). Na reaco de PCR utilizou-se uma enzima com actividade de proofreading, a Platinum Pfx DNA 54
Polymerase- Invitrogen, e o programa de PCR foi o seguinte: 94 oC, 2 min, seguido de 25 ciclos a 94 oC-30 s, 58 oC-30 s, 68 oC-60 s. Os produtos da reaco foram avaliados em gis de agarose, purificados e ligados ao vector pET151/D-TOPO. Os plasmdeos foram introduzidos em bactrias do tipo TOP10, purificados em coluna de troca inica, sequenciados e introduzidos nas bactrias de expresso BL21 Star(DE3).
Tabela 2 Primers e tamanho esperado dos polipptidos recombinantes.

DNA Primer fwd primer rev bp esperados kDa esperados SBT_Triticum (T1800) Trigo 5'-CACCACGCTGGA GTCCAAGTCGC -3' 5'-CTACCAGCATCC CTACCACATCTC-3' 1736 58,9 SBT_AT (AT) A. thaliana 5'- CACCATTCTTAA ACCGGACGTGAT -3' 5'- CTAACCGGACTC TTAACAACGTGT -3' 779 27,9
3.2.8.2.2
Optimizao da expresso dos polipptidos em E. coli
Aps a introduo dos plasmdeos nas bactrias de E. coli apropriadas para a expresso de polipptidos, as condies de expresso dos polipptidos foram optimizadas, seguindo as orientaes fornecidas no kit referido na seco anterior. Assim, as bactrias cresceram como descrito em 2.2.4, tendo-se optimizado a temperatura de crescimento, o volume do meio de cultura e o tempo de cultura. Primeiro, testou-se o crescimento das bactrias, num volume de 400 mL, em bales de Erlenmeyer; no entanto, este mtodo foi abandonado, devido ao maior risco de contaminao e s dificuldades de manuseamento, durante a centrifugao final para recolha das bactrias. As bactrias passaram a crescer em tubos de Falcon contendo 35 mL de meio LB suplementado com 0,1 mg.mL-1 de ampicilina, os quais aps calibrao, esto prontos para a centrifugao final. As bactrias de expresso, guardadas a 80 oC, em meio contendo glicerol, foram inoculadas em 10 mL de meio LB contendo 100 g/mL de ampicilina e incubadas durante a noite, a 37 oC, com agitao (200 rpm). De seguida, transferiu-se 5 mL deste inculo para um tubo de Falcon, contendo 35 mL de meio LB com antibitico. Aps uma incubao, durante 1 a 2 h, adicionou-se 55
1 mM de isopropil--D-tiogalactopiranosido (IPTG) e as bactrias expressaram os polipptidos temperatura de 25 oC (ambiente) ou de 37 oC, tendo sido recolhias amostras passadas 3 h, 4 h, 5 h e 15 h. As bactrias foram recolhidas por centrifugao a 5100 g, 5 min, ressuspensas em tampo de SBM e sujeitas a SDS-PAGE (ver seco 2.4.1).
3.2.8.2.3
Purificao dos polipptidos recombinantes
As bactrias foram ressuspendidas em 2 mL de tampo de ligao, constitudo por 20 mM Na2HPO4, 0,5 M NaCl e 8 M ureia, pH 7,8, por cada tubo de Falcon. As bactrias foram transferidas para um s tubo, contendo um pouco de areia, e rebentadas por 3 ciclos de congelao em azoto lquido e descongelao, seguido de agitao em vortex. O extracto resultante foi centrifugado a 5100 g, 20 min, 15 oC. O sobrenadante foi introduzido em colunas de nquel com afinidade para as caudas de histidina (Ni-NTA AgaroseInvitrogen), previamente equilibradas em tampo de ligao. As colunas foram extensivamente lavadas com o mesmo tampo, a pH 6,0, e os polipptidos foram eludos com o mesmo tampo, a pH 4,0. O eludo foi recolhido e dialisado, em mangas de dilise (Spectra/Por 1 membrane MWCO: 6000-8000), temperatura ambiente e com vrias trocas de solvente (gua ajustada a pH 7,5). Durante a dilise, observou-se a precipitao dos polipptidos, que foram facilmente recolhidos e concentrados aps centrifugao a 5100 g, 15 min, 4 oC. Os polipptidos foram ressuspensos em tampo 20 mM Tris-HCl pH 7,5, quantificados pelo mtodo de Lowry (ver seco 2.3.1) e sujeitos a SDS-PAGE, em gis de 3 mm de espessura (ver seco 2.4.1). As bandas correspondentes aos polipptidos foram cortadas e maceradas.
3.2.8.2.4
Produo, em rato, dos anticorpos anti-SBT_Triticum e antiSBT_AT
Os anticorpos foram produzidos em ratos (Rattus norvegicus), estirpe Wistar machos com massa corporal entre 150 e 200 g, nas instalaes do biotrio da Faculdade de Medicina Veterinria da Universidade Tcnica de Lisboa. Foram imunizados cinco ratos para cada antignio. A primeira imunizao foi efectuada por injeco subcutnea, administrando-se 0,1 mg de cada polipptido em gel de
56
acrilamida com adjuvante de Freund completo e incompleto, na proporo de 1:0,5:0,5 (respectivamente). Nos restantes reforos, administraram-se 0,1 mg de cada polipptido em gel de acrilamida contendo adjuvante de Freund incompleto, na proporo de 1:1. As imunizaes foram efectuadas de acordo com o seguinte calendrio: Dia 0- Recolha de soro pr-imune e 1 inoculao; Dia 15- 1 reforo; Dia 40- 2 reforo; Dia 52- Recolha de soro para teste; Dia 53- Recolha de soro final por puno cardaca. Treze dias aps o ltimo reforo (dia 53), foi efectuada a puno cardaca colhida a mxima quantidade possvel de sangue. O sangue de rato foi processado como o de coelho (ver seco 3.2.8.1.3).
3.2.8.3 Determinao do ttulo dos anticorpos produzidos

A determinao do ttulo e da especificidade dos anticorpos produzidos foi determinada visualmente pela inspeco de immunoblots preparados com a mesma quantidade de antignio e revelados com diluies crescentes do anticorpo. Preferiu-se este mtodo relativamente aos ensaios de ELISA (Harlow e Lane, 1988), porque permite uma avaliao da sua especificidade.
57
58
3.3 Resultados e discusso 3.3.1 Purificao da protease SBT_Triticum

Uma protease pode ser identificada e, consequentemente, purificada pela sua capacidade de degradar protenas. A capacidade proteoltica de uma protease pode detectar-se por mtodos colorimtricos, utilizando-se um substrato sinttico (Anderson et al., 1995). No entanto, se utilizssemos este mtodo, a chance de purificar uma protease potencialmente envolvida na degradao da rubisco seria muito baixa. Pelo motivo exposto no pargrafo anterior, a purificao da SBT_Triticum foi seguida por monitorizao da sua actividade proteoltica contra um substrato especfico, a 3H-rubisco oxidada, purificado a partir de plantas de Lemna minor incubadas com um aminocido tritiado e sujeitas a um stresse osmtico. Ferreira e colaboradores propuseram, em (2000), que um dos mecanismos para a degradao selectiva da rubisco poder ocorrer aps converso da enzima num substrato susceptvel, envolvendo a seguinte sequncia de acontecimentos:
Enzima nativa 1 Enzima oxidada 1 Enzima polimerizada 2 2 Protelise
Associao s membranas do cloroplasto 2
1- Sistema oxidsico 2- Sistema proteoltico
A utilizao de radioactividade como ferramenta de deteco um mtodo extremamente sensvel e tornou possvel a avaliao da degradao, in vitro, da rubisco, dificilmente revelada por outro mtodo menos perigoso e mais amigo do ambiente. A degradao, in vitro, da rubisco foi avaliada pela percentagem de radioactividade solubilizada aps precipitao da enzima com um cido forte, calculada pela frmula apresentada em 3.2.3, que, ao no necessitar de um valor externo como referncia para determinar a extenso da degradao, permitiu cingir o erro experimental amostra em causa.
59
A protease SBT_Triticum foi extrada a partir de folhas de trigo sujeito a um stresse de ausncia de azoto. Aps a extraco da protena total solvel, efectuou-se um fraccionamento sucessivo das protenas presentes, procedendose determinao da actividade proteoltica em cada fraco, de acordo com o esquema de purificao apresentado na Fig. 3.2.
Folhas de plantas de trigo sujeitas a um stresse de ausncia de azoto Extraco da protena total solvel em tampo pH 7,5, com clarificao do extracto por centrifugao, seguido de dessalinizao em colunas PD-10, previamente equilibradas em gua ajustada a pH 7,5
Medio da actividade proteoltica contra a 3H-rubisco oxidada
Pr-fraccionamento da protena total solvel
Aquecimento do extracto a 60 oC e clarificao da soluo por centrifugao

Liofilizao, suspenso em tampo pH 7,5 e clarificao da soluo por centrifugao

Mudana para tampo a pH 3,5, efectuada em colunas PD-10, incubao durante 10 min e clarificao por centrifugao.
Fraccionamento por cromatografia de troca catinica (Resource S- FPLC)

Seleco das fraces com actividade proteoltica contra a 3H-rubisco oxidada
Pico A
Pico B
Fraccionamento por cromatografia de afinidade (concanavalina A Sepharose)

Fraccionamento por cromatografia de filtrao em gel (Superose 12- FPLC)

Fraccionamento por cromatografia de troca aninica (Resource Q- FPLC)

Pico A
Pico B
Determinao da sequncia de res duos aminocidos de dois fragmentos internos do polipptido A
Subtilisina, SBT_Triticum
Fig. 3.2 Esquema da purificao da protease de subtilisina, SBT_Triticum.

A purificao foi efectuadaa partir de folhas de trigo com 26 dias de idade, sujeito a uma ausncia de azoto durante os ltimos 15 dias de idade.
60
Esta purificao laboriosa e complexa. No entanto, a introduo de algumas modificaes bvias, que simplificariam o processo de purificao, resultaram em perdas de actividade, como foi o caso da extraco directa da protena total solvel em tampo a pH 3,5. Aps o pr-fraccionamento da protena total solvel (Fig. 3.2), utilizou-se a coluna de troca catinica, Resource S em FPLC, tendo o perfil da actividade proteoltica medida sido desdobrado em duas fraces, o pico A e o pico B (Fig. 3.3).
2 2,0
100 1,0
100
A280 (nm) ()
1,0 1 Pico A 1 0,5 Pico B
50 0,5
NaCl (M) (-------)
2 1,5
50
0 0,0 0 10 20 N da fraco 30 40
0 0,0
Fig. 3.3 Perfil da protelise da 3H-rubisco oxidada, em extractos de folhas de trigo em stresse, fraccionados, em FPLC, por cromatografia de troca catinica na coluna Resource S.
Cinquenta gramas de trigo, privado de azoto, foram pr-fraccionados e introduzidos numa coluna Resource S; as protenas foram eludas com um gradiente de NacL (0 a 1M, primeiro eixo do lado direito). Recolheram-se fraces de 1 mL, das quais se utilizou 0,3 mL para medir a actividade 3 proteoltica contra a forma oxidada da H-rubisco (segundo eixo do ladodireito, corresponde % de radioactividade solubilizada aps precipitao da enzima com cido forte (ver seco 3.2.3).
Nos passos de purificao seguintes (Fig. 3.2), o pico A e o pico B foram purificados individualmente e comportaram-se de forma semelhante, com uma diferena no que se refere sua massa molecular nativa. Ambos os picos se ligaram coluna de concanavalina A e foram eludos da coluna Resource Q com,
61
Radioactividade (% ) ( )
sensivelmente, a mesma molaridade de NaCl (pico A: 0,175 a 0,270 M; pico B: 0,200 a 0,270 M). A anlise electrofortica e de actividade proteoltica das fraces resultantes do ltimo fraccionamento, efectuado em FPLC na coluna de troca aninica Resource Q (Fig. 3.2), podem ser observadas na Fig. 3.4.
A
25
B
205 116 97 66 45 29
30 % Radi oacti vid ade
Polipptido A
15
15
0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 N da fraco
3 4 5 6 7 8 9 10 11 N da fraco
Fig. 3.4 Anlise electrofortica em SDS-PAGE (12,5% (m/v) acrilamida) das fraces recolhidas na coluna Resource Q do FPLC, correspondentes ao pico A (A) e ao pico B (B).
Para cada um dos gis utilizou-se 0,6 mL de cada fraco (1 ml) contendo protena e os restantes 0,3 mL foram utilizados para medir a actividade proteoltica. A- O gel foi corado com CBB-R 250; Colunas: fraco eluda 1- sem NaCl; 2- de 0,150 a 0,175 M de NaCl, 3- de 0,175 a 0,200 M de NaCl, 4- de 0,200 a 0,225 M de NaCl, 5- de 0,225 a 0,250 M de NaCl, 6- de 0,250 a 0,275 M de NaCl, 7- de 0,275 a 0,300 M de NaCl, 8- de 0,300 a 0,325 M de NaCl, 9- de 0,750 a 0,875 M de NaCl; coluna 0- marcadores de massa molecular (kDa). Linha Azul- Actividade proteoltica, em % de radioactividade (ver seco 3.2.3). B- O gel B foi corado com nitrato de prata; Colunas. Fraco eluda 1- sem NaCl; 2- de 0,075 a 0,125 M de NaCl, 3- de 0,125 a 0,150 M de NaCl, 4- de 0,150 a 0,175 M de NaCl, 5- de 0,175 a 0,200 M de NaCl, 6- de 0,200 a 0,225 M de NaCl, 7- de 0,225 a 0,250 M de NaCl, 8- de 0,250 a 0,275 M de NaCl, 9- de 0,275 a 0,300 M de NaCl, 10- de 0,300 a 0,325 M de NaCl, 11- de 0,325 a 0,350 M de NaCl; coluna 0- marcadores de massa molecular (kDa). Linha amarela. Actividade proteoltica, em % de radioactividade (ver seco 3.2.3).
No pico A (Fig. 3.4A) foi detectado o polipptido A (SBT_Triticum), com cerca de 75 kDa, em conjunto com muitos outros polipptidos (colunas 3, 4, 5 e 6). Estes polipptidos foram inicialmente reconhecidos como contaminantes, mas a sua natureza desconhecida e ser discutida mais adiante. No pico B (3.4B) no
62
foi possvel visualizar, com segurana, qualquer polipptido. Contudo, possvel detectar um polipptido com ca. de 75 kDa em algumas das fraces com actividade (colunas 6 e 7). A pequena quantidade de protena presente no pico B inviabilizou uma caracterizao da actividade proteoltica pico B nesta fase. Para o pico A, efectuou-se uma caracterizao mais extensa (ver seco 3.3.4). Aps se ter identificado o polipptido A, proveniente da cromatografia de troca aninica em FPLC, como o responsvel pela actividade proteoltica contra a rubisco oxidada, foi enviada uma amostra para sequenciao (ver seco 3.2.6). No tendo sido possvel determinar a sequncia N-terminal deste polipptido, foram determinados dois fragmentos internos, por degradao de Edman, aps uma digesto com tripisina e purificao dos fragmentos resultantes. Os de dois fragmentos internos so compostos um por 18 resduos de aminocidos, "SALMTTAYNLDNSGEIIK", "SGDLNYPAFAAVFEEYK. e outro por 17 resduos de aminocidos,
3.3.2 Sequenciao do cDNA de SBT_Triticum

A sequenciao foi efectuada tendo por base o cDNA, obtido por RT-PCR a partir do mRNA purificado de folhas de trigo sujeito a ausncia de azoto (ver seco 3.2.7), pois foi a partir destas plantas que se purificou a protease. Para a sequenciao do mRNA que codifica esta subtilisina, foram efectuados ca. de 600 PCRs e foram enviados para a Stab Vida 19 produtos de PCR e 56 produtos de PCR inseridos em vector, dos quais 49 foram parcialmente sequenciados. Apenas 12 corresponderam protease da subtilisina em estudo. Nenhuma das tcnicas 5 RACE (Schaefer, 1995), Tail-PCR (Singer e Burke, 2003), Inverse PCR (Ochman et al., 1988) ou a utilizao de primers para sequncia semelhante de arroz resultou na obteno de uma sequncia que alinhasse com alguma das sequncias j determinadas para a SBT_Triticum. O resultado mais comum destas experincias foi um smear ou uma mistura de produtos de PCR. A tcnica 5RACE no deve ter funcionado devido ao grande tamanho do produto esperado, com ca. de 1500 bp. Os primers utilizados na 63
tcnica Tail-PCR foram optimizados para a planta Arabidopsis thaliana, o que pode ter sido o motivo de insucesso. A tcnica Inverse PCR mais complexa e aleatria, uma vez que depende da enzima de restrio utilizada para efectuar o corte do DNA; utilizaram-se trs enzimas de restrio, a Pvu II, EcoR V e a Dra I (Invitrogen) mas, no se conseguiu, de igual modo, obter nenhum produto para esta subtilisina. Alguns factores inerentes prpria sequncia ou semelhana desta sequncia com outras sequncias devem ter contribudo para aumentar a dificuldade da sequenciao. O nmero elevado de subtilisinas presentes na planta de trigo diminui a quantidade de primers disponveis e especficos para a subtilisina em causa: em A. thaliana foram identificadas 56 protenas do tipo subtilisina e em arroz 63 (Rautengarten et al., 2005; Tripathi e Sowdhamini, 2006). A determinao da sequncia do cDNA da protease SBT_Triticum foi iniciada com um PCR cujos primers, degenerados, foram desenhados a partir da sequncia de dois pptidos internos do polipptido A (Fig. 3.4). Este PCR s resultou num produto de PCR com a utilizao de uma DNA polimerase de qualidade (Fast-Taq, fornecida pela Roche) e apenas quando se introduziu na reaco de PCR a soluo GC.Rich da Roche. O produto de PCR foi visualizado por electroforese em gel de 1% (m/v) de agarose e, na coluna 4 da Fig. 3.5, observa-se a presena de um produto de PCR e de um smear. A sequncia deste produto de PCR alinhou com outras subtilisinas conhecidas e foi considerada correcta.
64
2000 1500
600 Sequncia 1 100
Fig. 3.5 Anlise electrofortica em gel de agarose 1% (m/v) do PCR que originou a sequncia 1.
O cDNA foi produzido pela enzima de transcrio reversa, a superscript II (Invitrogen). Foram sujeitos a electroforese 5 L da reaco de PCR (volume final 50 L): 1 e 2- PCR efectuado com a Taq polimerase (Invitrogen) contendo 4 L de cDNA ou 2 L de cDNA, respectivamente; 3 e 4 PCR efectuado com a Fast-Taq (Roche) contendo 4 L de cDNA, sem ou com 10 L da soluo G-C rich, respectivamente; a- marcadores de massa molecular (bp).
A determinao desta sequncia foi fundamental e determinante para a sequenciao da subtilisina SBT_Triticum. De facto, todas as outras sequncias foram sendo obtidas com primers construdos a partir do conhecimento desta sequncia e s foram consideradas as que alinhassem com esta primeira sequncia, ou com produtos dela derivados. Na Fig. 3.6 pode observar-se a montagem das sequncias obtidas, efectuada no programa Codon code. As sequncias 2 e 3 pertencem extremidade 3 e foram facilmente determinadas com o recurso a primers para a cauda poli(A). Todas as outras sequncias no sentido da extremidade 5 foram obtidas com o uso de primers construdos a partir das sequncias consensus para trigo, depositadas na base de dados TIGR- Wheat genome database, com o nmero TC248398 para sequncia 4, e com o nmero TC262307 para as sequncias 5, 6, 7 e 8. Estes dois TCs (Tentative Consensus sequences) so sequncias virtuais que foram criadas pela montagem de sequncias de cDNA, Expressed 65
Sequence Tag (EST) (Quackenbush et al., 2001). A sequncia consensus TC248398 tem 1503 bases, foi a primeira a ser utilizada e alinha com a extremidade 3 da sequncia de SBT_Triticum; a sequncia TC262307 tem 723 bases, foi a segunda a ser utilizada e alinha com a extremidade 5 da sequncia SBT_Triticum.
A
6 7 8 5 2 9 4 1 3
B
Sequncia 1 2 3 Primer fwd trg+ trg2+ trg3+ trg2+ 15+P1725+ 25+ Trgprot1800+ Trgprot1800+ Trgprot100+ Primer rev trgOligodt 3RACE a outer 3RACE a inner 17-P15+ 1515TrgprotTrgprotTrgprotTa ( C) 48 48,5 60 62 63 56 60 65 65 65 1000 400 400 1800 1800 320 Pcr2.1 --Pcr2.1 Pcr2.1 Pet151 Pcr2.1
o
1 PCR 2 PCR
Tamanho (~bp) 200 550 600
Clonagem dos produtos b de PCR em vector ----Pcr2.1
4 5 6 7 8 9
Fig. 3.6 Montagem das sequncias parciais do cDNA que codifica a protease de subtilisina, SBT_Triticum.
A- posio relativa de cada uma das sequncias determinadas; B- primers (ver ANEXO I) e a temperatura de emparelhamento (ta) utilizados para amplificao das sequncias; - primer b fornecido por FirstChoice RLM RACE Kit, Ambion; - vectores fornecidos pela Invitrogen.
66
Determinou-se um fragmento do gene para a protease de trigo SBT_Triticum, com cerca de 1800 bp e correspondente a 571 resduos de aminocidos (Fig. 3.7). Esta sequncia foi depositada na base de dados do NCBI, onde recebeu o nmero de acesso EU431190.
Fig. 3.7 Sequncia parcial para o cDNA da protease de subtilisina, SBT_Triticum (EU431190).
O sublinhado refere-se s sequncias de resduos de aminocidos determinadas: a tracejadosequncia 1 (18 resduos de aminocidos); a contnuo- sequncia 2 (17 resduos de aminocidos). O asterisco representa o cdo stop.
67
No se conseguiu obter a extremidade 5 do cDNA da protease. No entanto, as causas que contriburam para a dificuldade de sequenciao completa do gene transcrito que codifica esta protease podem agora ser esclarecidas. Uma das causas deve-se do elevado teor em bases de citosina e guanina e, consequentemente, formao de estruturas secundrias complexas, mantidas por ligaes electrostticas fortes. Para o fragmento sequenciado, o teor em G-C de 67,8%, mas em fragmentos pequenos e consecutivos chega a atingir valores superiores a 75% (Fig. 3.8).
Sbt_Triticum
90 % (G+C)Total = 67,8
% (G+C)
50
20 0 90 200 400 600 800 nt 1000 1200 1400 1600
RbcL_Triticum
% (G+C)Total = 43,6
% (G+C)
50
20 0 90 200 400 600 nt 800 1000 1200 1400
RbcS_Triticum
% (G+C)Total = 54,5
% (G+C)
50
20 0 200 400 nt 600 800
Fig. 3.8 Clculo do teor em G+C para o cDNA de Sbt_Triticum, RbcL_Triticum e RbcS_Triticum.
Estes clculos foram efectuados no programa Seqool (Copyright 2006 by Magnus Wang), com uma janela de 30 nt. Sbt_Triticum- fragmento sequenciado da protease, com o nmero de identificao do NCBI: EU431190. Como termo de comparao utilizou-se o cDNA, de Triticum aestivum, que codificam as subunidades grande (RbcL) e pequena (RbcS) da rubisco, com a identificao do NCBI de EU492898 e AB042066.1, respectivamente.
68
A presena de estruturas secundrias pode inibir a formao do produto de PCR, por no permitir o acesso dos primers ao mRNA ou ao cDNA, ou por encurtar o produto de uma reaco de RT-PCR. Na Fig. 3.9 pode observar-se a possibilidade de formao de estruturas secundrias no mRNA da protease SBT_Triticum e no mRNA da subunidade grande e pequena da rubisco, destacando-se a elevada energia termodinmica que persiste na estrutura secundria do mRNA da protease, que atinge os 477 kJ/mol a 94 oC (temperatura de desnaturao). A energia contida na estrutura secundria do mRNA da SBT_Triticum pode explicar a dificuldade em obter um produto de PCR e leva normalmente utilizao de maior quantidade de cloreto de magnsio e utilizao de, por exemplo, dimetilsulfxido (DMSO), numa reaco de PCR. Por isso, utilizou-se a soluo GC rich e vrias concentraes de cloreto de magnsio; efectuaram-se, tambm, reaces de RT-PCR com uma polimerase de transcrio reversa resistente a 60 oC (ThermoScript - Invitrogen); no entanto, no se conseguiu sequenciar a extremidade 5 para esta protease. Outra hiptese seria efectuar uma biblioteca de cDNA, mas seria de esperar as mesmas dificuldades, inerentes ao elevado contedo em GC e s estruturas secundrias. Outra hiptese, mais vivel, seria procurar nas bases de dados as sequncias do DNA de trigo, resultantes da sequenciao do genoma de trigo, identificar o DNA da subtilisina, construir primers especficos e verificar o resultado.
69
Sbt_Triticum
25 oC
-4649 kJ/mol
60 oC
-2153 kJ/mol
94 oC
-477 kJ/mol
RbcL_Triticum
25 oC
-2617 kJ/mol
60 oC
-836 kJ/mol
94 oC
-105 kJ/mol
RbcS_Triticum
25 oC
-1580 kJ/mol
60 oC
-589 kJ/mol 94 oC
-79 kJ/mol
Fig. 3.9 Modelos da estrutura RbcL_Triticum e RbcS_Triticum.
secundria
do
mRNA
de
Sbt_Triticum,
A modelao da estrutura secundria foi efectuada no programa RNAFold (Mathews et al., 1999) disponvel no servidor Vienna RNA WebServers (http://rna.tbi.univie.ac.at/). Todos os parmetros do programa foram deixados em default, excepto a temperatura que est indicada na figura. A energia termodinmica contida na molcula obtida pelo programa est indicada na figura. Sbt_Triticum- fragmento sequenciado da protease, com o nmero de identificao do NCBI: EU431190. Como termo de comparao utilizou-se o cDNA, de Triticum aestivum, de RbcL e de RbcS, com a identificao do NCBI de EU492898 e AB042066.1, respectivamente. A estrutura secundria do mRNA apresentada uma entre muitas estruturas possveis.
70
3.3.2.1 Comparao
da
sequncia
SBT_Triticum
com
outras
sequncias de subtilisinas
A sequncia SBT_Triticum foi comparada com outras sequncias depositadas na base de dados do NCBI e o resultado obtido (Fig. 3.10) apresentado sob a forma de distance tree view (ver seco 2.10). Este mtodo sobrepe-se pontuao obtida no BLAST, permitindo inserir esta subtilisina no contexto geral de outras subtilisinas. Este resultado suficiente para as poucas subtilisinas j sequenciadas (e.g. em tomate, apenas 15 subtilisinas foram descritas (Meichtry et al., 1999)) e dispensa, por isso, uma anlise mais completa da distncia a outras subtilisinas (bootstrapped analysis). Como se pode observar, apenas trs espcies esto presentes no mesmo ramo que a SBT_Triticum, a Oryza sativa subsp. japonica, Oryza sativa subsp. indica, Arabidopsis thaliana e Vitis vinifera. Tripathi e Sowdhamini (2006) compararam as subtilisinas de arroz com as de A. thaliana e apenas detectaram 16 genes ortlogos entre si. Um deles, do arroz, Os02g0779200, o mais semelhante com a sequncia SBT_Triticum (score 947, e-value5 0,0), ortlogo do gene AT3G14067 (A. thaliana), tambm ele semelhante com a SBT_Triticum (score 715, e-value 0,0), encontrando-se no mesmo ramo da rvore obtida (grupo 1). A subtilisina mais estudada de A. thaliana, a ARA12 (AT5G67360), com 4 artigos dedicados, encontra-se noutro grupo (grupo 2), o que est de acordo com Rautengarten et al. (2005), que coloca estas duas subtilisinas muito prximas e no mesmo subgrupo, o AtSBT1.
e-Value ou expected value um parmetro estatstico indicativo da probabilidade de encontrar, na base de dados, outro alinhamento semelhante ao apresentado e com um score superior. dependente das caractersticas da base de dados, do score obtido para o alinhamento e do tamanho da sequncia apresentada. Um e-value de zero corresponde ao da probabilidade e o valor mnimo que se pode achar.
71
8e-40
5e-143 4e-149 6e-149 2e-159 1e-158 4e-158 AT3G14240 4e-158 3e-158 3e-66 9e-66 1e-65 2e-66 2e-66 AT4G34980 1e-159 1e-150 2e-151 9e-149 6e-165 1e-161 6e-155 7e-160 4e-155 AT5G1750 3e152 1e-154 3e-154 * 8e-172 2e-170 AT5G67360 2e-167 * 1e-169 * 7e-168 2e-167 * 9e-165 2e-161 3e-161 * 1e-160 * 2e-153 * 1e-167 * 3e-162 1e-126 * 5e-162 AT2G05920 4e-165 4e-156 3e-137 1e-144 1e-144 4e-127 3e-160 3e-128 3e-127 4e-122 3e-118 2e-103 4e-39 8e-38 2e-155 8e-42 7e-141 2e-60 4e-128 AT1G01900 7e-128 4e-128 6e-128 3e-115 5e-123 3e-52 7e-29 2e-15 6e-119 7e-137 9e-173 1e-172 1e-171 4e-168 * 0.0 0.0 * 0.0 0.0 0.0 AT3G14067 * 0.0 * SBT_Triticum * 0.0 0.0 *
Grupo 2
Grupo 1
Fig. 3.10 rvore da distncia entre as subtilisinas semelhantes a SBT_Triticum.

Este mtodo de comparao est disponvel no servidor do NCBI. A distncia entre as sequncias foi determinada pelo mtodo fast minimum evolution e est dependente do alinhamento produzido pelo BLAST. As sequncias apresentadas tm uma distncia mxima de 0,55, esto identificadas pelo seu accession number, seguido da espcie a que pertencem e do e-value obtido no BLAST com a sequncia em aminocidos da SBT_Triticum. As sequncias de A. thaliana esto identificadas com o locus que as codificam.
72
Como j foi referido, na mesma planta existem muitas subtilisinas diferentes que podero desempenhar funes distintas na planta. Essa diferena pode ser explicada por nveis de expresso diferentes, processamentos distintos da protena ou estrutura tridimensional diferente. Em ltima anlise, essas diferenas esto inscritas no cdigo gentico e, pelo menos em parte, devem ser explicadas pela sequncia de nvel primrio das diferentes subtilisinas. Por isso, o estudo da sequncia de uma protena muito importante, uma vez que muitas das suas caractersticas e funes fisiolgicas so definidas pela prpria sequncia. As sequncias presentes no grupo 1 e no grupo 2, assinaladas na Fig. 3.10 com um asterisco, foram alinhadas pelo programa ClustalW (ver seco 3.2.7.3), utilizando-se um threshold for shading de 50%, isto , 50% dos resduos de aminocidos presentes numa determinada posio so semelhantes entre si e encontram-se destacados a cinzento (Fig. 3.11). Como se pode observar, as sequncias so muito semelhantes entre si e partilham os domnios
caractersticos das subtilisinas.
73
Subtilisin_N
Subtilisin_N
Peptidase_S8
Peptidase_S8
Peptidase_S8
******** ******** *********
PA
AprE
** * *
PA
AprE
Peptidase_S8
74
**
AprE Peptidase_S8
AprE
***
** *
**
Fig. 3.11 Alinhamento das sequncias de resduos de aminocidos das subtilisinas dos grupos 1 e 2 (ver Fig. 3.10).
Grupo 1 Grupo 2
1ORYSJ- Q6K7G5; Os02g0779200 de O. sativa subsp. 2SOLLC- P93204; SBT1 de Solanum lycopersicum Japnica 1ORYSI- A2XA86 de Oryza sativa subsp. indica 2POPCA- Q8RVJ1 de Populus canadensis 1WHEAT- EU431190 SBT_Triticum de T. aestivum 2MEDTR- Q2HRK7 de Medicago truncatula 1VITVI (primeira)- A7P6H1 de Vitis vinfera 2TOBAC- A9XG41, SBT1.1B de Nicotiana tabacum 1VITVI (segunda)- A5C2T4 de Vitis vinifera 2ARATH- O65351, ARA12, AT5G67360 de A. thaliana 1ARATH- Q0WWH7, AT3G14067 de A.thaliana 2MUSAC- Q1EPF3 de Musa acuminata 2ORYSJ- OS03g0761500 de O. sativa subsp. Japnica Subtilisin_N- PF05922, regio N-terminal das subtilases, cortada de forma autnoma antes da activao da enzima; Peptidase_S8- PF00082, domnio caracterstico da famlia das subtilases; PA- PF02225, domnio inserido em diversas proteases de plantas; AprE- COG1404, domnio detectado em subtilisinas que pode ter funes de modificaes ps-traduo, reciclagem da protena ou de chaperone; estes domnios so apresentados para a sequncia AT3G14067 (1ARATH), mas so detectados em todas as outras sequncias, embora possam ter limites ligeiramente diferentes (Marchler-Bauer et al., 2005); Destacado a cinzento- Conjunto de sequncias com mais de 50% de resduos de aminocidos semelhantes (threshold for shading); Sublinhado- Possvel local de corte da sequncia sinal (SignalP (Emanuelsson et al., 2007)); * Diferena de aminocidos entre o grupo 1 e 2; Aminocido N-terminal da protena nativa, aps o processamento da extremidade N-terminal do zimognio, atribudo por semelhana; Caixa verde- Possvel centro de N-glicosilao (NetNGlyc 1.0 (Gupta e Brunak, 2002)); apenas so assinalados os locais presentes em todas a sequncias de um grupo; Caixa rosa- Possvel centro de fosforilao, reconhecido pela cinase de casena II (Prosite PS00006; (Pinna, 1990)); apenas so assinalados os centros presentes em todas a sequncias de um grupo; Caixa azul- Possvel centro de fosforilao, reconhecido pela cinase C (Prosite PS0005 (Kishimoto et al., 1985)); apenas so assinalados os centros presentes em todas a sequncias de um grupo; Caixa amarela- Centro activo de serina das subtilases (Prosite PS00138 (Siezen et al., 1991)).
75
As subtilisinas so sintetizadas na forma de zimognio, tornando-se activas aps a remoo do domnio Subtilisin_N; esta remoo parece ser autocataltica (Yamagata et al., 1994; Taylor et al., 1997). O corte decorrente da maturao origina a sequncia N-terminal, iniciada por dois resduos de treonina (TT) para a cucumisina de melo (Yamagata et al., 1994), para uma subtilisina de lrio (Taylor et al., 1997), para uma de aveia (Coffeen e Wolpert, 2004), para a Ara12 de A. thaliana (Hamilton et al., 2003) e para uma subtilisina de trigo (Roberts et al., 2006). Estes dois resduos de treonina esto presentes na maioria das subtilisinas e encontram-se, frequentemente, a uma distncia de 100 a 130 resduos de aminocidos da extremidade N do zimognio. Algumas subtilisinas podem ser novamente processadas e a extremidade C-terminal pode ser removida (Yamagata et al., 1994; Von Groll et al., 2002), tal como acontece com uma subtilisina de tomate, a LeSBT1, cuja maturao autocataltica e dependente do pH do meio (Janzik et al., 2000). Algumas subtilisinas so glicosiladas e o padro N-{P}-[ST]-{P}6 (Gavel e von Heijne, 1990), com elevada probabilidade de ocorrncia, aparece como um possvel centro de glicosilao. No entanto, s uma posio deste padro detectada para todas sequncias do grupo 2 e nenhuma para todas as sequncias do grupo 1. O programa NetNGlyc 1.0 (Gupta e Brunak, 2002) analisa o contexto de todos os resduos de asparagina presentes num polipptido e indica um possvel local de glicosilao contido em todas as sequncias alinhadas. Os centros potenciais de fosforilao de resduos de serina ou treonina, foram pesquisados pelos os padres [ST]-X(2)-[DE] (Pinna, 1990) e [ST]-X-[RK] (Kishimoto et al., 1985), ambos com elevada probabilidade de ocorrncia, e detectados nestas sequncias. Alguns destes centros esto presentes em todas as sequncias, outros apenas so encontrados no grupo 2 ou no grupo 1. Na Fig. 3.11 esto assinalados com um asterisco os resduos de aminocidos que so iguais dentro do mesmo grupo, mas diferentes entre os grupos. Por isso,
A abertura de parntesis recto, [ ], significa a possibilidade de um dos resduos de aminocidos especificados ocupar a posio. A abertura de chavetas, { }, determina a impossibilidade de um dos resduos de aminocidos especificados ocupar a posio. A presena de X, determina a possibilidade de qualquer resduo de aminocido poder ocupar a posio ou posies quando seguida do nmero de posies dentro de parntesis. Alguns padres incluem, ainda, a definio de pontuaes para determinados resduos de aminocidos em determinadas posies.
76
estes aminocidos podero conferir as caractersticas prprias e distintivas de cada grupo que podem conduzir a diferentes formas de regulao, a diferentes especificidades para os substractos e/ou a diferentes funes.
3.3.3 Produo de anticorpos policlonais: anti-LSU, anti-SSU, antiSBT_Triticum e anti-SBT_AT

A produo de anticorpos requer o fornecimento aos animais de quantidades apreciveis de antignios, proporcionais ao peso do animal (Harlow e Lane, 1988). Os antignios para as subunidades grande e pequena da rubisco (LSU e SSU) foram obtidos pela purificao de rubisco de plantas de L. minor, com crescimento em meio completo. Aps electroforese em SDS-PAGE da rubisco purificada, os polipptidos LSU e SSU foram excisados e utilizados com o antignio (ver 3.2.8.1). Os antignios para as subtilisinas de Arabidopsis thaliana (SBT_AT) e trigo (SBT_Triticum) foram obtidos por expresso de polipptidos recombinantes em E. coli (ver seco 3.2.8.2). Os anticorpos foram produzidos em coelhos, para anti-LSU e anti-SSU, e em ratos, para anti-SBT_AT e anti-SBT_Triticum. Deste modo, possvel detectar, na mesma amostra, a presena dos dois antignios.
3.3.3.1 Expresso e purificao de polipptidos recombinantes para fragmentos das subtilisinas SBT_AT e SBT_Triticum
Para se obter a quantidade necessria de antignio, para a imunizao de quatro ratos (por cada polipptido), procedeu-se expresso de dois polipptidos em bactrias de E. coli geneticamente transformadas, de modo a conterem a informao necessria. A informao necessria foi fornecida s bactrias na forma de um plasmdeo contendo o cDNA codificante do polipptido; um deles, corresponde a um fragmento da subtilisina de T. aestivum (570 resduos de aminocidos) e o outro, corresponde a um fragmento da subtilisina de A. thaliana (261 resduos de aminocidos). Estes plasmdeos foram sequenciados e a
77
identidade do cDNA foi confirmada. A traduo em aminocidos da sequncia de cada cDNA pode ser consultada no ANEXO II. A quantidade de polipptido produzido pelas bactrias depende da temperatura de crescimento e do tempo de incubao. As bactrias foram incubadas temperatura de 25 oC ou de 37 oC, durante 3, 4, 5 e 15 h e o extracto total destas bactrias foi analisado em SDS-PAGE (Fig. 3.12). A produo do polipptido, avaliado pelo aparecimento de uma banda distinta, ocorre aps a adio de IPTG, a qualquer uma das temperaturas estudadas, e mantm-se at ao final da incubao. Optou-se, por isso, por manter as bactrias temperatura ambiente e incubadas durante a noite, aps a induo da expresso.
T1800 25 C
0 1 2 3 4 5 6 a b 8 7 0 1
T1800 37 C
2 3 4 5 6 7 8 a 205 116 66 45 29
AT 25 C
a 0 1 2 3 4 5 6 7 8 b
AT 37 C
0 1 2 b a 3 4 5 6 7 8
66 45 36 29 24 14
Fig. 3.12 Estudo de expresso de protenas recombinantes em E. coli

T1800: polipptido fragmento da protease SBT_Triticum; AT: polipptido fragmento da protease SBT_AT. Colunas 0, 1, 3, 5 e 7: expresso do poliptido no induzida; colunas 2, 4, 6 e 8: expresso do polipptido induzida por adio de IPTG; 0- zero h de induo, correspondente a 3 h de cultura das bactrias; 1 e 2- 3 h depois da induo; 3 e 4- 4 h depois da induo; 5 e 6- 5 h depois da induo, 7 e 8- 15 h depois da induo. Colunas a e b: marcadores de massa molecular (kDa)
78
Aps a expresso dos polipptidos, pelas bacrrias, procedeu-se extraco da protena total em tampo de ligao para colunas de afinidade para as caudas de histidinas, mtodo pelo qual os polipptidos recombinantes foram purificados (ver seco 3.2.8.2.3). Ao longo do processo de purificao, recolheram-se amostras que foram sujeitas a SDS-PAGE, permitindo a avaliao da purificao dos polipptidos recombinantes (Fig. 3.13).
a1 2
3 4 5 6
7 8
66 45 36 29 24 14
T1800 AT
Fig. 3.13 Purificao na coluna de afinidade dos polipptidos recombinantes produzidos em E. coli.
Aps a produo dos polipptidos em E. coli, procedeu-se sua extraco e purificao em coluna de Ni-NTA Agarose (ver seco 3.2.8.2.3). As fraces recolhidas foram sujeitas a SDSPAGE: Colunas 1 a 4- polipptido recombinante da protease SBT_AT (AT); colunas 5 a 8polipptido recombinante da protease SBT_Triticum (T1800); colunas 1 e 5- Extracto total de E. coli introduzido na coluna de afinidade; colunas 2 e 6- Fraco do extracto que no se liga coluna de afinidade; colunas 3 e 6- fraco que eluda no tampo de lavagem; colunas 4 e 8fraco que eluda no tampo de eluio. Coluna a- marcadores de massa molecular (kDa);
Na soluo purificada do polipptido AT (SBT_AT) observa-se a presena, em grande quantidade, de um nico polipptido, ao contrrio da soluo purificada do polipptido T1800 (SBT_Triticum), que contm mltiplos
polipptidos. A soluo purificada do polipptido T1800 aparece bastante contaminada, mas, estes polipptidos podem resultar da (auto) degradao da protease e podem conter a cauda de histidinas, sendo, por isso, concentrados e purificados. De qualquer modo, os polipptidos, depois de serem quantificados, foram sujeitos a SDS-PAGE e a banda correspondente ao polipptido em causa foi utilizada como antignio, eliminando-se eventuais contaminaes que possam existir aps a purificao.
79
3.3.3.2 Avaliao e determinao do ttulo dos anticorpos produzidos

A revelao de um immunoblot por um anticorpo depende, entre outros factores (e.g. fora inica da soluo tampo), da quantidade de antignio presente e da diluio do anticorpo utilizada. Assim, tentou-se reproduzir as condies experimentais em que se iriam utilizar os anticorpos, colocando-se no gel de electroforese uma quantidade elevada de antignio e determinando-se a diluio de anticorpo que melhor revela os polipptidos alvo. Para os anticorpos anti-LSU e anti-SSU, realizou-se um immunoblot contendo a mesma quantidade de um extracto de protena solvel de plantas de L. minor. Este immunoblot foi cortado s tiras e cada tira foi revelada com diluies crescentes do anticorpo produzido (Fig. 3.14).
10
11
12
13
P65 LSU
SSU
Fig. 3.14 Determinao do ttulo dos anticorpos anti-LSU e anti-SSU, produzidos em coelhos
Immunoblots de 10 L (1-5) ou 15 L (6-13) de extracto total de protena solvel de frondes de L. minor foram revelados com os seguintes anticorpos: anti-LSU na diluio de: 1- 1:500, 2- 1:1000, 3- 1:2000, 4- 1:3000, 5- 1:5000; anti-SSU (coelho 1) na diluio de: 6- 1:500, 7- 1:1000, 8- 1:2000, 9- 1:3000; anti-SSU (coelho 2) na diluio de: 10- 1:500, 11- 1:1000, 12- 1:2000, 13- 1:3000.
O anticorpo para a LSU foi considerado especfico. O anticorpo para a SSU tambm se liga subunidade grande de rubisco e tambm ao P65, um polipptido formado pela ligao covalente entre a SSU e a LSU (Ferreira et al., 1996; Wilson
80
e Greenberg, 1999). Para os anticorpos anti-LSU e anti-SSU considerou-se apropriado a utilizao de uma diluio de 1:500. A avaliao do anticorpo anti-SBT_Triticum foi efectuada, para um dos animais, em immunoblot, ou com o polipptido T1800 purificado (Fig. 3.15A) ou num extracto de trigo (Fig. 3.15B), em que a subtilisina foi concentrada por liofilizao, aps o aquecimento do extracto a 60 oC (ver seco 3.2.4.2). A avaliao do anticorpo anti-SBT_AT foi efectuada, para um dos animais, em immunoblot apenas com o polipptido recombinante AT purificado (antignio) (Fig. 3.15C).
A
1 2 3 4 1 2 3 4 5
B
6 1 2 3
SBT_Triticum Polipptido T1800 Polipptido AT
Fig. 3.15 Determinao do ttulo dos anticorpos anti-SBT_Triticum e anti-SBT_AT, produzidos em ratos.
A: Anticorpo anti-SBT_Triticum: em cada coluna do gel foi colocado 15 g do polipptido T1800 purificado e o immunoblot foi revelado com diluies crescentes do anticorpo anti-SBT_Triticum; colunas: diluio 1- 1:300, 3- 1:500, 4- 1:3000; coluna 2- marcadores de massa molecular corados. B: Anticorpo anti-SBT_Triticum: em cada coluna do gel foi colocado 10 L de extracto de protena o solvel de trigo, aps aquecimento a 60 C e liofilizao; o immunoblot foi revelado com diluies crescentes do anticorpo; colunas: diluio 1- 1:500, 2- 1:1000, 4- 1:2000, 5-1:4000, 6- 1:8000; 3marcadores de massa molecular corados. C: Anticorpo anti-SBT_AT: em cada coluna do gel foi colocado 15 g do polipptido AT purificado e o immunoblot foi revelado com diluies crescentes do anticorpo anti-SBT_AT; colunas: diluio 1- 1:300, 2- 1:500, 3- 1:3000.
O anticorpo anti-SBT_Triticum reconhece mais do que um polipptido, quer utilizando o polipptido purificado quer utilizando-se o extracto de trigo. Os polipptidos presentes na soluo purificada do polipptido T1800 j haviam sido detectados quando se efectuou a purificao, especulando-se se poderiam ser o resultado de degradao deste polipptido. Se assim fosse, seriam reconhecidos 81
pelo anticorpo. Para clarificar esta dvida realizou-se um immunoblot com o extracto total das bactrias de expresso, contendo o plasmdeo para a expresso do polipptido T1800, e ao longo do perodo de incubao (Fig. 3.16). Neste immunoblot verifica-se que o anticorpo SBT_Triticum especfico para o polipptido, uma vez que se detecta apenas uma banda tnue nas bactrias cuja expresso do polipptido no foi induzida (ver coluna 6 da Fig. 3.16), mas muitas bandas ou mesmo um smear quando as bactrias foram induzidas a expressar o polipptido recombinante. Este smear aumenta ao longo do perodo de expresso do polipptido, sendo mais forte no final do perodo de incubao, evidenciando o aumento de produo do polipptido T1800. Os polipptidos detectados no immunoblot para o extracto de trigo (Fig. 3.15B) sero objecto de um estudo mais pormenorizado (3.3.4).
A
m
B
m
250
75 50
25
Fig. 3.16 "Immunoblotting" do extracto total de bactrias recombinantes para o polipptido T1800 (SBT_Triticum) revelado com anticorpos anti-SBT_Triticum.
A blot revelado com Ponceau S; B- immunoblotting revelado com o anticorpo antiSBT_Triticum na diluio de 1:1000; coluna m- marcadores corados de massa molecular; colunas 1 e 6: 8 uL de extracto total de bactrias no induzidas: 0 h e 15 h aps o incio da induo, respectivamente; colunas 2, 3, 4 e 5: 8 uL de extracto total de bactrias induzidas durante 3 h, 4 h, 5 h e 15 h, respectivamente.
82
O anticorpo para a subtilisina de A. thaliana (anti-SBT_AT), reconhece o polipptido puro recombinante (Fig. 3.15C); as outras bandas visveis no "immunoblot" foram consideradas derivaes (polimerizao, degradao ou ambas) do polipptido recombinante, semelhana do que foi detectado para o polipptido recombinante SBT_Triticum. Para os anticorpos anti-SBT_Triticum e anti-SBT_AT considerou-se apropriado a utilizao de uma diluio de 1:1000.
3.3.4 Caracterizao bioqumica da SBT_Triticum

A protease foi purificada a partir de folhas de trigo sujeito a uma ausncia de azoto durante 15 dias, tendo sido seleccionada do extracto total de protenas solveis devido sua capacidade de degradar a rubisco in vitro, ou na sua forma nativa, ou, mais extensamente, na sua forma oxidada (Fig. 3.17). A purificao da protease foi efectuada com base nas caractersticas especficas da SBT_Triticum que, tal como outras subtilisinas, glicosilada, termoestvel (60 oC, 10 min), suporta a liofilizao e a exposio a valores baixos de pH (3,5).
25 20 15 10 5 0 0 3 6 Tempo (h) 9 12
Fig. 3.17 Actividade proteoltica da protease, SBT_Triticum, contra a forma nativa e oxidada da 3H-rubisco.
A actividade foi medida em tampo 20 mM Tris-HCl, a pH 7,5 e 25 C, contra a forma H-rubisco oxidada, com (vermelho claro) ou sem (vermelho escuro) 2 mM ATP e 5 mM MgCl2, ou contra a 3 forma H-rubisco nativa, com (azul claro) ou sem (azul escuro) 2 mM ATP e 5 mM MgCl2. As barras verticais representam o desvio padro de trs replicados independentes.
o 3
83
Aps a purificao da SBT_Triticum (fraco pico A), efectuou-se uma electroforese bidimensional da SBT_Triticum, composta por uma electroforese nativa, seguida por uma electroforese desnaturante (seco 2.4). Na elecroforese nativa (Fig. 3.18A) detectaram-se duas protenas, 1 e 2, que foram extradas do gel e separadas em duas fraces: uma fraco foi sujeita a electroforese desnaturante (SDS-PAGE) (Fig. 3.18B), onde se detectaram, para cada uma das protenas, dois polipptidos com ca. de 80 kDa e 75 kDa; a outra fraco foi utilizada para medir a actividade proteoltica contra a forma oxidada da 3H-rubisco (Fig. 3.18C). Foi, ento, sugerido que a protease presente no pico A correspondesse a duas isoformas, cada uma das quais constituda por dois polipptidos, enquanto que a protease presente no pico B fosse constituda apenas por um polipptido com capacidade cataltica (Fig. 3.3). No entanto, quer a isoforma 1 quer a isoforma 2 parecem ser formadas por sobreposio dos dois polipptidos, detectados na electroforese desnaturante, e podem corresponder ao zimognio ou enzima nativa, ou, ainda, resultar de outras alteraes pstraduo da protease como, por exemplo, diferentes nveis de glicosilao ou de fosforilao. de realar a proporo diferencial dos dois polipptidos detectados na isoforma 1 e na isoforma 2; na isoforma 1 o polipptido de maior massa molecular existe em maior quantidade do que na isoforma 2.
84
3 1
205 116 97 66 1 2 45 29
30
C C
% Radioac tividade
20
10
0 1 2 Amostra n 4
Fig. 3.18 Anlise bidimensional da subtilisina, SBT_Triticum.

A- Electroforese nativa da protease SBT_Triticum, aps o ltimo fraccionamento do pico A em cromatografia de troca catinica (ver seco 3.2.4.3). O gel foi corado com 0,3 M CuCl2 (mtodo de negative staining) e foram extradas duas isoformas, 1 e 2. B- A isoforma 1 (coluna 1) e a isoforma 2 (coluna 2), retiradas do gel nativo, foram sujeitas a SDS-PAGE e o gel foi corado com nitrato de prata; coluna 3. marcadores de massa molecular (kDa). C- Medio da actividade 3 proteoltica das bandas retiradas do gel nativo (A) contra a forma oxidada da H-rubisco: 13 isoforma 1, 2- isoforma 2; 4- controlo: H-rubisco incubada em tampo Tris-HCl, pH 7,5.
3.3.4.1 Reconhecimento dos dois picos de actividade purificados (A e B), pelos anticorpos produzidos
Durante a purificao da protease e com a utilizao da coluna de troca catinica, Resource S em FPLC, o perfil da actividade proteoltica desdobrou-se em duas fraces, o pico A e o pico B (Fig. 3.3). A protease presente no pico A corresponde protease SBT_Triticum e foi utilizada para efectuar toda a caracterizao bioqumica. A protease pico B est presente em menor quantidade e difcil de detectar num gel de electroforese (SDS-PAGE), mesmo aps uma colorao por nitrato de prata (Fig. 3.4); por isso, no foi caracterizada, ficando por esclarecer a sua identidade. Produziram-se anticorpos contra a subtilisina de trigo e contra a subtilisina de A. thaliana. Os anticorpos produzidos pelos ratos resultaram do fornecimento de antignios artificiais (polipptidos recombinantes), desconhecendo-se se o 85
procedimento tinha sido adequado. Os dois anticorpos produzidos foram utilizados para identificar a protease SBT_Triticum (pico A) e esclarecer a identidade do pico B. Assim, as fraces pico A e pico B, purificadas segundo o mtodo descrito em 3.2.4.3 e de acordo com o esquema apresentado na Fig. 3.2, foram sujeitas a immunobloting (Fig. 3.19). Ambos os anticorpos produzidos, anti-SBT_Triticum e anti-SBT_AT, reconhecem a SBT_Triticum presente no pico A (Fig. 3.19A). Neste immunoblot detectam-se mltiplos polipptidos, os principais foram identificados como SBT_Triticum.1 (80 kDa), SBT_Triticum.2 (74 kDa), SBT_Triticum.3
(68 kDa) e SBT_Triticum.4 (59 kDa). A fraco pico B (Fig. 3.19B) tambm reconhecida pelo anticorpo antiSBT_Triticum (o reconhecimento pelo anticorpo anti-SBT_AT no foi efectuado), sendo revelado um polipptido de 74 kDa do mesmo tamanho que
SBT_Triticum.2. A quantidade diminuta desta fraco poder explicar a aparente ausncia dos outros polipptidos, embora sejadetectado neste blot-2 apresena de quantidades diminutas de outros polipptidos.
1 A 2 m1 B 3 m2
250
SBT_Triticum.1 SBT_Triticum.2 SBT_Triticum.3 SBT_Triticum.4
100
100 75 50 37
50 36
25
10
Fig. 3.19 Reconhecimento da protease de subtilisina, presente no pico A e no pico B, pelos anticorpos produzidos.
A e B Immunoblot de 10 g de pico A (A) e de toda a amostra do pico B (B) purificados de folhas de trigo crescido em meio sem azoto; 1- coluna revelada com anti-SBT_AT abs 1:500, 2coluna revelada com anti-SBT_Triticum abs 1:500; 3- coluna revelada com anti-SBT_Triticum abs 1:1000; m1 e m2 marcadores de massa molecular (kDa).
86
Na fraco pico A, o anticorpo anti-SBT_Triticum reconhece diferentes polipptidos que podero resultar de nveis distintos de degradao ou de autodegradao, de diferentes processamentos da protease SBT_Triticum, da expresso de diferentes genes semelhantes de subtilisina, ou de uma combinao entre si. A massa molecular do SBT_Triticum.1 deve corresponder a pr-protease inactiva, por semelhana com muitas outras subtilisinas, cuja massa molecular esperada de ca. de 80 kDa. Os restantes polipptidos podem resultar de novos processamentos da protease, ou da auto-protelise limitada, como referido para uma subtilisina de tomate, a LeSBT1 (Janzik et al., 2000). A cucumisina, uma das primeiras subtilisinas purificadas, presente no melo (fruto), tem capacidade autocaltica que se mantm no tampo de electroforese (com 2% (m/v) SDS e 4 M ureia) e nos procedimentos de rotina para o SDS-PAGE que envolvem a fervura da amostra (Yamagata et al., 1989). Tambm as subtilisinas SAS1 e SAS2 tm capacidade autoproteoltica, tendo sido sugerido que possam resultar de diferentes modificaes ps-traduo (Coffeen e Wolpert, 2004). A subtilisina ARA 12 apresenta, em SDS-PAGE, apenas um polipptido com 76,5 kDa (Hamilton et al., 2003). Outra subtilisina de A. thaliana, a SDD1, composta por dois polipptidos com ca. de 73 e 63 kDa, o ltimo resultante do processamento da extremidade C-terminal do polipptido de 73 kDa (Von Groll et al., 2002). Roberts et al. (2003; 2006) purificaram duas subtilisinas de trigo, a subtilisina P1 e a subtilisina P2. A subtilisina P2 pode corresponder protease SBT_Triticum (polipptido SBT_Triticum.2), pois possui uma sequncia interna com 13 resduos de aminocidos idnticos SBT_Triticum e uma massa molecular de 78 kDa. Mas, ao contrrio da SBT_Triticum, s estvel a temperaturas inferiores a 40 oC. Por este motivo e por ter apenas 13 resduos de aminocidos conhecidos, no possvel identificar com segurana a subtilisina em causa, podendo, por exemplo, corresponder ARA12 de A. thaliana ou a outra subtilisina. A subtilisina P1, que est presente apenas nas folhas senescentes e no induzida por privao de azoto, tem uma massa molecular de 59 kDa e poderia corresponder ao polipptido SBT_Triticum.4. No entanto, apresenta uma carga elctrica neutra a
87
pH 7,5 diefrente da carga elctrica da protease SBT_Triticum (negativa para as mesmas condies) e estvel a temperaturas inferiores a 50 oC. Ambas as subtilisinas, P1 e P2, so reconhecidas pelo mesmo anticorpo; porm, resultam da expresso de genes diferentes. Aqueless autores relatam o aparecimento consistente do polipptido P1 (59 kDa) quando a quantidade do polipptido P2 (78 kDa) aumenta, o que tambm pode reflectir o processamento de P2 (se este processamento resultar num polipptido com massa molecular idntica a P1). Podem existir vrios nveis de controlo da actividade das subtilisinas, entre elas, a maturao ou a degradao da protena por protelise limitada de um polipptido maior. Este tipo de processamento conduziria a uma diminuio do polipptido maior; no entanto, este consumo pode estar a ser compensado por um aumento de expresso do seu gene.
3.3.4.2 Reconhecimento da protease pelo anticorpo anti-SBT_Triticum em extractos totais de folhas de trigo sujeito a stresse.
O anticorpo anti-SBT_Triticum foi utilizado no reconhecimento de
polipptidos, sujeitos a immunoblotting e provenientes de extractos de folhas de trigo sujeito a ausncia de azoto. A extraco da protena total (ver seco 3.2.4) foi efectuada na presena ou ausncia de 2 mM PMSF; aps a dessalinizao, uma parte do extracto foi preparada para SDS-PAGE e a outra parte foi aquecida a 60 oC, as protenas solveis foram recuperadas, aps concentrao por precipitao em acetona, e preparadas para SDS-PAGE. As amostras foram submetidas a immunoblotting e reveladas com o anticorpo anti-SBT_Triticum (Fig. 3.20). A utilizao de PMSF durante a extraco parece proteger a protena total de degradao (Fig. 3.20A, colunas 1 e 2 e colunas 3 e 4), mas no diminuiu o nmero de polipptidos reconhecidos pelo anticorpo (Fig. 3.20B, colunas 1 e 2 e colunas 3 e 4), o que indica que estes j se encontram presentes nas folhas antes de se iniciar a extraco ou que so produzidos durante o aquecimento do extracto a 60 oC. As massas moleculares estimadas para os polipptidos mais abundantes so de 80, 74, 68 e 59 kDa para SBT_Triticum.1, SBT_Triticum.2, SBT_Triticum.3 e SBT_Triticum.4, respectivamente. 88
A
m
250 100 75 50 37 25
B
1 2 3 4
4 m
10
a
Fig. 3.20 Reconhecimento, pelo anticorpo anti-SBT_Triticum, de polipptidos presentes em extractos de protena solvel de folhas de trigo sujeito a stresse.
Um extracto dessalinizado contendo a protena total solvel de 10 mg de folhas de trigo (p.f.) foi preparado na presena de 2 mM de PMSF (1 e 3) ou na ausncia de qualquer inibidor (2 e 4). Uma parte dos extractos foi de imediato preparada para electroforese (1 e 2) e outra parte foi o aquecida a 60 C durante 10 min, centrifugada, concentrada (4x) por precipitao com acetona e preparada para electroforese (3 e 4). A- blot revelado com Ponceau S; B- immunoblot revelado com o anticorpo anti-SBT_Triticum, na diluio 1:1000.
3.3.4.3 Determinao da massa molecular da subtilisina A e B em condies no desnaturantes

As fraces pico A (SBT_Triticum) e pico B, separadas na coluna Resource S (Fig. 3.3) foram individualmente sujeitas a cromatografia de filtrao em gel na coluna Superose 12 do FPLC (Fig. 3.21). A fraco "pico A" foi eluda com um mximo de actividade proteoltica aproximadamente aos 11,5 mL, a que corresponde uma massa molecular estimada em 150 kDa, enquanto que a fraco "pico B" foi eluda com um pico mximo de actividade proteoltica aproximadamente aos 12,5 mL, a que corresponde uma massa molecular estimada de 86 kDa (Fig. 3.21A). Realizou-se uma outra purificao da SBT_Triticum, na qual no se utilizou a coluna Resource S e onde os picos A e B no foram separados (ver seco 89
3.2.5). A fraco com actividade, previamente purificada, foi concentrada e introduzida numa coluna de Superose 12 (Tricorn) (Fig. 3.21B). Nesta coluna, as fraces com actividade foram eludas com um volume de eluio entre os 11,5 e os 12,5 mL, com o pico centrado aos 12,3 mL (avaliado pela leitura de A a 280 nm). A estes volumes de eluio correspondem massas moleculares entre 140 kDa e 67 kDa, com o pico centrado aos 84 kDa.
0.6 0.5 A280 (linha) 0.4 0.3
50
40
30
20 0.2 0.1 -0.1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 10
0.6 0.5 A280 (linha) 0.4 0.3 0.2 0.1 -0.1 0 1 2 3 4 5 6 7 8
50 % radioactividade (tracejado)
40
30
V VI VIII VII IV
20
III I II
10
0 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Volume de eluio (mL)
Fig. 3.21 Determinao da massa molecular da subtilisina (A e B), em condies no desnaturantes, por filtrao em gel.
A- Cromatografia por filtrao em gel, na coluna Superose 12 do FPLC, dos picos A (azul) e B (verde) (em separado). B- Cromatografia por filtrao em gel, na coluna Superose 12 do FPLC, de uma outra purificao, sem separao dos picos A e B. A absorvncia a 280 nm foi lida e registada (linha a cheio). As fraces foram recolhidas manualmente e foi determinada a actividade 3 protelitica contra a forma oxidada da H-rubisco (linha a tracejado).
90
% radioactividade (tracejado)
As protenas presentes nas fraces assinaladas na Fig. 3.21B foram sujeitas a immunobloting (Fig. 3.22). Mais uma vez, so detectados, pelo anticorpo antiSBT_Triticum, mltiplos polipptidos que apresentam massas moleculares, em condies desnaturantes, entre 80 kDa e 37 kDa. partida, esperar-se-ia que a distribuio dos polipptidos pelas diferentes fraces estivesse ordenada de forma decrescente, de acordo com a massa molecular e com a separao efectuada na coluna de filtrao em gel. No entanto, a revelao destes polipptidos pelo anticorpo est relacionada com a quantidade de SBT_Triticum presente na amostra: quanto maior a quantidade de subtilisina, maior o nmero de polipptidos detectados. Isto sugere que a protease, semelhana do que acontece com outras subtilisinas (e.g. LeSBT1 de tomate), sofre autodegradao aps o processo de purificao (Fig. 3.19).
A
m 1 2 3 4 5 6 7 8 m m 1 2 3 4 5 6 7
8 m
B
250
SBT_Triticum.1 SBT_Triticum.2
75 50 37 25
10
Fig. 3.22 Immunoblot do fraccionamento da protease SBT_Triticum por nova filtrao em gel na coluna Superose 12.
Immunoblot das fraces recolhidas (I a VIII) durante o fraccionamento numa coluna de filtrao em gel (Fig. 3.21B); A- blot revelado com Ponceau S; B- immunoblot revelado com o anticorpo anti-SBT_Triticum, na diluio de 1:1000.
Os resultados e a bibliografia sobre o assunto sugerem fortemente que as bandas que se vem na Fig. 3.22B resultam de autodegradao. No entanto, podero existir dois tipos de subunidades (polipptidos), com uma ligeira 91
diferena de massa molecular. Esta diferena poder ser to simples como uma ser glicosilada e outra no, ou uma ser mais glicosilada do que a outra. O pico A poderia, assim, representar uma dimerizao entre duas subunidades iguais e o pico B poderia ser um monmero isolado de cada uma das duas subunidades.
3.3.4.4 Influncia da fosforilao na actividade da SBT_Triticum

A anlise da sequncia do cDNA da SBT_Triticum mostra que esta protena pode ser fosforilada (Fig. 3.11). Algumas enzimas so reguladas pelo estado de fosforilao dos seus resduos de serina, treonina ou tirosina existentes em motivos estruturais especficos. As fosfatases e as cinases so enzimas que regulam o estado de fosforilao das protenas-substrato, podendo retirar ou adicionar grupos fosfato ligados a resduos de aminocidos especficos (resduos de serina, treonina ou tirosina). Estudou-se a influncia da desfosforilao da protease na sua actividade proteoltica para a forma oxidada da rubisco, na presena ou ausncia de ATP (Fig. 3.23). Neste ensaio, pode observar-se que a presena de ATP aumentou muito ligeiramente a extenso da reaco proteoltica. O tratamento da protease com fosfatase cida de batata no provocou uma diminuio da actividade da enzima per si; contudo, aps o tratamento com a fosfatase, observou-se um efeito inibitrio do ATP, com reduo de 20% na actividade proteoltica.
92
50
% Radioactividade
3
40 30 20 10 0
e P e P ATPte as +AT fatas AT s e+ pr ote ase+ fosa tas e+ a o r ote prote ase +fos f mp se pr ote ase pr
Fig. 3.23 Efeito do tratamento da protease com fosfatase cida de batata, na sua actividade proteoltica para a rubisco oxidada.
Cem microgramas de H-rubisco oxidada foram incubados, durante 6 h, em tampo Tris-HCl pH 7,5 na presena de 5 mM ATP e 2 mM MgCl2 (sem protease+ATP), com 3 g de protease na ausncia de ATP (protease), ou na presena de 5 mM ATP e 2 mM MgCl2 (protease+ATP); com 3 g de protease previamente incubada em tampo PIPES 40 mM, 1 mM DTT, pH 5, durante o 20 min e 30 C com 15 U/mL de fosfatase cida de batata; a reaco foi terminada com 10 mM de pirofosfato de sdio, que foi removido por filtrao em gel e a protease transferida para tampo Tris-HCl pH 7,5, onde a actividade foi medida na ausncia de ATP (protease+fosfatase) ou na presena de 5 mM ATP e 2 mM MgCl2 (protease+fosfatase+ATP).
A partir desta experincia no possvel determinar a extenso da inibio, pois no foi determinada a percentagem inicial de protena fosforilada, nem foi determinada a extenso da reaco de desfosforilao. No entanto, esta experincia evidencia uma forma potencial de regulao da actividade desta protease, dependente do estado de fosforilao e da disponibilidade de ATP. Podero, ento, ocorrer duas situaes: uma, em que a protease sensvel ao ATP, quando se encontra desfosforilada, e outra, em que a protease insensvel ao nvel de ATP, quando se encontra fosforilada.
93
94
4 RELACIONAMENTO
DA DEGRADAO DA RUBISCO COM A SUBTILISINA,
SBT_TRITICUM E SBT_AT
4.1 Introduo
No captulo anterior identificou-se uma subtilisina capaz de degradar a rubisco. A purificao desta protease no decorreu ao acaso: para a sua seleco utilizou-se um substrato especfico; a rubisco oxidada, e condies de pH (7,5) e temperatura (25 oC) que tendem a excluir as enzimas caractersticas dos vacolos. No entanto, a degradao da rubisco foi detectada in vitro, desconhecendo-se se esta protease poder ser responsvel pela degradao da rubisco, in vivo. O turnover da rubisco em plantas superiores depende do estado fisiolgico e de desenvolvimento da planta. Durante o crescimento dos tecidos
fotossintticos, a enzima acumula-se progressivamente em consequncia de uma sntese contnua e uma degradao praticamente inexistente, alcanando a sua mxima concentrao pouco depois da expanso foliar mxima. Durante a senescncia, a sua sntese diminui drasticamente e a rubisco degrada-se intensamente, favorecendo a mobilizao de nutrientes at aos tecidos de reserva e rgos em crescimento (Ferreira et al., 2000). De acordo com vrios autores, o contedo em rubisco varia de acordo com os nveis de sntese das suas subunidades (Cheng et al., 1998; Crafts-Brandner et al., 1998; Crafts-Brandner et al., 1996; Jiang et al., 1993; Nivison e Stocking, 1983; Rodermel, 1999) e alguns trabalhos sugerem que a sua sntese seja dirigida pelo nvel de transcrio do gene da subunidade pequena (RbcS) (Barraclough e Ellis, 1979; Cheng et al., 1998; Khrebtukova e Spreitzer, 1996; Kleinkopf e Huffaker, 1970; Nie et al., 1995; Rodermel et al., 1996; Rodermel et al., 1988), correlacionando-se, tambm, com o nvel de transcritos do gene da subunidade grande (RbcL) e, nomeadamente, com a quantidade de azoto disponvel para a planta (Imai et al., 2005). Irving e Robinson (2006) descreveram uma equao para o contedo celular de rubisco em plantas de trigo, referindo que uma equao do primeiro grau e que, portanto, a quantidade de rubisco
95
controlada pela taxa de sntese. De acordo com os mesmos autores, esta equao no explica a degradao que ocorre durante a senescncia, perodo para o qual esta no , por isso, aplicvel. Pode assumir-se que a degradao da rubisco possvel desde o incio da formao dos tecidos fotossintticos, a uma taxa quase negligencivel, mas presente, com o mximo a ocorrer na altura da senescncia. Outra indicao para a existncia de degradao contnua de rubisco o facto de, em situaes de stresse moderado, a sua quantidade baixar em consequncia do declnio da sntese das suas subunidades (Crafts-Brandner et al., 1998). Assim, ao pesquisar uma(s) protease(s) que esteja envolvida na degradao da rubisco, em condies fisiolgicas normais ou de stresse, e tendo em conta o seu nvel de transcritos, parece razovel admitir-se que tem de estar presente desde o incio do desenvolvimento foliar, acompanhar os nveis de rubisco e aumentar a sua actividade durante a senescncia. Considerando o exposto, durante a senescncia podero ocorreram dois processos concorrentes: a dimiuio drstica da expresso da rubisco e o aumento da actividade das proteases envolvidas na sua degradao em condioes normais, no exclundo o aparecimento de proteases expecficas da senescncia como a protease de cistena SAG12 (Lohman et al., 1994), mas inclundo a possibilidade da existncia de um sistema proteoltico permanente e que aumenta a sua expresso durante a senescncia. Permanece alguma incerteza quanto localizao celular da degradao da rubisco; tem sido observada em cloroplastos isolados, mas no se exclui a existncia de uma degradao vacuolar (ver seco 1.1) ou uma participao de proteases vacuolares. Tentou-se, pelos motivos expostos, co-localizar, no espao e no tempo, a degradao da rubisco com a presena da protease. Aps se ter sequenciado parcialmente o mRNA que codifica a protease SBT_Triticum e, subsquentemente, identificado a subtilisina correspondente em A. thaliana, analisaram-se os nveis de transcritos da SSU e da SBT_AT em vrios tecidos de A. thaliana, recorrendose aos resultados das experincias de microarray efectuadas por muitos investigadores e depositadas nas bases de dados. 96
Relacionamento da degradao da rubisco com a subtilisina, SBT_Triticum e SBT_AT
Os anticorpos produzidos foram utilizados para estudar a presena simultnea da protease e da rubisco, em folhas de trigo e durante o crescimento em meio completo e em meio sem azoto. Estes anticorpos foram, tambm, utilizados para determinar a localizao celular da SBT_Triticum em folhas de trigo, atravs da tcnica de microscopia de imunofluorescncia, e nos cloroplastos, aps a sua purificao.
97
98
4.2 Material e mtodos 4.2.1 Metodologia utilizada para pesquisar proteases envolvidas na degradao da rubisco em Arabidopsis thaliana. 4.2.1.1 Seleco de loci codificantes de proteases
A informao sobre os genes de A. thaliana foi consultada na base de dados The Arabidopsis Information Resource- TAIR (Huala et al., 2001). Esta base de dados foi inquirida com as palavras (em ingls) protease (TAIR, 2007b) ou metalloendopeptidase (TAIR, 2007a), obtendo-se 660 loci anotados com alguma das duas palavras.
4.2.1.2 Seleco de experincias de microarray

Seleccionaram-se as experincias de microarray efectuadas com o chip AT1:22k da Affymetrix. Este chip composto por probe set, que so um conjunto de 8 sequncias diferentes de, normalmente, 25 nucletidos, distribudas ao acaso no chip, constituindo cada sequncia uma sonda para determinar o nvel de expresso do(s) locus(loci) que essas sondas representam. Este chip contm 22750 probe set que representam 23750 genes (Redman et al., 2004). Estas experincias de microarray foram efectuadas de acordo com um protocolo comum a todos os autores. O sinal obtido em cada experincia objecto de uma anlise matemtica, que efectua a normalizao dos dados e determina a fiabilidade da experincia. Os resultados so posteriormente depositados em diversas bases de dados (e.g. AtGenExpress, que significa Arabidopsis thaliana gene expression e que contm uma seleco de experincias de microarray). O chip AT1:22k foi construdo especificamente para a espcie de Arabidopsis thaliana e nele esto representados 82,5% dos loci anotados como protease na base de dados TAIR. Os restantes 17,5% dos loci, no tm uma probe set associada e o seu nvel de transcrio no revelado com o uso deste chip. Para se proceder a um estudo mais pormenorizado, as experincias de microarray foram agrupadas por anatomia, cuja descrio pode ser consultada na Tabela 3. 99
As correlaes efectuadas nas folhas de A. thaliana compreendem as experincias de microarray includas nos grupos: juvenile leaf, adult leaf, cauline leaf e senescent leaf.
Tabela 3 Seleco de experincias de microarray por anatomia

Tissue Seedling Samples ATGE_2_A,ATGE_2_B,ATGE_2_C ATGE_3_A,ATGE_3_B,ATGE_3_C ATGE_1_A,ATGE_1_B,ATGE_1_C ATGE_1_A,ATGE_1_B,ATGE_1_C ATGE_2_A,ATGE_2_B,ATGE_2_C Tissue Sepals Stamens
Mature pollen
Cotyledon Hypocotyl
Samples ATGE_34_A,ATGE_34_B,ATGE_34_C ATGE_41_A,ATGE_41_B,ATGE_41_C ATGE_36_A,ATGE_36_B,ATGE_36_C ATGE_43_A,ATGE_43_B,ATGE_43_C ATGE_73_A,ATGE_73_B,ATGE_73_C
Radicle ATGE_3_A,ATGE_3_B,ATGE_3_C Pedicels ATGE_40_A,ATGE_40_B,ATGE_40_C Inflorescence ATGE_76_A,ATGE_76_B,ATGE_76_C Siliques ATGE_76_A,ATGE_76_B,ATGE_76_C ATGE_77_D,ATGE_77_E,ATGE_77_F ATGE_77_D,ATGE_77_E,ATGE_77_F ATGE_78_D,ATGE_78_E,ATGE_78_F ATGE_78_D,ATGE_78_E,ATGE_78_F ATGE_79_A,ATGE_79_B,ATGE_79_C Seeds ATGE_79_A,ATGE_79_B,ATGE_79_C ATGE_81_A,ATGE_81_B,ATGE_81_C ATGE_81_A,ATGE_81_B,ATGE_81_C ATGE_82_A,ATGE_82_B,ATGE_82_C ATGE_82_A,ATGE_82_B,ATGE_82_C ATGE_83_A,ATGE_83_B,ATGE_83_C ATGE_83_A,ATGE_83_B,ATGE_83_C ATGE_84_A,ATGE_84_B,ATGE_84_D ATGE_84_A,ATGE_84_B,ATGE_84_D ATGE_33_A,ATGE_33_B,ATGE_33_C Stem ATGE_27_A,ATGE_27_B,ATGE_27_C ATGE_39_A,ATGE_39_B,ATGE_39_C Node ATGE_28_A2,ATGE_28_B2,ATGE_28_C2 ATGE_37_A,ATGE_37_B,ATGE_37_C Shoot apex ATGE_29_A2,ATGE_29_B2,ATGE_29_C2 ATGE_35_A,ATGE_35_B,ATGE_35_C ATGE_8_A,ATGE_8_B,ATGE_8_C ATGE_34_A,ATGE_34_B,ATGE_34_C Cauline ATGE_26_A,ATGE_26_B,ATGE_26_C ATGE_45_A,ATGE_45_B,ATGE_45_C leaf ATGE_42_B,ATGE_42_C,ATGE_42_D Rosette ATGE_19_A,ATGE_19_B,ATGE_19_C ATGE_41_A,ATGE_41_B,ATGE_41_C ATGE_21_A,ATGE_21_B,ATGE_21_C ATGE_43_A,ATGE_43_B,ATGE_43_C ATGE_20_A,ATGE_20_B,ATGE_20_C ATGE_40_A,ATGE_40_B,ATGE_40_C ATGE_12_A,ATGE_12_B,ATGE_12_C ATGE_28_A2,ATGE_28_B2,ATGE_28_C2 ATGE_13_A,ATGE_13_B,ATGE_13_C ATGE_36_A,ATGE_36_B,ATGE_36_C ATGE_14_A,ATGE_14_B,ATGE_14_C ATGE_26_A,ATGE_26_B,ATGE_26_C ATGE_15_A,ATGE_15_B,ATGE_15_C ATGE_29_A2,ATGE_29_B2,ATGE_29_C2 ATGE_16_A,ATGE_16_B,ATGE_16_C ATGE_8_A,ATGE_8_B,ATGE_8_C ATGE_17_A,ATGE_17_B,ATGE_17_C ATGE_6_A,ATGE_6_B,ATGE_6_C ATGE_25_A,ATGE_25_B,ATGE_25_C ATGE_27_A,ATGE_27_B,ATGE_27_C ATGE_89_A,ATGE_89_B,ATGE_89_C Juvenile ATGE_5_A,ATGE_5_B,ATGE_5_C leaf Flower ATGE_33_A,ATGE_33_B,ATGE_33_C Adult leaf ATGE_19_A,ATGE_19_B,ATGE_19_C ATGE_39_A,ATGE_39_B,ATGE_39_C ATGE_21_A,ATGE_21_B,ATGE_21_C ATGE_37_A,ATGE_37_B,ATGE_37_C ATGE_20_A,ATGE_20_B,ATGE_20_C ATGE_35_A,ATGE_35_B,ATGE_35_C ATGE_12_A,ATGE_12_B,ATGE_12_C ATGE_34_A,ATGE_34_B,ATGE_34_C ATGE_13_A,ATGE_13_B,ATGE_13_C ATGE_45_A,ATGE_45_B,ATGE_45_C ATGE_14_A,ATGE_14_B,ATGE_14_C ATGE_42_B,ATGE_42_C,ATGE_42_D ATGE_15_A,ATGE_15_B,ATGE_15_C ATGE_41_A,ATGE_41_B,ATGE_41_C ATGE_16_A,ATGE_16_B,ATGE_16_C ATGE_43_A,ATGE_43_B,ATGE_43_C ATGE_17_A,ATGE_17_B,ATGE_17_C ATGE_40_A,ATGE_40_B,ATGE_40_C
100
Tissue Carpels Petals
Samples ATGE_37_A,ATGE_37_B,ATGE_37_C ATGE_45_A,ATGE_45_B,ATGE_45_C ATGE_35_A,ATGE_35_B,ATGE_35_C ATGE_42_B,ATGE_42_C,ATGE_42_D
Tissue Samples Senescence ATGE_25_A,ATGE_25_B,ATGE_25_C leaf" Root ATGE_9_A,ATGE_9_B,ATGE_9_C
4.2.1.3 Relao entre a expresso do gene RbcS e de cada uma das proteases (coeficiente de correlao de Pearson)
O estudo da relao entre o gene RbcS e de cada uma das proteases foi efectuado por anlise do grfico de expresso gentica do RbcS versus a expresso gentica da protease em causa, calculando-se, tambm, o coeficiente de correlao de Pearson. Os grficos e o coeficiente de correlao de Pearson foram produzidos na pgina Gene Correlator do Genevestigator (Zimmermann et al., 2004), com as variveis transformadas para a escala logartmica de base 2. O valor deste coeficiente pode ser consultado no ANEXO III. Para esta anlise seleccionaram-se 920 experincias de microarray, realizadas com a planta de Arabidopsis thaliana do ectipo Columbia 0 (col-0) e wild-type. Na Fig. 4.1, aqui exposta a ttulo de exemplo, pode observar-se a correlao positiva entre o transcrito de RbcS e RbcL, ou a falta de correlao entre o transcrito de RbcS e SAG12 (protease de cistena exclusivamente associada senescncia). A observao destes grficos permitiu excluir grande parte dos loci anotados como protease, estabelecendo-se como limite de excluso todos os loci com um coeficiente de correlao de Pearson inferior a 0,3. Mais tarde, alguns dos loci assim excludos foram reintroduzidos neste estudo, por razes que so apresentadas mais frente.
101
A
r2=0,329
B
r2=0,018
RbcS
RbcL
SAG12
Fig. 4.1 Relao entre a expresso dos genes de RbcS e RbcL (A), e entre a expresso dos genes RbcS e SAG12 (B), em A. thaliana.
Foram seleccionadas 920 experincias de microarray, efectuadas no chip AT1:22k com a planta de A. thaliana, col-0 e wild-type; os grficos foram efectuados na pgina do Gene Correlator do Genevestigator, com as variveis transformadas para Log2 e ajustadas. Os transcritos esto identificados com nome do gene, com a probe set utilizada e o respectivo Locus.
Ambos os transcritos esto presentes; Ambos os transcritos esto ausentes; Varivel em x presente e em y ausente; Varivel em y presente e em x ausente.
4.2.1.4 Agrupamento pela distncia euclidiana e por anatomia, dos loci com um coeficiente de correlao de Pearson superior a 0,3
Os loci anotados como protease na base de dados TAIR e com uma expresso gentica relacionada com a expresso do gene RbcS, foram agrupados na pgina Meta-Analyzer do Genevestigator. A verso deste programa de computador s permite a comparao de 50 probe set de cada vez. Por isso, seleccionaram-se os loci com um coeficiente de correlao de Pearson superior a 0,3. Foi realizado um agrupamento pela distncia euclidiana e por anatomia, com as varveis transformadas para a escala Log2 e ordenadas pela distncia mais pequena entre todas as distncias do mesmo par (complete linkage).
4.2.1.5 Outras bases de dados consultadas

Para efectuar uma anlise mais rigorosa, a expresso de algumas proteases foi consultada na base de dados da pgina The Bio-Array Resource Arabidopsis Functional Genomics- BAR (Winter et al., 2007). Esta base de dados oferece ao 102
utilizador um esquema da planta de A. thaliana cuja cor varia consoante a expresso do gene seleccionado. Assim, seleccionaram-se outros genes que apresentaram uma distribuio de sinal presente em todas as folhas e com uma expresso maior nas folhas caulinares e nas folhas senescentes. Os valores da expresso gentica foram retirados desta base de dados, para serem objecto de uma anlise mais controlada. A intensidade de transcrio de alguns loci de A. thaliana foi retirado desta base de dados, para as folhas da roseta n 2, n 4, n 6, n 8, n 10, n 12 e folhas senescentes (ver ANEXO IV). Foi consultada outra base de dados sediada na pgina The SubCellular Proteomic Database (SUBA) (Heazlewood et al., 2007), dedicada concentrao de informao sobre a localizao celular, quer determinada por programas informticos quer determinada experimentalmente. A pesquisa bibliogrfica geral foi efectuada nas bases de dados do NCBI e do ScienceDirect, utilizando-se tambm o motor de busca Google.
4.2.1.6 Agrupamento hierrquico das protease seleccionadas

De todos os 660 loci anotados com a palavra protease ou
metalloendopeptidase, seleccionaram-se apenas 14 para efectuar uma anlise mais controlada e rigorosa. Os valores do sinal destas proteases foram retirados da base de dados BAR e as experincias de microarray foram manualmente agrupadas como descrito na Tabela 3. O programa Gene Cluster (Eisen et al., 1998) foi utilizado para efectuar um agrupamento hierrquico com average linkage, onde o valor do sinal da expresso gentica foi centralizado pela moda do valor de expresso do gene e normalizado. O dendograma produzido foi visualizado no programa Tree View, tambm disponvel na pgina do Eisen Lab.
103
4.2.2 Avaliao do teor de rubisco e de SBT_Triticum em folhas de trigo com crescimento em meio completo ou sujeito a ausncia de azoto 4.2.2.1 Material vegetal
Utilizaram-se plantas de trigo com crescimento em meio completo durante 12 dias (tempo zero), seguidos de dois tipos de tratamento: com crescimento em meio completo, durante mais 15 dias (tempo 15), ou em meio sem azoto, durante mais 15 dias, tal como descrito na seco 2.2.2. Colheram-se trs tipos de folhas: a segunda folha, a terceira folha e a quarta folha. Da segunda folha foram retiradas amostras no tempo zero, no tempo 5 (5 dias aps a imposio do tratamento), no tempo 10 (10 dias aps a imposio do tratamento) e no tempo 15. Da terceira e quarta folha foram colhidas amostras no final do tratamento (15 dias aps a imposio do stress). A quarta folha foi colhida na sua totalidade (folhas inteiras). O comprimento total da terceira e segunda folha foi medido e dividido em 5 partes, colhendo-se a parte basal (parte imediatamente acima da bainha da folha), a parte mdia (correspondente ao meio da folha) e a parte terminal (correspondente ao fim da folha). A nomenclatura que permite identificar cada amostra est descrita na Tabela 4; os valores do peso fresco, do comprimento da folha e da protena total solvel podem ser consultados no ANEXO V. Tabela 4 Descrio das amostras de folhas recolhidas.
Tempo* 0 N da folha 2 Soluo nutritiva** C parte da folha*** b m m b m t b m t b m t b m t designao da amostra 0_2_CS_b 0_2_CS_m 0_2_CS_t 5_2_C_b 5_2_C_m 5_2_C_t 5_2_S_b 5_2_S_m 5_2_S_t 10_2_C_b 10_2_C_m 10_2_C_t 10_2_S_b 10_2_S_m 10_2_S_t
11
104
15
b 15_2_C_b m 15_2_C_m S b 15_2_S_b 3 C b 15_3_C_b m 15_3_C_m t 15_3_C_t S b 15_3_S_b m 15_3_S_m t 15_3_S_t 4 C i 15_4_C_i S i 15_4_S_i *Dias decorridos aps os primeiros 12 dias de crescimento em soluo nutritiva completa. **C- soluo nutritiva completa; S- soluo nutritiva sem azoto. ***b- parte basal; m- parte mdia; t- parte terminal; i- folha inteira.
4.2.2.2 Extraco e doseamento da protena total solvel

Aps a recolha das amostras (trs para cada tipo de amostra), procedeu-se extraco da protena total solvel em tampo Tris-HCl pH 7,5 (12 mL.g-1 p.f.) contendo 4 mM de PMSF. O extracto total foi clarificado por uma centrifugao a 8000 g, durante 15 min a 4 oC. A protena total solvel de todas as amostras foi quantificada em trs repeties por amostra, pelo Mtodo de FluoroProfile (ver seco 2.3.3) e os valores mdios destas determinaes podem ser consultados no ANEXO V.
4.2.2.3 Electroforese e immunoblotting

Retirou-se uma poro de cada amostra, contendo 15 g de protena total solvel, que se submeteu a SDS-PAGE, em gis de 0,7 mm de espessura, como descrito na seco 2.4.1, e os polipptidos foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose (ver seco 2.5). A mesma membrana foi revelada primeiro com o anticorpo anti-SBT_Triticum produzido em rato, na diluio 1:1000 e, depois da fosfatase alcalina ligada ao segundo anticorpo produzido contra anticorpos de rato ter sido neutralizada por imerso da membrana em 12,5% (v/v) de c. actico durante 15 min, a membrana foi equilibrada em tampo PBS_T a 0,05% (v/v) e revelada com anti-LSU abs produzidos em coelho, na diluio de 1:500.
105
4.2.3 Deteco de rubisco em razes de Pinus pinea 4.2.3.1 Preparao do material vegetal
As razes com ca. de 1 cm de dimetro foram colhidas em rvores adultas, num pequeno de pinhal de Pinus pinea L. existente na Tapada da Ajuda. As razes foram lavadas com gua destilada, descascadas, pesadas e congeladas em azoto lquido, procedendo-se de imediato extraco da protena total solvel.
4.2.3.2 Extraco da protena total solvel

As razes foram maceradas em azoto lquido e a protena total solvel foi extrada em tampo (2 mL.g-1 p.f.) 200 mM de Tris-HCl pH 7,5, contendo 4 mM de PMSF, com ou sem 10 mM de cido L-ascrbico. O extracto foi clarificado por centrifugao a 44000 g, durante 15 min e a 4 oC, sendo dessalinizado em colunas PD-10, previamente equilibradas em tampo 50 mM Tris-HCl pH 7,5. A fraco proteica foi de imediato preparada para electroforese.
4.2.3.3 Electroforese e immunoblotting

As amostras foram preparadas e sujeitas a electroforese como descrito em 2.4.1. O immunoblot foi efectuado como descrito na seco 2.5, utilizando-se o anticorpo contra a rubisco nativa, na diluio de 1:500, produzido por Esquvel et al. (1998).
4.2.4 Purificao de cloroplastos

Todos os procedimentos foram efectuados no frio. Os cloroplastos de folhas de trigo com crescimento em meio completo e em meio sem azoto, foram purificados em gradientes descontnuos de sacarose, segundo a tcnica descrita por Joyard e Douce (1979). As folhas de trigo foram cortadas aos bocadinhos, maceradas suavemente em tampo de purificao de cloroplastos, 50 mM Hepes pH 7,6, contendo 10 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EDTA e 0,5 M sacarose, e incubadas em gelo, durante 10 min. O extracto foi passado por 4 camadas de
106
gaze e centrifugado a 600 g, 10 min, 4 oC; a acelerao e desacelerao do rotor foram colocadas no mnimo. O sobrenadante desta pequena centrifugao foi desprezado e os cloroplastos, gentilmente ressuspendidos em 2 mL de tampo 10 mM tricinaNaOH, pH 7,6, contendo 0,6 M sacarose, que foram colocados sobre um gradiente descontnuo de sacarose. O gradiente foi preparado, desde a base at ao topo, com 3 mL de 1,5 M sacarose, 3 mL de 1,0 M sacarose e 3 mL de 0,75 M sacarose, em tampo 10 mM tricina-NaOH, pH 7,6. De seguida, efectuou-se uma centrifugao a 2000 g, 18 min, 2 oC, num rotor basculante, na ultracentrfuga Beckman, modelo XL-90. Os cloroplastos intactos sedimentaram na interface 1,0 M/1,5 M do gradiente de sacarose e foram recolhidos para um tubo de Falcon. Adicionou-se 20 mL de tampo de extraco e centrifugou-se como no incio do processo. O sobrenadante foi desprezado e os cloroplastos gentilmente ressuspendidos na soluo remanescente (que no se conseguiu retirar, de volume varivel). A integridade dos cloroplastos foi verificada por inspeco em microscpio ptico, colocando-se 5 L da soluo contendo os cloroplastos purificados sobre uma lmina e visualizando-se no microscpio identificado na seco 4.2.5.4. Na Fig. 4.2 podem observar-se alguns dos cloroplastos purificados.
Fig. 4.2 Observao de cloroplastos purificados em microscpio ptico.

Detalhe, da ampliao de 1000x, de uma lmina contendo 5 L da soluo de cloroplastos purificados provenientes de folhas de trigo com crescimento em meio completo. Os cloroplastos foram visualizados com a objectiva de 100x.
107
4.2.5 Preparao de lminas para microscopia de imunofluorescncia

Este trabalho foi estruturado de forma a tonar possvel co-localizar a SBT_Triticum e a rubisco numa preparao para microscopia de fluorescncia, utilizando-se a tcnica FRET- Fluorescent Resonance Energy Tranfer, um caso particular de Frster Resonance Energy Transfer (Lakowicz, 2006). A tcnica de FRET baseia-se na transferncia de energia entre dois fluorforos compatveis. A eficincia na transferncia de energia proporcional ao inverso da sexta potncia da distncia a que os dois fluorforos se encontram e est dependente das propriedades espectrais do fluorforo doador de energia e do fluorforo receptor. O raio de Frster definido quando a distncia entre os dois fluorforos origina 50% de eficincia na transferncia de energia. Esta tcnica , por isso, utilizada em estudos de co-localizao, porque a transferncia de energia entre os dois fluorforos s ocorre se estes se encontrarem muito prximos, a uma distncia inferior a 10 nm (Lakowicz, 2006).
4.2.5.1 Escolha dos fluorforos

Os fluorforos foram escolhidos para serem compatveis com a ocorrncia de FRET. Para isso, o espectro de emisso do fluorforo dador deve sobrepe-se ao espectro de absoro do fluorforo receptor. Escolheram-se dois fluorforos, acoplado a cada um dos segundos anticorpos uilizados: o Alexa 488 goat anti-rat IgG e o Alexa 555 goat anti-rabbit IgG da Molecular Probes. A sonda Alexa 555 no a mais indicada para o filtro utilizado, perdendo-se grande parte do espectro de emisso, e sobrepe-se, em parte, autofluorescncia dos cloroplastos, o que pode vir a ser resolvido pelo uso de um filtro de emisso barrado para comprimentos de onda superiores a 620 nm. Por vezes, foi tambm utilizado o fluorforo di-hidrocloreto 4, 6-diamina-2-fenilindole (DAPI) para marcao de ncleos. Na Fig. 4.3 podem ser observados os espectros dos fluorforos combinados com os filtros fornecidos pela Zeiss:
Filtro azul - Filter set 01, excitao (ex.) com band pass (BP) 365/12 nm e emisso (em.) com long pass (LP) 397 nm, filtro utilizado para visualizar o fluorforo DAPI;
108
Filtro verde - Filter Set 09, ex. BP 450-490 e em. LP 515, filtro utilizado para visualizar o fluorforo Alexa 488; Filtro verde barrado - Filter Set 46, ex. BP 500/20 e em. BP 535/20, filtro utilizado para visualizar o fluorforo Alexa 488; Filtro vermelho - Filter Set 14, ex. BP 510-566 e em. LP 590, filtro utilizado para visualizar o fluorforo Alexa 555.
nm
nm
nm
Fig. 4.3 Espectro de fluorescncia dos vrios fluorforos e filtros utilizados.

A, B, C, D- Espectros obtidos com o programa Fluorescence spectra viewer disponibilizado pela Molecular probes. Tracejado- espectros de absoro, contnuo- espectros de emisso; linha a verde- Alexa Fluor 488 acoplado a um anticorpo; linha a vermelho- Alexa Fluor 555 acoplado a um anticorpo; linha a azul- DAPI ligado ao DNA. A- Filtro vermelho, utilizado para visualizar o fluorforo Alexa 555; B- Filtro verde, utilizado para visualizar o fluorforo Alexa 488; C- Filtro azul, utilizado para visualizar o fluorforo DAPI; D- filtro verde barrado, filtro utilizado para visualizar o fluorforo Alexa 488 F- Espectro de emisso fluorescente da clorofila; linha a cinzento- clorofila a, em metanol e excitada a 417 nm; linha a vermelho- clorofila b, em metanol e excitada a 435 nm. Adaptado de Du et al. (1998).
4.2.5.2 Fixao, montagem e permeabilizao do material vegetal

Este mtodo foi efectuado de acordo com o mtodo descrito por Blose e Feramisco (1983). Assim, as folhas de trigo foram cortadas em pedaos de ca.
109
2 cm, imersas numa soluo a 4% (m/v) p-formaldedo (PFA) em PBS, sujeitas a 15 minutos de vcuo e deixadas em fixador durante a noite a 4 oC. Pela manh, os fragmentos de folhas foram lavados com PBS, colocados num pedao de medula de sabugueiro ou embebidos em 30% (v/v) de glicerol em etanol (tipo A) ou embebidos em 30% (v/v) de glicerol em PBS (tipo B), e cortados mo com a ajuda de uma lupa (Olympus SZ30, acoplada a um suporte SZ-STU1). Os cortes do tipo A foram imersos em etanol 70% (v/v), seleccionados, colocados sobre uma lmina de alvolos tratada com poli-L-lisina e secos ao ar. Os cortes tipo B foram imersos em PBS, seleccionados e transferidos para um tubo de microcentrfuga. Nos cortes em tubos de microcentrfuga, as solues foram retiradas por uma aspirao cuidadosa. Os cortes foram permeabilizados por digesto enzimtica, durante 15 min, com 2% (m/v) de celulase e 1% (v/v) de pectoliase, em tampo 4 mM de cido ctrico e 6 mM citrato trissdico e lavados com PBS. Foi efectuada uma segunda incubao, durante 10 min, com 2% (v/v) Triton X-100 em PBS e duas lavagens com tampo PBS, 5 min cada.
4.2.5.3 Immunolabeling
O material vegetal foi bloqueado com Image-iT FX signal enhancer, Molecular Probes, durante 30 min, lavado com PBS e incubado em cmara hmida com o primeiro anticorpo (1:300 anti-SBT_Triticum abs; 1:200 anti-LSU abs) em PBS contendo 5% (m/v) BSA, durante a noite. Aps a incubao com o primeiro anticorpo, o material vegetal foi lavado7, duas vezes durante 15 min, com PBS_T 1% (v/v), uma vez com SAIS durante 20 min, uma vez durante 15 min com PBS contendo 5% (m/v) de BSA, e incubado com os segundos anticorpos (8 g/mL de Alexa 488 anti-rat IgG abs e 8 g/mL de Alexa 555 anti-rabbit IgG abs) em PBS contendo 5% (m/v) de BSA, durante 2 h. O material vegetal foi novamente lavado uma vez com PBS_T 1% (v/v) durante 15 min, duas vezes com SAIS durante 15 min, uma vez com PBS_T 1% (v/v) durante 15 min, e, por fim, uma vez com PBS durante 15 min.
As lavagens e as incubaes com os anticorpos foram efectuadas de modo anlogo imunodeteco de polipptidos em membrana (ver seco2.5.3).
7
110
Os cortes de folhas de trigo incubados em tubos de microcentrfuga (cortes tipo B) foram, ento, montados em lminas de alvolos. Em todas as preparaes, o PBS foi sugado com papel de filtro e foi colocada uma gota de Citifluor AF1 antes de se aplicar a lamela. O excesso de Citifluor foi limpo com papel de filtro e a preparao foi selada com verniz incolor. As preparaes foram guardadas a 4 oC at serem visualizadas.
4.2.5.4 Visualizao e fotografia

O material vegetal foi observado num microscpio ptico de epi-fluorescncia Axioskop 2, Zeiss, com as objectivas Zeiss Plan NeoFluar 10x/0,30; 63x/1,25 oil e 100x/1,30 oil, e fotografado com a cmara Axio Cam MRC 5, Zeiss.
4.2.6 Seleco de linhas de Arabidopsis thaliana com insero de T-DNA no locus AT3G14067
Recorreu-se informao disponibilizada na base de dados do TAIR para o gene AT3g14067 e seleccionaram-se 3 polimorfismos com inseres de T-DNA: o SALK_063823, denominado MT1; o SALK_054778.56.00.x, denominado MT2; e o SALK_022941.20.65.x, denominado MT3 (Fig. 4.4). Estas plantas foram
produzidas e sequenciadas pela equipa de Joseph Ecker (Alonso et al., 2003). As sementes foram adquiridas ao NASC, pertencem variedade Columbia-0, encontram-se na gerao F3 ou F4 e no apresentam nenhum fentipo particular. A presena das inseres foi confirmada por PCR, utilizando um primer para a insero, o Lba1, que se encontra a ca. de 400 bp do final da insero, e um primer especfico para o referido gene (mt1a, mt2a ou mt3a), originando um produto de PCR de ca. de 850 bp para o polimorfismo MT2 e MT3 e de ca. de 800 bp para o polimorfismo MT1. O PCR foi efectuado, como descrito previamente, com uma temperatura de emparelhamento de 58 oC e 30 ciclos de amplificao. Foi efectuado um outro PCR, nas condies anteriores, com os pares de primers mt1c/mt1a, mt2c/mt2a e mt3c/mt3a, para averiguar a presena do gene no modificado wild type; assim, obter-se-ia um produto com ca. de 540 bp para os polimorfismos MT2 e MT3 e com ca. de 410 bp para o 111
polimorfismo MT1. Estaramos em presena de um heterozigtico quando se obtivessem as bandas da insero e wild type e de um homozigtico quando s se obtivesse uma das bandas. O T-DNA inserido nestes polimorfismos contm um gene que, quando expresso, confere resistncia canamicina. A presena da insero foi, tambm, avaliada atravs da taxa de sobrevivncia das plntulas germinadas em meio selectivo (seco 2.2.3).
mt2c
Mt2
mt2a mt3a
Mt3
mt3c
mt1a
Mt1
mt1c
Fig. 4.4 Imagem do programa SeqViewer (TAIR) da cadeia complementar do cromossoma 3, mostrando o gene AT3G14067.1.
Locais de insero de T-DNA dos polimorfismos MT1, MT2 e MT3 ( ) e alguns dos primers utilizados para os detectar ( ). As sequncias a vermelho representam as extremidades UTR, a amarelo a sequncia codificante, nas caixas azuis localizam-se o cdo de iniciao (ATG) e o cdo stop (TGA), e a preto o restante DNA.
112
4.3 Resultados e discusso 4.3.1 Meta-anlise da expresso em Arabidopsis thaliana dos genes anotados como protease e dos genes RbcL e RbcS
A tcnica de "microarrays" permite estudar, em simultneo, a expresso gentica de milhares de genes duma amostra e comparar a expresso desses genes com a de outra amostra. O chip da Affymetrix composto por probe set, que forma um conjunto de 8 sequncias diferentes de, normalmente, 25 nucletidos, distribudas ao acaso no chip, constituindo cada sequncia uma sonda para determinar o nvel de expresso do(s) locus(loci) que essas sondas representam. Este chip , ento, exposto ao RNA preparado de acordo com um protocolo comum a todos os autores e a percentagem de hibridao obtida determinada. O sinal obtido em cada experincia objecto de uma anlise matemtica, que efectua a normalizao dos dados e determina a fiabilidade da experincia. Os resultados so posteriormente depositados em diversas bases de dados (e.g.
AtGenExpress, que significa Arabidopsis thaliana gene expression e que contm uma seleco de experincias de microarray), que permitem ao pblico reanalisar as experincias j efectuadas. A fiabilidade do sinal obtido depende da especificidade das sondas utilizadas e da eficincia de hibridao entre o RNA alvo e as sondas respectivas. Uma abordagem semelhante a utilizao dos dados de sequenciao das bibliotecas de cDNA, quantificando o nmero de clones detectados para um gene relativamente ao total de clones obtidos, determinando, assim, o nvel de expresso/representao de determinado clone. Este mtodo permite tambm a comparao da expresso gentica entre diferentes tecidos. Esta tcnica no est condicionada seleco prvia das sondas, como acontece nos chips de DNA, e est a ser utilizada na anlise de plantas diferentes de A. thaliana para as quais ainda no existe um chip. De modo a conhecer as proteases que possam estar envolvidas na degradao da rubisco, utilizaram-se os resultados da expresso gentica obtidos 113
por muitos autores, pela tcnica de microarrays. O processo que conduziu seleco dos transcritos, est apresentado no esquema da Fig. 4.5, envolvendo o estudo da relao da expresso gentica entre o transcrito de RbcS e de cada uma das proteases. Escolheu-se a subunidade pequena de rubisco por estar codificada no genoma nuclear e por os seus nveis de transcritos serem rapidamente ajustados aps a imposio de um stresse (Rodermel, 1999).
Seleco de loci codificantes para proteases (TAIR).
Anlise do grfico da relao entre os transcritos de RbcS e de cada uma das proteases, com clculo do coeficiente de correlao de Pearson (r2 ) (Gene Correlator: Genevestigator).
Estabelecimento de um limite para efectuar um agrupamento dos nveis de expresso gentica.
Realizao de um agrupamento completo, utilizando a distncia euclidiana com os nveis de transcrio agrupados por rgos da planta (M eta-Analyser: Genevestigator).
Anlise do agrupamento produzido.
Consulta bibliogrfica especfica para cada uma das proteases seleccionadas (TAIR, SUBA, NCBI, ScienceDirect, Google). Anlise detalhada do valor do sinal em cada rgo da planta (BAR).
Nova seleco de transcritos e seleco de experincias de mic roarray especficas.
Agrupamento hierrquico dos loci seleccionados (Gene Cluster, TreeView).
Clculo da variao da transcrio entre as folhas senescentes e no senescentes.
Fig. 4.5 Esquema do mtodo utilizado para a seleco de proteases.

Entre parntesis, encontram-se as abreviaturas das bases de dados e dos programas de computador utilizados em cada caso.
114
4.3.1.1 Correlao entre o teor de transcritos de RbcS e de cada uma das proteases em A. thaliana.
Comeou por se efectuar uma pesquisa de texto base de dados anotada do TAIR. Procuraram-se os loci anotados com as palavras protease ou metaloendopeptidase, obtendo-se um total de 733 loci anotados com alguma destas palavras (TAIR, 2007a; TAIR, 2007b). Destes 733 loci, 128 loci no esto representados nas experincias de microarray seleccionadas (ver seco 4.2.1.2). A relao da expresso gentica da subunidade pequena da rubisco (gene RbcS) com cada um dos 605 loci de A. thaliana, anotados com as palavras protease ou metaloendopeptidase, foi investigada pela observao de um grfico de correlao, representando 920 experincias de microarray, efectuando-se o clculo do coeficiente de correlao de Pearson (ANEXO III). Apenas 1% das probe set (5 loci) tm um coeficiente de correlao superior a 0,5 (Fig. 4.6); a que apresenta a correlao mais elevada uma protease asprtica, com capacidades potenciais de ligao ao DNA do cloroplasto (AT3G18490), com um r2 de 0,621. Outras proteases j detectadas no cloroplasto tm correlaes de, por exemplo, 0,462 para a protease do locus AT2G30950, codificante para a metaloprotease, FtsH2 (VAR2), envolvida na reparao do fotossistema II (Chen et al., 2000; Sakamoto et al., 2003); ou de 0,266 para a protease do locus AT5G35220, codificante para a metaloprotease EGY1, essencial, entre outras funes, para o correcto desenvolvimento dos grana (Chen et al., 2005). Estas correlaes so, em si, muito baixas; no entanto, a correlao entre os nveis de transcritos das duas subunidades da rubisco, RbcS e RbcL, de apenas 0,329.
115
, , , , , , , , , ,
Fig. 4.6 Distribuio do coeficiente de correlao de Pearson (r2 Log2(n)) entre os nveis de transcritos de RbcS e de cada um dos loci anotados como protease, em A. thaliana.
4.3.1.2 Agrupamento da primeira seleco de transcritos

De todos os loci anotados como protease, seleccionaram-se apenas os genes que, quando comparados com a expresso do gene RbcS, apresentaram um coeficiente de correlao de Pearson superior a 0,3 (8% dos loci cuja expresso gentica foi inspeccionada). A relao da expresso gentica destes loci foi avaliada num agrupamento, por rgos da planta, efectuado na pgina MetaAnalyzer do Genevestigator (Fig. 4.7). No se visualiza o dendograma deste agrupamento para que este seja menos determinante na anlise efectuada, pois, este programa atribui o mesmo peso a todos os grupos de experincias, previamente efectuados pela equipa do Genevestigator. Por isso, este agrupamento foi dividido empiricamente em cinco grupos: O grupo I composto por transcritos com maior expresso em callus ou cultura de clulas; estes loci so expressos moderadamente em quase todos rgos da planta, sobressaindo pouco nos tecidos fotossintticos; no entanto, alguns mostram um teor mais elevado nas folhas senescentes do que nas folhas vegetativas. O grupo II composto por transcritos com maior expresso nos tecidos fotossintticos; a sua expresso elevada nos cotildones, nas folhas jovens e nas folhas j desenvolvidas, pronunciando que so necessrios para o correcto desenvolvimento e manuteno dos cloroplastos.
116
O grupo III composto por transcritos com expresso razovel nos tecidos fotossintticos, destacando-se nas folhas caulinares (cauline leaf) e nas folhas senescentes. O grupo IV composto por transcritos com razovel expresso nos tecidos fotossintticos, destacando-se nas spalas. O grupo V composto por dois transcritos que so expressos sobretudo nas razes. No grfico apresentado na Fig. 4.7 observa-se, tambm, a particularidade das folhas caulinares, onde se expressam no s os genes que so
relativamente mais expressos nos cotildones e folhas juvenis, mas tambm os genes mais expressos durante a senescncia. Todos os transcritos dos grupos II e III foram analisados detalhadamente, investigando-se a sua expresso em resultado da imposio de vrios stresses, pesquisando-se a sua localizao celular e consultando-se as bases
bibliogrficas. Com base nesta anlise seleccionaram-se, 10 transcritos no total: quatro transcritos do grupo II, o AT5G50920 (ClpC1), AT3G18490 (putive chloroplast DNA binding, semelhante CND41), AT2G45180 e AT2G10940 (ambas protease inhibitor/seed storage protein/lipid transfer protein family), e seis transcitos do grupo III, AT5G10760 (putive chloroplast DNA binding; CND41), AT3G14067 (subtilisin-like serine protease, SBT_AT), AT4G00780 (meprin and TRAF domain containing protease), AT1G09130 (ClpR3), AT1G49970 (ClpR1) e AT1G02560 (ClpP5).
117
highest signal intensity*
UBP14 similar to UBP5 putative aspartyl protease DegP7 oligopeptidase A - like protein putative COP9 signalosome subunit UBP6 DegP9 DegP14 putative zinc metalloprotease putative zinc metalloprotease rbcS FtsH2 ClpT ClpC1 La (LON) domain-containing protein peptidase S41 family protein ClpR2 CAAX amino terminal protease family protein DegP5 oligopeptidase domain-containing protein peptidase M50 family protein metalloproteases domain-containing protein CAAX amino terminal protease family protein putative chloroplast nucleoid DNA-binding protein subtilisin-like protease putative aspartyl protease, putative ClpP1 protease inhibitor/seed storage/LTP family chloroplast nucleoid DNA-binding protein-related protease inhibitor/seed storage/lipid transfer protein La (LON) domain-containing protein subtilisin-like protease
198 495 160 432 307 Plastid1 338 788 611 Plastid and nucleus2 55 646 408 6640 2337 Plastid 3 1181 2126 Plastid and mitochondrion4 279 112 Plastid 5 774 Plastid 6 259 496 Plastid 7 1465 Plastid 8 390 Plastid 9 254 528 2757 969 265 3215 Plastid10 3071 Plastid11 1915 Extracellular12 4454 Plastid13 688 848
II
III
IV V
subtilisin-like serine protease meprin and TRAF homology domain-containing protein chloroplast nucleoid DNA-binding like protein subtilisin-like serine protease, putative ClpR3 ClpR1 ClpP5 La (LON) domain-containing protein DegP1 rbcL FtsH1 FtsH5 subtilisin-like serine protease FtsH 8 meprin and TRAF homology domain /low similar UBP12 cysteine proteinase protease inhibitor/seed storage/lipid transfer protein
295 1655 1168 1145 Vacuole14 1279 Plastid and mitochondrion15 1150 Plastid 16 2207 Plastid 17 640 974 Plastid and nucleus18 1369 1719 Plastid19 1563 Plastid 20 261 1152 Plastid 21 521 2398 62
% do valor absoluto do sinal (log2(n)) determinado para cada probe set <5% 20%<25% 45%<50% 70%<75% 95%
Fig. 4.7 Meta-anlise, por anatomia, dos 52 loci que apresentam uma correlao de Pearson (Log2(n)) com o transcrito de RbcS superior a 0,3.
Utilizou-se a distncia euclidiana com complete linkage para ordenar as probe set presentes no chip AT1:22k array; wild type (Genevestigator (Zimmermann et al., 2004)). * Estes valores foram retirados da pgina Arabidopsis eFP Browser: BAR (Winter et al., 2007), que selecciona algumas das experincias de microarray anteriores podendo, por isso, no corresponder exactamente ao sinal mximo utilizado pelo Genevestigator. A localizao celular foi encontrada na base de dados SUBA (Heazlewood et al., 2007); apenas se transcreve as que foram detectadas experimentalmente por espectrometria de massa e cujas referncias so: Cloroplasto- (Kleffmann et al., 2004): 1, 2, 3, 4, 7, 10, 11, 18, 19, 20 e 21; (Froehlich et al., 2003): 3, 4, 6, 8, 15, 17, 20; (Friso et al., 2004): 3, 7, 18, 19, 20, 21; (Schubert et al., 2002): 3, 5, 17, 18, 20; (Peltier et al., 2004b): 3, 4, 9, 11, 13 19, 20, 21; (Giacomelli et al., 2006): 3, 7, 15, 18, 17; (Ferro et al., 2003): 4, 17; 19; (Peltier et al., 2006): 4, 6, 10, 15, 16, 17; (Peltier et al., 2001): 6, 10, 15, 16, 17; (Nakabayashi et al., 1999): 16; (Sakamoto et al., 2003): 3, 19, 20, 21. Mitocndrio(Heazlewood et al., 2004): 3, 15.Vacolos- (Carter et al., 2004): 14; (Jaquinod et al., 2007): 14. Extracelular- (Boudart et al., 2005): 12. Ncleo- (Pendle et al., 2005): 2; (Bae et al., 2003): 18.
118
Mass Spec
Name
4.3.1.3 Agrupamento da segunda seleco de transcritos

De entre os 52 genes considerados na primeira seleco (seco 4.3.1.2), escolheram-se aqueles 10 genes que apresentavam uma expresso maior nos tecidos fotossintticos, com uma intensidade superior nas folhas senescentes e nas folhas caulinares, excepto para transcritos anotados como protease inhibitor/seed storage/lipid transfer protein family, que so relativamente menos expressos nas folhas senescentes. Deste modo, aos 10 transcritos seleccionados do agrupamento anterior, adicionaram-se outros quatro, o AT1G7310 (putative ATPase), AT5G58870 (FtsH9), AT3G47060 (FtsH7) e o AT1G47128 (cysteine protease, RD21-A). Estes quatro transcritos revelam um coeficiente de correlao de Pearson com o transcrito RbcS inferior a 0,3, mas apresentam uma distribuio do sinal semelhante pretendida. O valor do sinal dos 14 transcritos seleccionados foi retirado da pgina BAR e agrupado por anatomia (como descrito na Tabela 3 da seco 4.2.1.2). A relao da expresso gentica foi avaliada por um agrupamento efectuado com o programa Gene Cluster (Fig. 4.8), como descrito na seco 4.2.1.6. A Fig. 4.8 representa a relao da expresso dos genes seleccionados, nas diferentes partes da planta e ordenados pelo dendograma produzido. Observa-se que o conjunto de transcritos composto pelos genes que codificam a rubisco e pelos genes anotados como inhibitor/seed storage/lipid transfer protein family est separado das restantes proteases. A sua expresso encontra-se diminuda nas folhas senescentes e na maior parte dos tecidos florais. O outro conjunto, que contm as proteases seleccionadas, divide-se em dois grupos, um deles, contm as protenas do complexo Clp e, o outro, contm a subtilisina em estudo. Os genes do grupo que contm as protenas do complexo Clp so expressos nos cotildones e em todos os tipos de folhas, destacando-se nas folhas c a u l i n a r e s e nas senescentes. As protenas deste grupo foram detectadas nos cloroplastos, excepto para o AT4G00780 Meprin and TRAF domain containing protease, para o qual os programas de previso de localizao celular no so consensuais, e o AT1G73170 putative ATPase, para o qual os programas de previso apontam para os cloroplastos (Heazlewood et al., 2007).
119
Seedling Cotyledon Hypocotyl Radicle Inflorescence Flow er Carpels Petals Sepals Stamens Mature Pollen Pedicels Siliques Seeds Stem Node Shoot Apex Cauline Leaf Rosette Juvenile Leaf Adult Leaf Senescence Leaf Root
Average signal
AT3G18490- putative chloroplast nucleoid DNAAT1G67090- RbcS ATCG00490- RbcL AT2G45180- protease inhibitor/seed storage/lipi AT2G10940- putative protease inhibitor/seed sto AT1G73170- putative ATPase AT5G58870- FtsH9 AT5G50920- ClpC1 AT1G49970- ClpR1 AT1G09130- ClpR3 AT1G02560- ClpP5 AT4G00780- meprin and TRAF domain-containi AT5G10760- chloroplast nucleoid DNA-binding li AT3G47060- FtsH7 AT3G14067- subtilisin-like serine protease, puta AT1G47128- cysteine proteinase RD21A identic
Negative
0.42 0.61 0.72 0.84 0.92 0.96
Zero
Positive
Fig. 4.8 Agrupamento dos 14 transcritos presentes nos tecidos fotossintticos, induzidos nas folhas caulinares e nas folhas senescentes.
Agruparam-se 14 transcritos anotados com a palavra protease e os transcritos das subunidades grande (RbcL) e pequena (RbcS) da rubisco. O valor do sinal de cada transcrito foi agrupado pelos diferentes tecidos de A. thaliana, centralizado e normalizado pelo valor da moda da expresso desse mesmo gene; o dendograma foi efectuado pelo average linkage no programa Gene Cluster.
O outro grupo resultante do agrupamento apresentado na Fig. 4.8, constitudo pela protease de subtilisina e de cistena, ambas detectadas por espectrometria de massa nos vacolos (Carter et al., 2004; Jaquinod et al., 2007); a protease de cistena foi, tambm, detectada nos cloroplastos, mas apenas por Kleffmann et al. (2004), o que pode reflectir uma contaminao; de qualquer modo, os cloroplastos utilizados na deteco por espectrometria de massa provm de folhas no senescentes. Neste grupo, os genes so menos expressos nos cotildones e folhas juvenis e mais expressos nas folhas caulinares e senescentes. A protease de subtilisina o nico transcrito a ser mais expresso no gro de plen, o qual normalmente desprovido de cloroplastos. O transcrito FtsH7, pertencente a este grupo, est localizado no cloroplasto (Ferro et al., 2003) e tem uma intensidade do sinal extremamente baixa (a moda do sinal das folhas da roseta de 53,4), sendo provvel que esteja presente em apenas algumas clulas dos tecidos inspeccionados ou durante um curto perodo de tempo.
120
Ambos estes grupos de proteases so relativamente mais expressos nas spalas e, em menor grau, tambm nas ptalas, sobretudo o grupo que contm a subtilisina, reflectindo a fase de desenvolvimento em que estes tecidos foram estudados (Flower stage 12 e Flower stage 15, as fases finais do desenvolvimento floral). Para melhor avaliar a variao ocorrida durante a senescncia, a expresso relativa dos genes entre as folhas da roseta senescentes e as folhas da roseta no senescentes foi estudada, em detalhe, atravs do Log2 da razo entre o sinal das folhas senescentes e o das folhas da roseta8 (Fig. 4.9) (ANEXO IV). Esta transformao dos dados confirma os resultados anteriores. No entanto, o aumento de expresso dos genes do complexo Clp esbate-se, sendo semelhante diminuio do RbcL; os genes do tipo Chloroplast nucleoid DNA binding; CND41 apresentam um aumento idntico diminuio do RbcS e o grupo que contm a subtilisina apresenta o maior aumento de expresso. Contudo, a maior mudana detectada a diminuio drstica do transcrito AT2G10940, seguido do transcrito AT2G45180, ambos anotados como protease inhibitor/seed
storage/lipid transfer protein family.
A percentagem de present calls para estas experincias , em mdia, de 63,70 1,87, isto , foram considerados presentes, com um p-value 0,06, 63,7% das probe set. Estas experincias tm present calls semelhantes e elevados e, por isso, com uma intensidade de sinal comparvel.
121
2 0 -2 -4 -6 -8 -10 Log2 (ratio)
AT3G14067 "subtilisin-like serine protease" AT3G47060 "FtsH7" AT1G47128 "cysteine proteinase RD21A identical" AT5G10760 "chloroplast nucleoid DNA-binding like protein" AT3G18490 "putative chloroplast nucleoid DNA-binding" AT1G49970 "ClpR1" AT1G73170 "putative ATPase" AT1G09130 "ClpR3" AT4G00780 "meprin and TRAF homology domain-containing protein" AT5G58870 "FtsH9" AT1G02560 "ClpP5" AT5G50920 "ClpC1" ATCG00490 "rbcL" AT1G67090 "rbcS" AT2G45180 "protease inhibitor/seed storage/lipid transfer protein" AT2G10940 "putative protease inhibitor/seed storage/lipid transfer protein"
Fig. 4.9 Variao do sinal dos 14 transcritos seleccionados entre as folhas da roseta senescentes e as folhas da roseta no senescentes.
O valor do sinal foi retirado da base de dados Bar, para as experincias de microarray efectuadas em folhas e foi calculado Log2 entre a moda do sinal das folhas senescentes e o sinal das folhas senescentes (consultar o ANEXO IV)
BREVE ACTUALIZAO BIBLIOGRFICA SOBRE ALGUNS DOS TRANSCITOS

SELECCIONADOS
A importncia do complexo Clp durante a senescncia controversa. A composio deste complexo apresenta-se semelhante em diferentes tipos de plastdios e a expresso destes genes constitutiva, com pequenas alteraes durante situaes de stresse especficas ou durante a senescncia (Nakabayashi et al., 1999; Shanklin et al., 1995; Crafts-Brandner et al., 1996). Contudo, a funo das subunidades ClpR permanece desconhecida e o modelo tridimensional do complexo heterogneo indica que a incluso do ClpR pode controlar o acesso do substrato ao compartimento cataltico (Sakamoto, 2006). No deixa de ser interessante verificar que so duas subunidades deste tipo, a ClpR1 e ClpR3, que aumentam o seu nvel de expresso durante a senescncia (Fig. 4.9). As proteases da famlia FtsH so metaloproteases dependentes de ATP, ligadas s membranas, encontrando-se e a maior parte dos membros desta famlia nos cloroplastos. A presena da FtsH7 nestes organitos foi detectada por espectrometria de massa no envelope (Ferro et al., 2003). A FtsH9 foi indexada aos cloroplastos em estudos de expresso do promotor deste gene acoplado GFP (Sakamoto et al., 2003). Ao nvel da sequncia de resduos de aminocidos, 122
estas duas proteases esto estreitamente relacionadas e encontram-se distanciadas das proteases FtsH2 e FtsH5, que esto envolvidas na reparao do PSII (Lindahl et al., 2000; Zaltsman et al., 2005) e cujo silenciamento conduz aos fentipos VAR1 e VAR2 (Sakamoto et al., 2003; Takechi et al., 2000). A funo celular especfica dos genes FtsH7 e 9 permanece desconhecida. As proteases do tipo Chloroplast nucleiod DNA binding tm um domnio que lhes permite interagir com o DNA e um domnio prprio das proteases asprticas. A protease AT5G10760 corresponde protease CND41 isolada de cloroplastos de tabaco (Nakano et al., 1997). Esta protease est envolvida na regulao negativa da transcrio de alguns genes do cloroplasto, nomeadamente do RbcL; tem, tambm, actividade contra um pptido sinttico a pH cido (2-4) e, a pH 7, esta protease apresenta actividade contra a rubisco desde que esta esteja desnaturada; caso contrrio, no exibe actividade proteoltica (Murakami et al., 2000; Kato et al., 2004). Ainda no cloroplasto esto as protenas anotadas como protease inhibitor/seed storage/lipid transfer protein family, os genes dos loci AT2G45180 e AT2G10940, que tm uma massa molecular e um ponto isoelctrico estimado, para as protenas sem a sequncia sinal, de cerca de 10 kDa, pI 9,1 e 26,6 kDa, pI 9,6, respectivamente (Gasteiger et al., 2005). A estrutura de nvel secundrio para a protena maior, a AT2G10940 (sem a sequncia sinal), prev uma regio sem uma estrutura secundria definida, situada fora de uma membrana e com cerca de 180 resduos de aminocidos na regio N-terminal, composta por uma sequncia de 10 resduos de aminocidos (PKLPVPPVTV), repetida 10 vezes. Esta regio seguida de uma regio transmembranar, coincidente com o domnio protease inhibitor/seed storage/lipid transfer", que poder conter at 4 pontes dissulfdricas (Rost et al., 1996; Ceroni et al., 2006). Este domnio partilhado por trs tipos de protenas: as protenas que transportam molculas hidrofbicas no seu interior (LTP- lipid transfer proteins), as protenas de reserva das sementes e as protenas que so inibidores da tripsina e da -amilase (Zdobnov e Apweiler, 2001). As protenas do tipo LTP dividem-se em dois grupos, de acordo com a sua massa molecular: o grupo das LTP1 apresenta uma massa molecular de ca. 10 kDa e o grupo das LTP2 apresenta uma massa molecular de 7 kDa (Carvalho 123
Ade e Gomes, 2007). O transcrito AT2G45180 enquadra-se na classe LTP1 da famlia das protenas que transferem lpidos e o transcrito AT2G10940 grande demais e no se integra em nenhuma classe. A funo das LTP no est esclarecida; alguns membros desta famlia esto envolvidos em processos de sinalizao celular durante a resistncia sistmica adquirida (SAR), outros possuem uma forte actividade antimicrobiana contra fungos e bactrias e outros so agentes alergnicos alimentares (Carvalho Ade e Gomes, 2007). Jones e Fontanini (2003) observaram inibio da actividade de uma endoprotease de subtilisina (SEP-1) causada por inibidores endgenos do tipo inibidor da tripsina e da -amilase. A expresso do gene AT2G10940 muito semelhante ao do gene AT1G19150 (light-harvesting chlorophyll a/b binding protein), cujo decrscimo acentuado est correlacionado com o aparecimento da senescncia (Gombert et al., 2006). Grande parte das proteases induzidas durante a senescncia so proteases de cistena e, muitas delas, esto envolvidas na morte celular programada. A protease de cistena SAG12 sintetizada de novo na altura da senescncia (Lohman et al., 1994; Miller et al., 1999; Grbi, 2001; McCabe et al., 2001), correlacionando-se com a diminuio dos transcritos de RbcS (Woo et al., 2001). O locus AT1G47128 codifica a protease de cistena RD21A (responsive to dehidration), identificado por Koizumi et al. (1993), que aumenta a sua expresso em situaes de secura. Este gene est, tambm, envolvido na resposta a agentes patognicos e no desenrolar da senescncia (Coupe et al., 2003; Espinoza et al., 2007), acumulando-se nos vacolos e apresentando duas formas com massas moleculares distintas, 38 e 33 kDa, que resultam de desigual processamento da protease (Yamada et al., 2001). A protease de subtilisina AT3G14067 (SBT_AT) foi detectada nos vacolos de A. thaliana (Carter et al., 2004; Jaquinod et al., 2007). A sua homloga, a ARA12, foi detectada no espao extracelular (Ribeiro et al., 1995); apresenta uma massa molecular de 76,1 kDa e detectada em maior quantidade nas silquas mas, tambm, nos caules (Hamilton et al., 2003). A sua funo foi relacionada com o desenvolvimento das sementes e com a soltura da mucilagem durante a germinao destas (Rautengarten, 2007). Apesar da grande homologia detectada 124
ao nvel da sequncia de resduos de aminocidos entre as proteases ARA12 e SBT_AT, elas mostram uma expresso gentica e uma localizao celular distintas. Coffeen e Wolpert (2004) purificaram duas proteases de subtilisina de aveia (SAS-1 e SAS-2) e Roberts et al. (2006) purificaram duas proteases de subtilisina de trigo, uma das quais poder corresponder protease SBT_Triticum. Ambos os autores sugerem um envolvimento indirecto de alguma destas proteases na degradao da rubisco.
4.3.1.4 Relao entre o transcrito Sbt_AT e o transcrito da protease de cistena RD21-A

Os resultados anteriores indiciam a existncia de uma correlao entre a expresso da subtilisina SBT_AT (AT3G14067) e a protease de cistena RD21-A (AT1G47128). Por isso, analisou-se detalhadamente a correlao entre estas duas proteases, que foi efectuada na pgina Gene Correlator do Genevestigator, para as experincias de microarray efectuadas em todas as folhas, como descrito em 4.2.1.2. Estas duas proteases apresentam uma forte correlao positiva, como se pode observar na Fig. 4.10, com um coeficiente de correlao de Pearson linear de 0,944 e de 0,904 para as variveis transformadas (Log2).
r2 =0,944
RD21-A
Sbt_AT
Fig. 4.10 Relao entre a expresso do transcrito da subtilisina SBT_AT e da protease de cistena RD21-A em folhas de A. thaliana.
Este grfico foi efectuado na pgina do Gene Correlator do Genevestigator, seleccionando-se as experincias efectuadas nas folhas de A. thaliana. Os transcritos esto identificados com o nome do gene, a probe set utilizada e o respectivo Locus.
125
4.3.1.5 Relao entre o transcrito da SSU (RbcS) e da subtilisina (Sbt_AT) durante o desenvolvimento foliar
Analisou-se, com mais pormenor, a relao entre a expresso do gene RbcS e do gene Sbt_AT (AT3G14067 subtilisin like protease) nas folhas de A. thaliana. A correlao foi calculada na pgina do Gene correlator do Genevestigator, tal como anteriormente, seleccionando-se apenas as
experincias efectuadas nas diferentes folhas. Obteve-se a mesma correlao de Pearson (r2= 0,61), quer se optasse por variveis lineares ou transformadas para Log2 (Fig. 4.11). Esta correlao determinada pelo tipo de folha e tem 3 momentos importantes que ocorrem ao longo do desenvolvimento foliar: (1) um momento em que o sinal de RbcS o mais elevado e o da subtilisina o menor, que corresponde s folhas da roseta com 17 dias de idade; (2) um momento em que o nvel de expresso do RbcS um pouco menor e o do Sbt_AT elevado, correspondendo s folhas caulinares com 21 dias de idade; (3) e um momento em que o nvel de RbcS o mais baixo e o da subtilisina o mais alto, correspondendo s folhas senescentes com 35 dias de idade.
A
1
2
B
1 2
RbcS
3
3
Sbt_AT
Sbt_AT
Fig. 4.11 Correlao entre os transcritos de RbcS e de Sbt_AT em folhas de A. thaliana.

A- Correlao entre as variveis lineares (r = 0,61) B- Correlao entre as variveis transformadas para Log2; 1- Folhas da roseta; 2- Folhas caulinares; 3- Folhas senescentes.
2
126
Observa-se que a alterao de expresso do RbcS e da subtilisina no so coincidentes: o aumento de expresso de Sbt_AT antecede a diminuio do RbcS e surge, portanto, antes da senescncia.
4.3.2 Deteco de rubisco em razes de Pinus pinea

A consulta dos nveis de expresso do gene para a SSU (RbcS, probe set: 264474_s_at) em razes de plantas de A. thaliana sujeitas a ausncia de enxofre (AtGenExpress: Response to sulfate limitation (Maruyama-Nakashita et al., 2003)) evidencia no s a expresso do gene da SSU nas razes, mas tambm a diminuio da expresso aps a imposio do stresse. Por isso, colocou-se a hiptese de a rubisco estar presente nas razes das plantas. De facto, ela j havia sido detectada em razes de A. thaliana, arroz e trigo (Koller et al., 2002; Mooney et al., 2006; Song et al., 2007). Escolheram-se razes de pinheiro manso pela facilidade de obteno do material vegetal. A protena total solvel foi extrada em tampo com ou sem cido ascrbico e dois pares de amostras foram sujeitos a SDS-PAGE, o gel foi cortado e um par das amostras foi revelado com CBB-R e, o outro par, foi sujeito a immunobloting e revelado com anticorpo anti-rubisco nativa, produzido por Esquvel e colaboradores (1998) (Fig. 4.12).
A
M 1 2 1
B
2
75 50
10
Fig. 4.12 Deteco de LSU em razes de pinheiro manso.

1 e 2 Extraco da protena total solvel de razes de pinheiro na ausncia ou presena de cido L-ascrbico, respectivamente. M- marcadores de massa molecular (kDa) A- A membrana foi revelada com anticorpos anti-rubisco nativa, na diluio de 1:500; B- SDS-PAGE das mesmas amostras.
127
Embora a ligao do anticorpo possa ser inespecfica, detectou-se uma banda, nos extractos em tampo com cido ascrbico, com ca. de 50 kDa que poder corresponder LSU. Na extraco sem cido ascrbico, observa-se a formao de agregados de massa molecular elevada que no penetram na malha do gel de electroforese. A formao destes agregados pode dever-se natureza fortemente oxidante dos extractos de razes. A pesquisa de rubisco nas razes surge dos resultados da anlise da expresso gnica em que se detecta a transcrio do gene RbcS e da subtilisina em estudo em quase todos os rgos das plantas da espcie de Arabidopsis thaliana. Uma vez que a transcrio e a traduo de um gene so processos separados, poder-se-ia supor que a subunidade pequena da rubisco, apesar de estar ser transcrita, no seria traduzida. O objectivo principal deste trabalho relacionar a protease purificada, com a degradao da rubisco, e encontrar provas que incluam ou excluam essa possibilidade. O facto da subtilisina ser detectada em razes, torna-a numa protease de funes mais generalizadas sem um papel preponderante na degradao da rubisco. Contudo a rubisco poder estar a ser expressa em vrios rgos da planta e se expressa ento dever poder ser degradada.
4.3.3 Avaliao do teor de SBT_Triticum e de LSU em folhas de trigo sujeito a ausncia de azoto
Durante uma deficincia de azoto ou enxofre observa-se a degradao da rubisco na segunda folha de trigo (Esquvel et al., 2000). Situaes de ausncia de azoto em trigo induzem o processo de senescncia foliar observando-se uma intensa degradao da rubisco (Feller et al., 2007). Por isso, utilizou-se a segunda folha de plantas de trigo, dividida em trs partes: parte mdia, parte basal e parte terminal, cada uma correspondente a um quinto do comprimento total da folha. A protease SBT_Triticum foi purificada a partir de folhas inteiras de trigo sujeito a uma ausncia de azoto; nestas condies, e tambm durante uma deficincia de enxofre, observa-se a degradao da rubisco na segunda folha de trigo (Esquvel et al., 2000); outra situao em que a rubisco intensamente 128
degradada durante a senescncia natural, que pode ser induzida por situaes de stresse, entre elas uma deficincia de azoto (Feller et al., 2007). Na segunda folha de plantas de arroz observou-se o progresso temporal da senescncia, desde a ponta da folha at sua base (Inada et al., 1999). O teor de SBT_Triticum e de LSU foi seguido detalhadamente na segunda folha de trigo durante o crescimento em meio completo ou durante a imposio de stresse (ausncia de azoto durante 15 dias, aps 12 dias de crescimento em meio completo). As plantas que cresceram em meio completo durante os 27 dias da experncia (controlo) apresentavam um crescimento homogneo, com a sexta folha praticamente desenvolvida. Contrariamente, as plantas sujeitas a stresse formam um conjunto heterogneo, com plantas em que a sexta folha est a expandir-se e plantas com apenas cinco folhas (Fig. 4.13).
Fig. 4.13 Plantas de trigo com 27 dias de idade, com crescimento em meio completo (I) ou com crescimento em meio sem azoto durante os ltimos 15 dias (II).
1- folha n1; 2- folha n 2; 3- folha n 3; 4- folha n 4. b- parte basal; m- parte mdia; t- parte terminal.
De modo a diferenciar a degradao da rubisco resultante da senescncia foliar ou resultante da imposio de stresse, foram recolhidas amostras de folhas
129
de trigo com crescimento em meio completo (controlo) e com crescimento em meio sem azoto, ao longo da imposio do stresse, aos 0, 5, 10 e 15 dias. As folhas colhidas foram divididas em cinco partes, tendo-se recolhido amostras na parte basal, mdia e terminal das folhas. No final do stresse, a terceira folha foi estudada do mesmo modo e a quarta folha foi estudada na sua totalidade. Na Fig. 4.13 tambm se pode observar que, no trigo sujeito a stresse, a segunda folha teve um processo de senescncia mais rpido, onde apenas se conseguiu obter uma amostra da parte basal da segunda folha e apenas para as plantas com cinco folhas.
4.3.3.1 Protena total solvel determinada na parte basal, mdia e terminal das folhas de trigo
A quantidade de protena total solvel (expressa em mg.g-1 p.f.) foi determinada em cada trs amostras independentes do mesmo tipo e com trs repeties por amostra (Fig. 4.14 e Fig. 4.15; os dados recolhidos podem ser consultados no ANEXO V). No tratamento de controlo, trigos com crescimento em meio completo, a maior quantidade de protena total solvel ocorre ao dcimo dia do perodo experimental, na parte basal e mdia da segunda folha. Nos trigos em controlo, observa-se que folha n 3 e a folha n 4 contm sensivelmente a mesma quantidade de protena total solvel, sendo superior da folha n 2. Para os trigos com crescimento em meio sem azoto, o mximo de protena total obtido ao 5 dia do perodo experimental, na parte mdia e terminal da segunda folha. A quarta folha contm uma quantidade de protena superior folha n 2 e n 3, mas, como seria de esperar, com uma quantidade de protena menor quando comparada com a 4 folha do trigo controlo.
130
Crescimento em meio completo basal 15 Protena total solvel (mg.g-1 p. f.) 12 9 6 3 0 0 5 10 15 0 5 10 15 0 5 10 Tempo (dias) 15 15 15 Folha 2 mdia terminal Folha 3 b m t
Crescimento em meio sem azoto basal Folha 2 mdia terminal Folha 3 b m t
0 5 10 15 0 5 10 0 5 10 Tempo (dias)
15 15 15
Fig. 4.14 Protena total solvel (mg.g-1 p.f.) determinada em cada parte da folha n 2 e da folha n 3 ao longo do perodo experimental.
Grfico tipo Boxplot da determinao da protena total solvel, cada coluna do grfico representa nove determinaes (3 x 3: trs amostras por parte de folha x trs determinaes de por amostra).
0 dias; 5 dias; 10 dias; 15 dias.
9
Nos grficos apresentados nas Fig. 4.14 e Fig. 4.15, observa-se uma grande variao da protena total solvel que se deve, no s, ao erro experimental associado ao mtodo de determinao da protena total solvel (ver seco 2.3.3), mas tambm, a variaes no desenvolvimento do material vegetal, detectando-se grandes variaes no comprimento das folhas (ver ANEXO V).
Boxplot um tipo de grfico utilizado para descrever as variveis estatiscas de uma populao. A caixa representa o percentil 50%, a parte inferior da caixa representa o percentil 25%, a superior o percentil 75%, a fim da linha vertical representa o mximo () e o mnimo (), a linha horizontal representaa moda, quando a linha horizontal (moda) est centrada na caixa ento, os dados esto centrados. Os valores que saiem, * e representam outliresou possveis outliers
131
Crescimento em meio completo 15 12 9 6 3 0 0 10 15 5 Tempo (dias)
Crescimento em meio sem azoto
Protena total solvel (mg.g-1 p. f.)
10 15 5 Tempo (dias)
Fig. 4.15 Protena total solvel (mg.g-1 p.f.) determinada para a folha inteira.
A folha n 4 foi colhida inteira e a protena total solvel foi determinada para trs folhas independentes, com trs medies por amostra (3 x 3). Os resultados das partes da folha n2 e 3 foram agrupados por tempo e tratamento, apresentando-se neste grfico como folhas inteiras. Folha 2; Folha 3; Folha 4. Neste grfico cada coluna representa um nmero varivel de amostras de acordo com a Tabela 4, por exemplo, na primeira coluna do crescimento em meio completo (folha 2, 0 dias) o diagrama representa um total de 27 determinaes (3 x 3 x 3: trs partes de folha x trs amostras por parte de folha x trs determinaes de por amostra), mas na quarta coluna do crescimento em meio sem azoto (folha 2, 15 dias) o diagrama representa um total de nove determinaes (1 parte de folha, a basal, x trs amostras por parte de folha x trs determinaes por amostra).
4.3.3.2 Teor de SBT_Triticum e de LSU, avaliados por immunobloting, em folhas de trigo sujeito a ausncia de azoto
Prepararam-se e submeteram-se a SDS-PAGE 15 g de protena total solvel de cada uma das amostras (ver seco 4.2.2.3). Os polipptidos foram transferidos para um membrana de nitrocelulose e revelados primeiro com anticorpos anti-SBT_Triticum produzidos em ratos. Depois da fosfatase alcalina ligada ao segundo anticorpo produzido contra anticorpos de rato ter sido neutralizada, a membrana foi de novo revelada, mas desta vez com anticorpos anti-LSU produzidos em coelho. Os resultados obtidos esto apresentados na Fig. 4.16, detectando-se uma grande variao na quantidade e estabilidade da rubisco. Na segunda folha, com crescimento em meio completo, a maior quantidade de LSU detectada aos 10 dias, na parte mdia e, tambm, na parte basal, o que est de acordo com a
132
maior quantidade de protena total solvel presente nestas amostras (Fig. 4.14). Note-se que no final do perodo experimental (15 dias), a rubisco detectada na parte basal e mdia sem grandes alteraes na sua estabilidade. No tratamento de stresse, a maior quantidade de rubisco detectada, na segunda folha, aos 5 dias, na parte basal e mdia da folha, decaindo a partir da. Aos 10 dias j se detectam produtos de degradao desde a base at parte terminal da folha, onde a rubisco j no detectada. Este comportamento diferente do caso da senescncia em meio completo, em que os produtos de degradao da rubisco so apenas ligeiramente observados no final do ensaio na parte mdia e tambm na parte basal da segunda folha, onde continua a existir em grande quantidade.
Mais contrastante o caso da terceira folha, ao fim de 15 dias de stresse, em que a rubisco se encontra bastante deteriorada. Quando comparamos a folha inteira (folha 4, que a mais jovem no final do ensaio), as plantas em stresse apresentam uma ligeira diminuio da quantidade de rubisco e sem produtos de degradao, o que pode ser atribudo a diferenas de carregamento da amostra no gel de electroforese; no entanto, o teor de subtilisina ligeiramente superior nas folhas em stresse. Os produtos da degradao da rubisco foram detectados na folha n 2, aos 10 dias, e na folha n 3, aos 15 dias, provenientes de plantas em stresse, podendo surgir durante a elaborao dos extractos para o immunobloting; de qualquer modo, so indicativos do potencial proteoltico existente nessas folhas. Produtos semelhantes da degradao da rubisco foram, tambm, detectados por Feller et al. (2007), em folhas de feijo em condies de hipoxia e de escurido.
133
A
0_2_CS_m 0_2_CS_m 0_2_CS_m
0_2_CS_b
0_2_CS_t
5_2_C_b
5_2_C_m
M/2
LSU
5_2_C_t
5_2_C_b
5_2_S_m
5_2_S_t
10_2_C_b
M/2
LSU
M/2 10_2_C_m
10_2_C_t
10_2_S_b
10_2_S_m
10_2_S_t
M/5
LSU
M/2 15_2_C_b
15_2_C_m
15_2_S_b
LSU
Fig. 4.16 Continuao na pgina seguinte
134
B
M/2 15_3_C_b 15_3_C_m 15_3_C_t 15_3_S_b 15_3_S_m 15_3_S_t * M/5
LSU
C
15_4_C_i 15_4_S_i M/5
LSU
Fig. 4.16 Avaliao do teor de SBT_Triticum e de rubisco em folhas de trigo com crescimento em meio completo ou em meio sem azoto.
Quinze g de protena total de cada amostra, em triplicados independentes, foram sujeitos a immunobloting. A subtilisina foi revelada com anti-SBT_Triticum abs (1:1000). A rubisco foi revelada com anti-LSU abs (1:500). A descrio e identificao das amostras encontram-se na Tabela 4 da seco 4.2.2.1. Nesta imagem: A- segunda folha; B- terceira folha; C- quarta folha. *apenas foi colocado 6,5 g de protena total devido falta de amostra. M- marcador constitudo por 1 g de rubisco extrada da planta Lemna minor; M/2- metade de M; M/5- um quinto de M; LSU- subunidade grande da rubisco.
A subtilisina est presente em todas as amostras e o polipptido predominante, o SBT_Triticum.2, sofre apenas ligeiras variaes na sua quantidade, aumentando desde a base at ponta da folha, o que particularmente evidente nas amostras 15_3_S_T, em que apenas se observa 43% da protena total aplicada a todas as outras amostras. No entanto, quando se consideram tambm os polipptidos SBT_Triticum.3 e SBT_Triticum.4, observamse diferenas entre os dois tipos de plantas. Estes polipptidos so visveis em toda a folha n 2, aos 10 dias, e em toda a folha n 3, aos 15 dias em plantas sujeitas a stresse, o que se correlaciona com a destabilizao observada na 135
rubisco. O polipptido SBT_Triticum.1, que deve corresponder pr-protena inactiva, foi, apenas, detectado nas amostras 0_2_CS_b, 10_2_C_t e 15_3_C_t .
4.3.4 Determinao da localizao celular da protease de subtilisina, SBT_Triticum 4.3.4.1 Deteco da protease em cloroplastos isolados de trigo, por immunobloting
Purificaram-se cloroplastos provenientes de folhas de trigo com crescimento em meio completo e em meio sem azoto, que foram ressuspendidos em tampo de amostra para electroforese (SBM) e sujeitos a immunoblotting. Os polipptidos foram revelados com o anticorpo anti-SBT_Triticum, no tendo sido reconhecido nenhum polipptido. Se admitirmos que a degradao da rubisco ocorre dentro dos cloroplastos, ento, esta protease no parece estar envolvida na sua degradao. Contudo, no de excluir a existncia de degradao da rubisco fora dos cloroplastos, como foi exposto na introduo.
4.3.4.2 Deteco da protease em cortes de folhas de trigo, por microscopia de imunofluorescncia.

Uma das formas para determinar qual a localizao celular de uma protena por microscopia de fluorescncia, com a utilizao de anticorpos que reconheam a protena e originem uma marcao visvel. Neste trabalho, utilizou-se uma sonda de cor verde, constituda pelo fluorforo Alexa 488, e uma sonda de cor laranja-vermelho, constituda pelo fluorforo Alexa 555. A sonda verde est acoplada ao anticorpo anti-rato_IgG, reconhece os anticorpos produzidos em rato (anti-SBT_Triticum abs) e pode ser visualizada com o filtro verde ou com o filtro verde barrado. A sonda laranja-vermelho est acoplada ao anticorpo anticoelho_IgG, reconhece os anticorpos produzidos em coelho (anti-LSU abs) e pode ser visualizada com o filtro vemelho (ver seco 4.2.5.1).
136
Com o auxlio de uma lmina de corte e de medula de sabugueiro, efectuaram-se cortes de folhas de trigo com crescimento em meio completo e em meio sem azoto, previamente fixados com 4 % (m/v) de PFA. Os cortes foram imersos em 70 % (v/v) de etanol, seleccionados e fixados a uma lmina para microscpio (cortes tipo A, ver seco 4.2.5.2). A presena de etanol ajuda a retirar a clorofila e a fixar os cortes lmina do microscpio; no entanto, produz um encolhimento desigual no material vegetal e provoca alteraes na estrutura dos cortes (Fig. 4.17B). Por isso, optou-se por realizar os cortes do tipo B (ver seco 4.2.5.2), que no so imersos em etanol. Estes cortes foram incubados em tubo Eppendorf, com o inconveniente de se partirem e desfazerem durante as incubaes, o que se revelou profcuo, pois tornou possvel a observao de partes dos cortes sem sobreposio de clulas e dos seus cloroplastos e permitiu visualizar a sonda para a SBT_Triticum. Realizou-se um ensaio de controlo, em que se utilizaram os soros pr-imunes de rato e de coelho. Este soro recolhido antes do fornecimento dos antignios ao animal que vai produzir os anticorpos. A utilizao do soro pr-imune permite examinar a ausncia de uma marcao coincidente com a marcao da sonda que se pretende estudar. Nestes cortes, observa-se a elevada autofluorescncia caracterstica do material vegetal; a verde pode ver-se a parede celular, sobretudo nas clulas da epiderme (Fig. 4.17 A e B) e a vermelho/laranja observa-se a clorofila.
137
C1
C2
Fig. 4.17 Imunofluorescncia de cortes de folhas de trigo incubados com soro primune de rato e com soro pr-imune de coelho.
Aps a incubao com os soros pr-imunes de rato e de coelho, os cortes foram incubados com anti-rato_IgG abs: Alexa 488 e anti-coelho_IgG abs: Alexa 555. A- incubao dos cortes em tubos Eppendorf, visualizao com o filtro verde; B- corte previamente fixado na lmina e a incubado, visualizao com o filtro verde; C- conjunto de cloroplastos que se soltou do corte previamente incubado em tubo Eppendorf na altura da montagem na lmina: C1- visualizao com o filtro verde e C2- visualizao com o filtro vermelho. Barra: 10 m.
A combinao entre os filtros disponveis e a sonda utilizada para a marcao da LSU origina uma sobreposio entre a cor da sonda e a autofluorescncia da clorofila, perdendo-se a sensibilidade na informao sobre a localizao da rubisco. Na Fig. 4.17C observam-se os cloroplastos e muitos outros componentes mais pequenos e fluorescentes que induzem a sensao da existncia de um espao contnuo entre os cloroplastos e alguns compartimentos vizinhos. Estes pequenos compartimentos podem corresponder a autofluorescncia proveniente dos cloroplastos. Guiamet et al. (1999) observaram, em folhas senescentes de soja, a sada de componentes provenientes de cloroplastos (mass exodus) fortemente fluorescentes devido presena de produtos de degradao da clorofila. No entanto, a visualizao destes compartimentos poder corresponder
138
a uma marcao verdadeira das membranas biolgicas, devido presena de outros anticorpos no soro pr-imune dos coelhos. Exceptuando as paredes celulares de cor verde uniforme, no foi observada nenhuma cor verde nos cortes utilizados como controlo, permitindo identificar a protease SBT_Triticum quando se incubaram os cortes de folhas de trigo com o anticorpo anti-SBT_Triticum seguido do segundo anticorpo anti-rato_IgG, acoplado com o fluorforo Alexa 488. No final da incubao e colocao dos cortes sobre a lmina, observou-se uma forte perda dos cortes de folhas de trigo sujeitos a stresse. Os que sobejavam eram demasiado espessos ou, quando tinham a espessura adequada, a maior parte do contedo celular tinha desaparecido ou estava encoberto pela presena de gotas de leo. Por esta razo, a maioria das figuras apresentadas provm de folhas de trigo com crescimento em meio completo. Na Fig. 4.18 pode observar-se a estrutura geral dos cortes incubados em tubos "Eppendorf" e no fixados lmina, que preservam melhor a estrutura celular e foram utilizados para detectar a presena dos antignios. Nestes cortes observa-se, tambm, a presena de pequenas gotas de leo fortemente fluorescentes, que aumentam em nmero e tamanho nos cortes provenientes de plantas em stresse.
139
A1
A2
A3
A4
B1
B2
* *
Fig. 4.18 Aspecto geral dos cortes de folhas de trigo com crescimento em meio completo (A) ou em meio sem azoto (B).
Cortes de folhas de trigo incubados com as sondas anti-SBT_Triticum abs: anti-rato_IgG abs: Alexa 488 e anti-LSU abs: anti-coelho_IgG abs: Alexa 555, em tubo "Eppendorf", colocados sobre uma lmina e visualizados com luz branca (A1 e B1), barrada pelo filtro azul (A2), barrada pelo filtro verde (A3 e B2) ou barrada pelo filtro vermelho (A4). Barra: 50 m; seta: gotas de leo; asterisco: ausncia de contedo celular.
Na Fig. 4.19A observam-se proeminncias nos cloroplastos e identifica-se com rigor a cor da sonda Alexa 488. Na Fig. 4.19B detecta-se, provavelmente, um estrmulo que, quando observado com o filtro verde, apresenta uma cor verde plida presumivelmente resultante da autofluorescncia do material celular. A intensidade da cor verde detectada na Fig. 4.19A muito forte e provm com certeza, da sonda; no entanto, poder dever-se a um artefacto resultante da acumulao anormal da sonda.
140
A1
A2
A3
A4
B1
B2
B3
Fig. 4.19 Imunofluorescncia de cortes de folha de trigo com crescimento em meio completo. Visualizao de protuberncias nos cloroplastos e provavelmente, de um estrmulo.
Pedaos de folha de trigo que se soltaram dos cortes na altura da montagem na lmina. Os cortes foram incubados com as sondas anti-SBT_Triticum abs: anti-rato_IgG abs: Alexa 488 e anti-LSU abs: anti-coelho_IgG abs: Alexa 555 em tubo Eppendorf, colocados sobre uma lmina e visualizados com o filtro verde: (A1e B1), com o filtro vermelho (A2 e B2), com luz branca (A3) ou com luz branca e filtro verde (A4). A- Parte interna de uma clula, observada com diferentes filtros; Asterisco: marcao pela sonda verde; seta: protuberncias nos cloroplastos B- Grupo de cloroplastos soltos na lmina; a estrutura a verde, indicada por uma seta, assemelha-se a um estrmulo. Barra: 5 m.
A presena da sonda para a protease SBT_Triticum originou uma marcao geralmente em forma de pontos que s foi visualizada quando no existia nenhum cloroplasto por cima. A presena da sonda para a protease SBT_Triticum foi detectada perto da parede celular, por ser visvel no mesmo plano de focagem que a parede celular (Fig. 4.20 e Fig. 4.21B1). Este local onde ocorre a maior ligao inespecfica dos anticorpos, uma vez que quando se aumentou a concentrao de BSA para 5 % para minimizar as ligaes inespecficas, a marcao ligada parede celular diminuiu consideravelmente. No entanto, esta marcao pode ser verdadeira, pois no de excluir a presena de subtilisinas no espao extracelular (Hamilton et al., 2003). A sonda foi detectada, tambm, dentro das clulas em locais no identificveis (Fig. 4.20 e Fig. 4.21A e B2).
141
Fig. 4.20 Imunofluorescncia de cortes de folha de trigo com crescimento em meio completo. Possvel marcao de SBT_Triticum perto da parede celular.
Corte de folha de trigo incubado com as sondas anti-SBT_Triticum abs: anti-rato_IgG abs: Alexa 488 e anti-LSU abs: anti-coelho_IgG abs: Alexa 555 em tubo "Eppendorf", colocados sobre uma lmina e visualizados com o filtro verde (A), com o filtro verde barrado, onde a fluorescncia das clulas da epiderme foi subtrada (B), com o filtro vermelho (C), com luz branca (D). Barra: 10 m; seta: marcao de SBT_Triticum perto da parede celular; tringulo: marcao de SBT_Triticum em local desconhecido. Barra: 10 m.
142
A1
A2
B1
B2
Fig. 4.21 Imunofluorescncia de cortes de folha de trigo com crescimento em meio sem azoto. Possvel marcao de SBT_Triticum perto da parede celular.
Visualizao de cortes de folha de trigo incubados em tubo Eppendorf, com as sondas antiSBT_Triticum abs: anti-rato_IgG abs: Alexa 488 e anti-LSU abs: anti-coelho_IgG abs: Alexa 555, colocados sobre uma lmina e visualizados com o filtro verde. A1 e A2- dois planos de focagem onde detectada a protease em local desconhecido (seta); B1 e B2- dois planos de focagem onde detectada a protease em local desconhecido, 1- marcao de SBT_Triticum perto da parede celular; 2- marcao de SBT_Triticum em local desconhecido. Barra: 5 m.
Na Fig. 4.22, a subtilisina detectada na vizinhana dos cloroplastos. Estes cortes foram estendidos sobre a lmina para microscpio com a ajuda de uma pina. Nesta altura, algum do contedo celular desprendeu-se do corte original e dispersou-se na lmina. Na Fig. 4.22C observa-se, provavelmente, um corpo proteico ou uma vescula contendo material biolgico derivado de cloroplastos; uma vez que vermelho/laranja, este corpo proteico est rodeado de pequenos pontos verdes, correspondentes marcao para a protease.
143
A1
A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8
A9
A10
B1
B2
C1
C2
C3
C4
D1
D2
D3
D4
Fig. 4.22 Imunofluorescncia de cortes de folha de trigo. Possvel marcao de SBT_Triticum na vizinhana dos cloroplastos.
Os cortes foram incubados com as sondas anti-SBT_Triticum abs: anti-rato_IgG abs: Alexa 488 e anti-LSU abs: anti-coelho_IgG abs: Alexa 555 em tubo Eppendorf, colocados sobre uma lmina e visualizados com o filtro verde: (A1a A5, B1, C1 a C2 e D1), com filtro verde barrado (D3), com o filtro vermelho (A6 a A7, B2, C3 e D2), com luz branca (A8, C4 e D4) ou com luz branca e filtro verde (A9 a A10)). A, B e C- Trigo com crescimento em meio completo; D- Trigo com crescimento em meio sem azoto. A- Cloroplasto solto que no estava fixado lmina, como rodava foi possvel observ-lo sob diferentes ngulos; B- Grupo de cloroplastos soltos com marcao na sua vizinhana; C- Observao de um provvel corpo proteico ou vescula e de cloroplastos. com dois
144
planos de focagem (C1 e C2); D- Cloroplasto solto. seta: exemplo de marcao para a SBT_Triticum; Barra: 5 m.
Num conjunto de cloroplastos soltos na lmina, provenientes de cortes de folhas de trigo sujeitos a ausncia de azoto, detectou-se a protease na vizinhana dos cloroplastos (Fig. 4.23). Mas, devido existncia de uma estrutura celular, ainda que rudimentar, foi possvel correlacionar esta marcao com a marcao detectada em folhas de A. thaliana e de soja, que detectava vesculas associadas senescncia- SAV; estas mltiplas vesculas foram induzidas em condies de stresse ou de senescncia (Otegui et al., 2005). Uma marcao semelhante, mas, menos intensa, foi observada tambm num conjunto de cloroplastos provenientes de folhas de trigo com crescimento em meio completo (Fig. 4.24).
Fig. 4.23 Imunofluorescncia de cortes de folha de trigo com crescimento em meio sem azoto. Possvel marcao em vesculas associadas senescncia SAV.
Conjunto de cloroplastos soltos na lmina provenientes de cortes de folha de trigo com crescimento em meio sem azoto, incubados em tubo Eppendorf, com as sondas antiSBT_Triticum abs: anti-rato_IgG abs: Alexa 488 e anti-LSU abs: anti-coelho_IgG abs: Alexa 555, colocados sobre uma lmina e visualizados com o filtro verde: (A) e com o filtro vermelho (B); a seta indica uma marcao para a protease que pode encontrar-se dentro de uma pequena vescula.Barra: 5 m.
145
A1
B1
A2
B2
Fig. 4.24 Imunofluorescncia de cortes de folha de trigo com crescimento em meio completo. Possvel marcao em vesculas associadas senescncia SAV.
Conjunto de cloroplastos soltos na lmina proveniente de cortes de folha de trigo com crescimento em meio completo, incubados em tubo Eppendorf, com as sondas anti-SBT_Triticum abs: antirato_IgG abs: Alexa 488 e anti-LSU abs: anti-coelho_IgG abs: Alexa 555, colocados sobre uma lmina e visualizados com o filtro verde: (A) e com o filtro vermelho (B); 1 e 2- dois planos de focagem. a seta indica uma marcao para a protease que pode encontrar-se dentro de uma pequena vescula. Barra: 5 m.
146
4.3.5 Avaliao de plantas de Arabidopsis thaliana com insero de T-DNA no locus AT3g14067 codificante para a subtilisina
A subtilisina, SBT_AT, est codificada no locus AT3g14067 e a subtilisina de Arabidopsis thailiana homologa da subtilisina de trigo em estudo. O estudo de plantas que no expressam a subtilisina poder conduzir elucidao da sua funo celular. Recorreu-se, por isso, base de dados do TAIR que guarda a informao sobre as plantas de Arabidopsis thaliana transformadas: qual a alterao gentica que contm, quem as transformou, qual o processo de transformao e como podem ser adquiridas. Neste caso, as plantas foram transformadas no laboratrio do Joseph Ecker que efectuou inseres ao acaso de T-DNA no DNA de A. thaliana, seleccionou as plantas transformadas, determinou qual o local de insero, depositou esta informao na base de dados e doou as sementes para a coleco do NASC (Alonso et al., 2003). Escolheram-se trs polimorfismos com insero de T-DNA em vrios locais do locus AT3g14067 e tentaram seleccionar-se plantas homozigticas para a insero que, em princpio, no expressassem a protease SBT_AT. Embora este trabalho no tenha sido conduzido da melhor forma, apresenta-se aqui descrito como guia para as dificuldades que se podem encontrar.
4.3.5.1 Determinao do gentipo dos polimorfismos seleccionados

A primeira avaliao realizada foi a confirmao da insero de T-DNA no local indicado pelo laboratrio de Joseph Ecker (Alonso et al., 2003). A confirmao da insero foi efectuada por PCR, aps a cultura em vaso das plantas recebidas. Cada planta foi numerada e todas as plantas da famlia A110 provm das sementes recebidas do polimorfismo MT1, as plantas da famlia A2 pertencem ao polimorfismo MT2 e as da famlia A3 pertencem ao polimorfismo
Nos estudos, em que necessrio conhecer a ascendncia de determinada planta, utilizouse uma numerao das plantas apropriada a estes casos. A numerao inicia-se por uma letra que determina a altura de plantao das plantas. Esta letra seguida de um nmero que, em conjunto com a primeira letra, determina a famlia das plantas e identifica o ascendente (registado). Segue-se outro nmero que identifica os membros (irmos) dessa mesma famlia.
10
147
MT3 (estes polimorfismos encontram-se identificados no seco 4.2.6 e foram produzidos por insero de T-DNA na regio codificante do gene AT3G14067, Sbt_AT). O tamanho do produto de PCR esperado varia de acordo com os primers utilizados, que para o gene sem insero (WT) de cerca de 450, 540 e 540 para o polimorfismo MT1, MT2 e MT3, respectivamente; com insero de T-DNA (T-DNA), de cerca de 800, 850 e 850 para o MT1, MT2 e MT3, respectivamente. Nenhuma das plantas do polimorfismo MT3 revelou a presena de T-DNA no local indicado (Fig. 4.25).
A1650
A2-
A3-
M 1 2 3 4 5 8 9 12 14 1 2 3 4 5 6 8 14 15 18 1 5 6 7 9 11 15 16 17 WT
650
T-DNA
Fig. 4.25 Electroforese em gel de agarose dos produtos de PCR das famlias A1, A2 e A3.
WT- PCR efectuado com primers para a no-insero; T-DNA- PCR efectuado com primers para a insero. M- marcadores de pares de bases.
Escolheram-se as sementes da planta A2-6, um heterozigtico para a insero, para constituir a famlia B1 que composta por 36 plantas que cresceram em vasos e cujo o gentipo foi verificado por PCR (Fig. 4.26). No se obteve a segregao dos alelos esperada de 25%, 50%, 25%; em vez disso, a presena da insero encontra-se diminuda (Fig. 4.26-D). Pode colocar-se a hiptese de as plantas homozigticas para a insero terem a sua produo de poln comprometida, o que plausvel uma vez que este gene fortemente expresso no gro de poln (Fig. 4.8). Durante o trabalho experimental observou-se, tambm, que na descendncia de plantas homozigticas para insero, cujo gentipo foi determinado por PCR, se obtm muitas plantas heterozigticas; por isso, pensou-se que o resultado do
148
PCR se devia amplificao de outros genes do tipo de subtilisina11 e que a ausncia de produto de PCR para o produto WT, em algumas plantas, se devia a falhas no PCR. Pelos motivos expostos anteirormente, tentou fazer-se a seleco dos homozigticos por seleco em meio contendo canamicina, pois, se todas as plantas sobrevivessem, estaramos perante um progenitor homogigtico para a insero. Verificou-se que, na gerao em que as plantas foram recebidas, nenhuma das sementes germinadas apresentava resistncia canamicina. No entanto, nas geraes seguintes, observou-se a expresso do gene de resistncia canamicina obtendo-se duas plantas em que todas as sementes germinadas sobreviveram ao meio com canamicina, as plantas D3-1 e D3-2 (Fig. 4.27, Tabela 4-5). A dificuldade deste mtodo reside na avaliao das plantas sobreviventes, pois pode acontecer que as plantas sejam homozigticas para a insero e no estejam a expressar o gene que confere resistncia canamicina. Por isso, este mtodo no se revelou til na determinao do gentipo das plantas. O melhor mtodo teria sido determinar o gentipo por PCR e verific-lo em Southern blot.
Embora a especificidade dos primers tenha sido avaliada por pesquisa nas bases de dados, por BLAST, e tenham sido considerados especficos para o gene AT3G14067.
11
149
1 2
3 4
6 7 8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 M 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
650
B
650
C
650
Wild Type (AA)
36%
Heterozigtico para a insero (Aa) 47% Homozigtico para a insero (aa) 17%
Fig. 4.26 Electroforese em gel de agarose dos produtos de PCR da famlia B1.
A- Electroforese dos produtos de extraco de DNA; B- Electroforese dos produtos de PCR efectuado com primers para a no-insero (WT); C- Electroforese dos produtos de PCR efectuado com primers para a insero (T-DNA); D- Segregao dos alelos.
Fig. 4.27 Germinao das sementes de A. thaliana em meio selectivo, contendo canamicina.
A- Sementes provenientes da planta A2-1; B- Sementes provenientes da planta C9-1.
150
Tabela 4-5 Percentagem de plantas sobreviventes em meio com canamicina depois de terem germinado.
Sementes da planta (gentipo) A1-1 (Aa) A2-1 (Aa) A2-2 (aa) C1-2 (aa) C9-1(aa) Progenitor (gentipo) Resistentes Total de sementes germinadas Gerao 12 semente da
Mt1 (?) 0% Mt2 (?) 0% Mt2 (?) 0% A2-2 (aa) 88% B1-34 (aa) (progenitor 75% A2-6 Aa) D1-3* (?) A1-1 (Aa) 73% D1-6* (?) A1-1 (Aa) 0% D2-1 (?) A2-1 (Aa) 63% D2-2* (?)- A2-1 (Aa) 0% D3-2 (?) C1-2 (aa) 100% D3-1*(?) C1-2 (aa) 100% D4-1*(?) C9-1 (aa) 86% D4-2 (?) C9-1 (aa) 66% *plantas seleccionadas para realizar um immunoblot". insero; aa- homozigtico para a insero.
40 45 35 40 75
F4 ou F5 F4 ou F5 F4 ou F5 F5 ou F6 F6 ou F7
38 F5 ou F6 42 F5 ou F6 37 F5 ou F6 41 F5 ou F6 19 F6 ou F7 20 F6 ou F7 15 F7 ou F8 25 F7 ou F8 Gnotipo: Aa- heterozigtico para a
4.3.5.2 Avaliao do teor de SBT_AT e de LSU em plantas de A. thaliana com 35 dias de idade.
Escolheram-se duas plantas descendentes de A1-1, um heterozigtico do polimorfismo MT1, com insero de T-DNA no final do gene confirmada por PCR: as plantas D1-3 e D1-6. Seleccionaram-se, tambm, trs plantas pertencentes ao polimorfismo MT2, cuja avaliao do gentipo dos progenitores, por PCR, as apresentava como heterozigticos para a insero, a planta D2-2 (progenitor A21) ou como homozigticos para a insero as plantas D3-1 e D4-1 (progenitores C1-2 e C9-1, respectivamente). As plantas seleccionadas cresceram em vasos durante 35 dias, altura em que foram colhidas amostras de folhas da roseta e de folhas c a u l i n a r e s . O desenvolvimento das plantas seleccionadas foi heterogneo (Fig. 4.28). A nica planta que apresenta um fentipo tpico das plantas de A. thaliana foi a planta D16, as outras plantas apresentaram um crescimento das folhas da roseta no caracterstico, por exibirem um desenvolvimento no uniforme da roseta ou das folhas. Contudo importante referir que a variabilidade fentipica detectada pode
12
As plantas foram recebidas na gerao F3 ou F4, segundo as indicao do NASC
151
dever-se a diferentes condies experimentais durante o crecismento das plantas, sobretudo devido no uniformidade do ar condicionado da cmara de crescimento onde se desenvolveram. As plantas de A. thaliana so muito sensveis quantidade de gua presente no vaso e humidade relativa da atmosfera, o que nas condies de cultura utilizadas pode ter sido varivel. Por lapso, o gentipo destas plantas no foi determinado por PCR.
D1-6
D2-2
D3-1
D4-1
Fig. 4.28 Aspecto geral de plantas de A. thaliana com 35 dias de idade.

D1-6: polimorfismo MT1, progenitor heterozigtico; D2-2, D3-1 e D4-1: polimorfismo MT2, progenitor da planta D2-2 heterozigtico para a insero; progenitor das plantas D3-1 e D4-1 homozigtico para a insero.
Pretendeu-se determinar por immnunobloting a quantidade de SBT_AT presente em cada uma das amostras. Para isso, extraiu-se a protena total solvel, quantificou-se a quantidade de protena total e sujeitou-se a electroforese e immunobloting 100 g de protena total sluvel (Fig. 4.29). O immnunoblot foi primeiro revelado para a protena total, com o corante amido black (Fig. 4.29A), seguido de uma revelao para a subtilisina, SBT_AT (Fig. 4.29B), com o anticorpo anti-SBT_AT, e, por ltimo, com uma revelao para a LSU, com o anticorpo anti-LSU (Fig. 4.29C).
152
M M/5 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 A
M M/5 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 B
M M/5 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5C
66 52
SBT_AT1 SBT_AT2
LSU
14
D
Coluna 1 1 Tipo de caulinar roseta folha D1-3 SBT_AT2 0 0 LSU 51,2 < 142,1 *SBT_AT --0 2 2 2 caulinar roseta 3 caulinar 3 roseta 4 4 5 5 caulinar roseta caulinar roseta
D1-6 0 96,9 < 0
0 100,3 0
D2-2 81,2 156,0> 52.0 <
100,0 100,0 100,0
D3-1 47,1 93,1 < 50,6 >
27,9 162,0 17,2
D4-1 39,9 70,9 < 56,3 >
36,3 77,9 46,0
Fig. 4.29 immunoblots do extracto de protena total de vrias plantas de A. thaliana revelado com os anticorpos anti-SBT_AT e anti-LSU.
Os extractos totais de folhas de A. thaliana, contendo 100 g de protena total foram sujeitos a SDS-PAGE e os polipptidos foram transferidos para uma membrana de nitrocelulose. 1 e 1Planta D1-3; 2 e 2- Planta D1-6; 3 e 3- Planta D2-2; 4 e 4- Planta D3-1; 5 e 5- Planta D4-1; 1, 2 e 3- Folhas da inflorescncia; 1,2 e 3- Folhas da roseta; M- Soluo contendo cerca de 10 g de rubisco de Lemna minor e cerca de 1 g do polipptido T1800 de trigo; M/5- Soluo M diluda 5 vezes. A- membrana de transferncia corada com amido black para a protena total B- Primeira revelao da membrana como anticorpo SBT_AT (1:1000); C- Segunda revelao da membrana com o anticorpo anti-LSU (1:500). D- Valores relativos do teor de SBT_AT e LSU, tomando como referncia a coluna 3 (D2-2, folhas da roseta), * SBT_AT2 valores relativos de subtilisina que seriam obtidos se se tivesse adicionado, a cada coluna do gel, igual quantidade de rubisco. SBT_AT1 pr-protena com aprox. 69 kDa; SBT_AT2 protena com aprox. 63 kDa. > e < valor relativo da quantidade de sinal na folha caulinar relativamente s folhas da roseta.
Nas plantas D1-3 e D-6 que apresentavam um crescimento caracterstico para a espcie de A. thaliana, a subtilisina no foi detectada. Nas plantas com um desenvolvimento deficiente foi detectada a presena da subtilisina em 100 g de protena total (D2-2, D1-3 e D1-6). Infelizmente, no foi efectuado nenhum PCR para determinao do gnotipo destas plantas, no se conhecendo com rigor o gnotipo destas plantas. No entanto, sendo as plantas D1-3 e D4-1 descendentes de plantas homozigticas para a insero de estranhar a presena de subtilisina nestas plantas. Contudo, se se verificar uma deficiente produo de plen, estas plantas podero ser
153
heterozigticas para a insero, por ocorrncia de polinizao cruzada. O gnotipo das plantas D1-3, D1-6 e D2-2, impossvel de prever, uma vez que os progenitores so heterozigticos para a insero. A revelao do immunoblot com o anticorpo anti-LSU (Fig. 4.29 C) apenas revelou a LSU presente no marcador, proveniente da rubisco de Lemna minor. Por isso, a quantidade relativa de LSU foi calculada a partir do "blot" revelado com amido black (Fig. 4.29 A). A coluna 3 (folha da roseta da planta D2-2) apresenta a maior quantidade de SBT_AT detectada e foi seleccionada como valor de referncia de 100%. A maior quantidade de LSU foi detectada nesta planta, mas nas folhas da influorescncia. O que o contrrio de todas as outras plantas, em que a maior quantidade de LSU detectada nas folhas da roseta. No se observa nenhuma relao directa entre a quantidade de subtilisina e a quantidade de LSU presente nas diferentes folhas. Isto , existem folhas com elevada quantidade de LSU e com nenhuma quantidade de subtilisina (D1-6) e temos folhas com enorme quantidade de LSU e enorme quantidade de subtilisina (D2-2).
154
5 DISCUSSO GERAL
O objectivo deste trabalho foi de tentar elucidar a relao que ocorre, in vivo, entre a protease purificada e a degradao da rubisco. A bibliografia sobre subtilisinas extensa e variada, uma vez que estas proteases esto presentes em muitos organismos diferentes, como as bactrias, as plantas ou os animais, e, apesar de terem uma actividade proteoltica comum, apresentam funes celulares especficas. Num mesmo organismo, podem existir subtilisinas diferentes com funes distintas. Por isso, a pesquisa bibliogrfica sobre subtilisinas centrou-se no estudo das caractersticas comuns generalidade das subtilisinas, preferindo-se estudar detalhadamente o seu possvel papel na degradao da rubisco. Durante a realizao deste trabalho obtiveram-se alguns resultados inesperados, como foi a deteco da rubisco nas razes de pinheiro manso e no se ter verificado a localizao da protease SBT_Triticum nos cloroplastos. O motivo da presena de rubisco nas razes desconhecido. A subunidade pequena da rubisco (RbcS1A) codificada por um dos genes mais expressos nas folhas, com um percentil de sinal13 comum acima dos 99,8, em A. thaliana. Nas razes a SSU expressa em menor grau e a variao logartmica (Log2) do valor do sinal das razes relativamente ao valor do sinal de controlo
14
de 3,29 (Log2)
(Winter et al., 2007). Nas razes, a enzima do ciclo de Calvin, fosforribulocinase (E.C. 2.7.1.19; PRK; AT1G32060), que converte a ribulose-5-fostato em ribulose1,5-bisfosfato (o substrato da rubisco), est presente perto do limiar de deteco, com um sinal de 13,9 e cuja variao logartmica (Log2) da razo entre o sinal das razes e o sinal de controlo de -6,43 (Winter et al., 2007). Esta a via utilizada pelas folhas para a formao de RuBP e os fraqussimos valores obtidos tornam a fixao de CO2 na RuBP e nas razes muito pouco provvel.
13
Percentil de sinal, reflecte o sinal do elemento de array (transcrito) em causa, relativamente aos outros elementos do array. Por exemplo, se o percentil do sinal for de 90, isso significa que o seu sinal superior a 90% de todos os elementos de array. 14 Sinal de controlo, neste caso, corresponde ao valor da moda do sinal do elemento de array das experincias que compem o Developmental Map, disponvel no servidor BAR.
155
De acordo Tabita e colaboradores (2008), existem quatro formas de rubisco conhecidas, a forma I, de estrutura quaternria L8S8, a rubisco das plantas e de grande parte dos procariotas autotrficos, a forma II, de estrutura quaternria L2, encontra-se nas bactrias (ex., Rhodospirillum rubrum) e em alguns dinoflagelados, a forma III, de estrutura quaternria (L2)5, foi detectada em arqueobactrias e a forma IV, de estrutura quaternria L2, est presente em proteobactrias e outras bactrias (e. g. Bacillus subtilis), mas tambm no eucariota Ostreococcus tauri. A forma IV a nica que no possui actividade cataltica de fixao de CO2, pois faltam-lhe alguns aminocidos essenciais ao funcionamento do centro activo. Por esse motivo, a forma IV chamada de protena semelhante rubisco (Rubisco like protein - RLP). Os autores sugerem que todas as formas de rubisco tiveram origem na forma III, evoluindo a partir desta. Neste contexto, uma das evolues sofridas pela rubisco foi perder a sua capacidade de fixao do dixido de carbono na ribulose 1,5-bisfosfato (Tabita et al., 2008). A protena semelhante rubisco de Chlorobium tepidum, uma sulfobactria foto-autotrfica, necessria para o correcto desenvolvimento dos pigmentos, estando envolvida no metabolismo do enxofre e na resposta ao stresse oxidativo (Hanson e Tabita, 2001). Em bacillus subtilis, a protena semelhante rubisco, executa a enolisao do 2,3-diceto-5-metiltiopentil-1-fosfato (DK-MTP-1-P), durante a retirada de metionina inserida em poliaminas txicas (e.g putrescina) (Ashida et al., 2008). A estrutura do DK-MTP-1-P muito semelhante RuBP, e quando a RLP foi silenciada e substituida pela rubisco de Rhodospirillum rubrum (forma II, L2) Ashida e colaboradores (2003) observaram que a rubisco da forma II apresentava a capacidade de enolizao do DK-MTP-1-P da RLP, embora a uma taxa muito inferior. Recentemente, Ashida e colaboradores (2008) rejeitaram a hiptese de a forma III da rubisco ser a forma primeira e ancestral da rubisco, argumentando que existem muitas RLP, desde as arqueobactrias at a alguns eucaritas, podendo apresentar funes distintas em cada um dos organismos, sugerindo, por isso, a existncia de uma outra protena ancestral, j extinta, semelhante forma IV da rubisco.
156
Discusso geral
A funo da rubisco nas razes desconhecida, no entanto as experincias de microarray realizadas por Maruyama-Nakashita e colaboradores (2003) mostram uma diminuio da expresso do transcrito de RbcS nas razes de A. thaliana em resposta a uma ausncia de enxofre, prenunciando que a rubisco pode estar a ser expressa nas razes porque executa uma funo vantajosa para a planta. A degradao da rubisco promovida durante a senescncia natural ou induzida por condies de stresse (Feller et al., 2007), desconhecendo-se at que ponto constituem processos diferentes. Neste trabalho, as segundas folhas de plantas de trigo com crescimento em meio sem azoto tiveram, quando comparadas com o controlo, um perodo de vida mais curto. A degradao da rubisco nas folhas destas plantas foi claramente diferente em cada tipo de tratamento: nas plantas de controlo, o contedo de rubisco permanece sempre elevado e a degradao progride de acordo com os sintomas visveis do processo de senescncia, isto , desde a ponta at base da folha; nas plantas em stresse a degradao da rubisco ocorre ao longo de toda a folha, mesmo onde no se observam sintomas visveis de senescncia, observando-se tambm
destabilizao da rubisco na parte basal das folhas, a ltima a senescer. A variao do teor em SBT_Triticum nas folhas de trigo entre os dois tratamentos no foi to evidente, provavelmente devido s caractersticas da prpria subtilisina que, em SDS-PAGE, se desdobra em vrios polipptidos. Observou-se para o polipptido SBT_Triticum.2, um pequeno aumento nas folhas em stresse, que acompanha a destabilizao observada da rubisco. No entanto, se considerarmos os polipptidos SBT_Triticum.3 e 4 como produtos de degradao da protease e indicativos da actividade da prpria protease, ento, a correlao com a degradao da rubisco mais elevada, observando-se a degradao da rubisco quando se detectam estes subprodutos da subtilisina. Algumas subtilisinas tm capacidade autocataltica, que se mantm a temperaturas elevadas e em condies desfavorveis, como o tampo de electroforese (Yamagata et al., 1989; Janzik et al., 2000; Hamilton et al., 2003; Coffeen e Wolpert, 2004).
157
Os polipptidos SBT_Triticum.3 e SBT_Triticum.4 podem pertencer a outras subtilisinas presentes nas folhas, sendo de esperar que existam mais de 50 subtilisinas diferentes em trigo, uma vez que existem 64 em arroz e 56 em A. thaliana (Rautengarten et al., 2005; Tripathi e Sowdhamini, 2006). Contudo, a subtilisina homloga da SBT_Triticum em Arabidopsis thaliana, AT3G14067, a nica que ao, nvel da transcrio do gene, apresenta uma relao com a expresso da rubisco; positiva quando se comparam diferentes rgos da planta (e.g. folhas, razes e flores) e negativa quando se comparam diferentes estdios do desenvolvimento foliar (folhas da roseta no senescentes versus folhas da roseta senescentes). Uma caracterstica das subtilisinas serem produzidas na forma de zimognios e, portanto, inactivas quando so produzidas. Algumas delas tm capacidade autocataltica, o que pode significar que, uma vez activas, tambm se autodestroem. Pelo menos parcialmente, isto implica que a quantidade detectada de uma subtilisina deste gnero pode no reflectir a sua actividade in vivo, j que os seus fragmentos podem estar providos de uma maior ou menor actividade cataltica. Quando a sua expresso induzida, a sua actividade deve aumentar, aumentando tambm a sua autodegradao. Se a degradao da protease induzir um aumento da sua prpria expresso, ento a quantidade de subtilisina depende, em cada momento, da sua prpria actividade. Pode por-se a hiptese de, em alguns casos, ser a presena do prprio substrato que, ao ligar-se protena inactiva, induz modificaes estruturais na enzima, promovendo a sua autoactivao. Neste caso, estaramos prerante uma forma de auto-regulao que explicaria a sua expresso especfica, temporal e espacial.
A SBT_Triticum no foi detectada em cloroplastos purificados e sujeitos a immubobloting. A localizao da SBT_Triticum foi efectuada por microscopia de fluorescncia, utilizando os anticorpos produzidos neste trabalho. Na observao de lminas de controlo, com cortes de folhas de trigo incubados com soro primune, mas sem os anticorpos especficos, detectaram-se muitas estruturas vesiculares fluorescentes, que parecem corresponder sada do cloroplasto dos produtos de degradao da clorofila, como foi observado por Guiamet et al. 158
Discusso geral
(1999). Neste trabalho, a sonda utilizada para a rubisco impossvel de detectar, visto o espectro de emisso da sonda coincidir com a autofluorescncia da clorofila. Contudo, a SBT_Triticum foi detectada na vizinhana dos cloroplastos, muitas vezes na sua periferia e, provavelmente, dentro de vesculas cuja distribuio, nas plantas em stresse, as torna semelhantes s vesculas associadas senescncia (SAV). Se esta protease degradar efectivamente a rubisco, tem uma funo semelhante a protease C1 da soja, uma subtilisina localizada nos PSV (protein storage vacoule), activada por uma diminuio do pH e que degrada parcialmente as subunidades e da protena de reserva conglicinina (He et al., 2007). Os resultados deste trabalho sugerem o envolvimento da protease SBT_Triticum na degradao da rubisco: por um lado, a rubisco um substrato in vitro desta protease; por outro, a sua quantidade e/ou actividade aumenta de acordo com a degradao observada da rubisco. No entanto, estes resultados no deixam de ser circunstanciais e o papel efectivo desta subtilisina pode ser indirecto, envolvendo o processamento de outras protenas. Neste caso, esta subtilisina teria uma funo semelhante s pr-convertases dos animais e semelhante subtilisina SDD1 de A. thaliana. A aco desta ltima resulta de um equilbrio com outra protena, o receptor TMM, estabelecendo, ambos, a distribuio e densidade dos estomas (Von Groll et al., 2002). Os programas informticos de determinao da localizao celular predizem que a maioria das proteases de subtilisinas de plantas pertence via secretora. Embora a localizao intracelular de algumas esteja prevista, com base na sequncia sinal, nos mitocndrios ou cloroplastos, nenhuma foi ainda a detectada. As subtilisinas so sintetizadas no retculo endoplasmtico rugoso e processadas no complexo de Golgi (e.g. glicosilao). Podem, por isso, localizarse em vesculas, no vacolo ou fora da clula. A subtilisina aqui identificada tem como sua homloga, em A. thaliana, a SBT_AT (AT3g14067), que pertence ao grupo 1 das subtilisinas de A. thaliana, da qual faz parte a ARA12 (Rautengarten et al., 2005). Ao nvel da estrutura de nvel primrio so muito semelhantes; no entanto, a ARA12 foi identificada fora da clula (Hamilton et al., 2003) e a SBT_AT no vacolo (Carter et al., 2004; Jaquinod et al., 2007). Estas duas 159
subtilisinas tm ambas expresso constitutiva, mas so expressas em maior grau em fases diferentes do desenvolvimento celular: a SBT_AT mais expressa nas folhas senescentes, nas folhas caulinares e no gro de plen, enquanto a ARA 12 mais expressa nas silquas, durante o desenvolvimento das sementes e durante a fase de imbibio e germinao das sementes (Winter et al., 2007). A anlise da expresso gnica das proteases de A. thaliana foi conduzida de modo a seleccionar as proteases preferencialmente presentes nos tecidos fotossintticos e com uma maior expresso nas folhas senescentes. Entre elas encontra-se a subtilisina SBT_AT. Esta subtilisina tem uma expresso similar protease de cistena RD21A, apresentando uma correlao de Pearson linear entre ambas de 0,515, para 920 experincias de microarray: AtGenExpress, um valor que sobe para os 0,944 quando se consideram apenas 27 experincias efectuadas nas folhas (AtGenExpress: Development baseline II) (Zimmermann et al., 2004). Thoenen et al. (2007) sugerem o envolvimento de uma protease de cistena na degradao da rubisco, observada em folhas de trigo sujeitas a stresses especficos. O mesmo foi sugerido por Prins e colaboradores (2008) em folhas de tabaco. A anlise efectuada s experincias de microarray sugere que essa protease a protease de cistena RD21A localizada no locus ATG47128.
A degradao da rubisco pode ocorrer dentro dos cloroplastos e, talvez, fora dos cloroplastos, uma vez que j foi detectada em corpos proteicos envolvidos por uma membrana, nos RCB (Chiba et al., 2003). Posteriormente foi demostrado que o estroma dos cloroplastos pode ser removido para o vacolo, atravez da formao de vesculas, sem a detruio dos cloroplastos (Ishida et al., 2008). O estudo da expresso gnica apoia, tambm, a existncia de duas vias para a degradao da rubisco, uma interna dos cloroplastos e outra externa aos cloroplastos. Existem proteases presentes nos cloroplastos que aumentam a sua expresso durante a senescncia. Duas delas so subunidades do complexo CLP com funes reguladoras e, embora o papel deste complexo na senescncia seja controverso, est presente durante a senescncia. Outra protease (entre outras) presente nos cloroplastos a CND41, que tem a capacidade de se ligar ao DNA e de degradar in vitro a rubisco desnaturada (Murakami et al., 2000; Kato et al.,
160
Discusso geral
2004). Neste trabalho a protease SBT_Triticum foi lozalizada na vizinhana dos cloroplastos, provalvelmente dentro de vesculas pertencentes via secretora. As proteases SBT_AT e RD21A foram localizadas no vacolo (Carter et al., 2004; Jaquinod et al., 2007), que um dos destinos da via secretora. Estas proteases esto presentes preferencialmente nos tecidos fotossintticos e a sua expresso aumenta durante a senescncia, podendo pertencer a uma via de degradao da rubisco externa aos cloroplastos. No estudo efectuado neste trabalho, da expresso do gene Sbt_AT (AT3G14067), observa-se que o aumento da expresso deste gene surge antes da diminuio da expresso do RbcS e da senescncia. O mesmo foi observado nas plantas de trigo, em que o aumento de SBT_Triticum (considerando todos os polipptidos) est correlacionado com a degradao da rubisco e antecede a aparecimento dos sintomas visveis de senescncia. O aumento do teor de subtilisina parece estar relacionado com o incio da fase reversvel da senescncia, tal como descrito por Wittenbach (1978). Este autor observou o desenvolvimento de senescncia, em plantas de trigo sujeitas a ausncia de luz, com perda de rubisco, num processo reversvel, durante os dois primeiros dias de imposio de stresse. A fase irreversvel da senescncia poder ser ilustrada pelo estudo efectuado por Minamikawa e colaboradores (2001), em folhas destacadas de feijo e s escuras, em que se observou um decrscimo na populao dos cloroplastos de 45 %, ao fim de oito dias. Seguindo o declnio dos cloroplastos por microscopia electrnica, estes investigadores observaram, no oitavo dia, cloroplastos dentro de vacolos, apresentando uma desordem estrutural e um aspecto rugoso das membranas, sugerindo que teriam sido digeridas pelas enzimas do vacolo.
Pelo exposto, prope-se um modelo para a degradao da rubisco, apresentado na Fig. 5.1 e que envolve a seguinte sequncia de acontecimentos: modificao da rubisco nos cloroplastos (Ferreira et al., 2000; Moreno et al., 2008), excluso da rubisco dos cloroplastos para o RCB (Chiba et al., 2003; Ishida et al., 2008) e trasnformao do RCB em SAV, com incluso da subtilisina em estudo e da protease de cistena RD21A (este estudo). 161
A
Condies oxidativas ROS Presena de inibidores de degradao Rubisco nativa condies oxidativas GSH/GSSH ROS Rubisco oxidada Degradao completa nos cloroplastos Degradao incompleta nos cloroplastos
Rubisco polimerizada
Excluso do cloroplasto Status nutricional (balano carbono/azoto, enxofre); Relao Source/Sink; Desenvolvimento foliar (e.g.senescncia); Stresse.
(Rubisco como protena de reserva?)
Degradao em vesculas
**
Subtilisina em estudo e protease de cistena RD21A
Fig. 5.1 Modelo proposto para a degradao da rubisco

A construo deste esquema baseia-se nos resultados obtidos e na leitura da bibliografia. As setas a tracejado referem um efeito directo de molculas conhecidas sobre a rubisco, o smbolo XXX refere-se a uma inibio ou diminuio do processo em causa, ao contrrio do smbolo XXX que se refere a uma activao ou aumento do processo assinalado. A violeta, destaca-se a hiptese a que se refere este trabalho: *, aumento da SBT_Triticum em consequncia de stresse sem azoto, em folhas de trigo (ver seco 4.3.3) e nveis de transcrio dos genes de SBT_AT e da protease de cistena RD21A, em A. thaliana (ver seco 4.3.1.4 e 4.3.1.5); **, determinao da localizao celular em trigo (ver seco 4.3.4.2). SAV- Senescence Associated Vesicle (Otegui et al., 2005)., RCB- Rubisco containing Body (Chiba et al., 2003).
162
Discusso geral
Neste modelo (Fig. 5.1) no se coloca a possibilidade de sada directa da rubisco nativa, por se admitir que numa situao metablica normal, a rubisco necessita de ser modificada antes de ser degradada (Ferreira et al., 2000; Moreno et al., 2008). As molculas moduladoras de alteraes na degradao da rubisco podem ser derivados de acar que conferem proteco contra a degradao da rubisco (Chen e Spreitzer, 1991; Khan et al., 1999), espcies reactivas de oxignio que provocam alteraes na rubisco ou na sua degradao (Ishida et al., 1999; Moreno et al., 2008) ou molculas que alteram o estado redox do cloroplasto, como os pares redox CSSC/CSC e GSH/GSSG (Garcia-Ferris e Moreno, 1993; Marin-Navarro e Moreno, 2003). A sada da rubisco e do estroma dos cloroplastos foi detectada por Chiba e colaboradores (2003), posteriormente foi proposto que se destinavam ao vacolo central, onde ocorreria a degradao do seu contedo (Ishida et al., 2008). Estudos efectuados neste trabalho mostram, em plantas de trigo, o aumento da expresso de SBT_Triticum em consequncia de um stresse sem azoto, observando-se, em simultneo, da destabilizao da rubisco. A anlise de nveis de expresso de todos os genes de A. thaliana anotados como protease em relao com os nveis de expresso do gene de RbcS inclui os genes das proteases SBT_AT e cistenaRD21A. Refere-se, ainda, que em A. thaliana os nveis de expresso da protease SBT_AT aumentam em consequncia de um stresse oxidativo (Ditzer et al., 2004), genotxico (Puchta e Chen, 2004), secura (DÀngelo et al., 2004a), salino (DÀngelo et al., 2004c) e smotico (DÀngelo et al., 2004b), por ordem crescente do aumento dos nveis de expresso. Nos estudos de microscopia de imunofluorescncia, a SBT_Triticum foi localizada na vizinhana dos cloroplastos, provavelmente dentro de vesculas, com uma distribuio semelhante das vesculas associadas senescncia (Otegui et al., 2005). Um modelo semelhante a este, em que se coloca a hiptese da sada de rubisco do cloroplasto, foi proposto por Martinez e colaboradores (2008), que detectaram a presena de rubisco e de outras protenas do estroma dos cloroplastos em vesculas associadas senescncia, sendo posteriormente proposto que a degradao ocorreria pela aco de uma protease de cistena
163
(Prins et al., 2008). A corroborar esta hiptese est o trabalho realizado por Wada et al. (2009), onde se demonstra a existncia de degradao autofgica dos cloroplastos e o transporte dos cloroplastos para os vacolos.
164
6 CONCLUSES
Durante a realizao deste trabalho, determinou-se cerca de dois teros da sequncia do gene que codifica a protease SBT_Triticum, a qual permite identificar especificamente esta protease (EU431190). No foi possvel efectuar a sequenciao completa deste gene, provavelmente devido ao elevado teor em G C contido na molcula do cDNA e consequente formao de estruturas secundrias, mais ou menos estveis (-477 kJ/mol a 94 oC). A comparao da sequncia determinada, EU431190, com as sequncias de outras subtilisinas insere-a no grupo 1 das subtilisinas de A. thaliana, apresentando maior semelhana com a protease do locus AT3G14067 (SBT_AT). Estas subtilisinas so sintetizadaszidas na forma de zimognio, tornando-se activas por remoo da regio N-terminal (Fig. 3.7 e Fig. 3.10). A SBT_Triticum uma subtilisna com capacidade de degradar in vitro a rubisco, sendo a actividade proteoltica mais intensa quando se utiliza a rubisco oxidada como substratos (Fig. 3.17); a sua actividade poder ser modulada por fosforilao (Fig. 3.23). A SBT_Triticum est localizada na vizinhana dos cloroplastos,
provavelmente em vesculas associadas senescncia (SAV) (Fig. 4.23 e Fig. 4.24). A expresso da SBT_AT maior em folhas senescentes, no plen, nas folhas da base da inflorescncia e nas folhas vegetativas, por ordem decrescente (Fig. 4.8). A anlise da transcrio gnica em A. thaliana revela que a SBT_AT tem uma expresso semelhante a outras proteases, tais como a protease de cistena RD21A (Fig. 4.10). O stresse imposto pela ausncia de azoto promove a degradao da rubisco ao longo de toda a folha, diferenciando-se da senescncia observada em meio completo, onde a degradao da rubisco fracamente observada na parte terminal das folhas (Fig. 4.16). O aumento da quantidade de SBT_Triticum est associado ao aparecimento de novos polipptidos de SBT_Triticum (Fig. 4.16), evidenciando que pode ter ocorrido um aumento na expresso da SBT_Triticum coincidente com um
165
aumento do processamento e/ou protelise da enzima. Como algumas subtilisinas tm capacidade autocataltica, o aparecimento de novos polipptidos desta protease pode indicar que se encontra cataliticamente activa (Fig. 3.18 e Fig. 3.22). O aumento da quantidade de SBT_Triticum, contando com os novos polipptidos detectados, correlaciona-se com o padro de degradao observado para a rubisco (Fig. 4.16). Em conjunto, os resultados obtidos sugerem uma particpao desta protease na degradao da rubisco ocorrida fora dos cloroplastos (Fig. 5.1).
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7 PERSPECTIVAS FUTURAS
O estudo da degradao da rubisco conduziu formulao da hiptese da degradao ocorrer fora dos cloroplastos, o que sustentado por outros autores (Prins et al., 2008; Wada et al., 2009; Ishida et al., 2008) e purificao de uma protease de subtilisina circunstancialmente relacionada com a degradao da rubisco. Alguns resultados obtidos no foram satisfatrios, como o trabalho desenvolvido com as plantas mutantes de Arabidopsis thaliana, por no se ter obtido nenhum mutante homozigtico confirmado. Por isso, poderia iniciar-se novamente a seleco do mutante homozigtico, confirmando-o pela tcnica de Southern blotting, tomando as seguintes precaues: (i) isolar as plantas homozigticas para evitar a polinizao cruzada: uma vez que a expresso desta subtilisina aumenta no gro de plen, podero estar a ocorrer deficincias na sua sntese (avaliar este parmetro); (ii) colher apenas as sementes maduras e efectuar um ensaio de viabilidade das plantas; e (iii) controlar devidamente as condies de cultura, para a obter plantas mais homogneas e detectar diferenas no proteoma destas plantas. Embora os anticorpos produzidos para a planta de A. thaliana tenham sido efectuados com a sequncia de nucletidos que codificam a subtilisina de A. thaliana e, teoricamente, reconheam esta subtilisina, seria prudente determinar, em dois ou trs fragmentos, a sequncia de resduos de aminocidos dos polipptidos reconhecidos pelos anticorpos anti-SBT_AT. A tcnica de microscopia de imunofluorescncia pode gerar falsos positivos (Lakowicz, 2006). Por isso, a localizao celular deve ser confirmada pela utilizao de outros mtodos, por exemplo, por purificao do compartimento em causa. A confirmao da localizao celular pode tambm ser efectuada com um controlo negativo, em que se utilizam plantas mutantes que no expressam o antignio reconhecido pelo anticorpo, apesar de se ter utilizado soro pr-imune de rato e coelho como controlo negativo. Foi proposto um mecanismo de regulao da expresso e actividade das subtilisinas, com o objectivo de explicar a existncia de vrias subtilisinas e a sua
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expresso temporal e espacial especfica nas plantas, utilizando-se a sua capacidade autocataltica como motor e o facto de serem produzidas na forma de zimognio (ver Tabela 1). Neste mecanismo, as subtilisinas seriam activadas pelo seu substrato, tornando-se activas, promovendo a sua auto-degradao e induzindo a sua expresso. Uma forma possvel de tentar demonstrar este mecanismo seria induzir a expresso de pequenos fragmentos resultantes da degradao da protease em plantas transgnicas. Utilizando-se cultura de clulas tambm, se poderia tentar introduzir estes fragmentos em protoplastos e monitorizar a expresso da subtilisina. Seria tambm um estudo interessante procurar outros substratos e inibidores naturais para esta subtilisina. A protena codificada no locus AT2G10940, anotada como inibidor de proteases (TAIR, 2007b), localizada nos cloroplastos (Froehlich et al., 2003) e cuja expresso gentica diminui consideravelmente durante a senescncia poderia ser utilizada para determinar se poder constituir um inibidor para a subtilisina em estudo. A rubisco frequentemente considerada como contaminante quando detectada fora do cloroplasto. Chiba et al. (2003) mostraram a presena de rubisco, ou de produtos derivados de rubisco dentro de membranas, a que chamaram Rubisco Containing Bodies (RCB). Seria interessante poder acompanhar o destino destes corpos proteicos. A degradao da rubisco pode ser iniciada nestes corpos proteicos, que se poderiam transformar/converter em vesculas de degradao, as SAV. Por isso, poderiam ser estudados em situaes de crescimento normal, de stresse e durante a senescncia, monitorizando-se a velocidade de formao e de degradao, assim como o destino do seu contedo. Com a descoberta destas vesculas (Otegui et al., 2005; Prins et al., 2008; Wada et al., 2009; Ishida et al., 2008) colocam-se novas questes: como e quando se formam, quanto tempo duram, como se desmantelam e para onde se dirigem?
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187
188
ANEXO I: Lista dos primers utilizados neste trabalho

Tabela I- Lista de todos os primers utilizados neste trabalho Identificador 1515+P171617-P15+ 18+ 22232425+ 26+ 27-P28+ 28+P273race inner15 3race outer16 30+ 31+ AD1 AD2 AD3 AD4 Arz1+ Arz2+ AT1+p2- ou AT+ AT2-P1+ ou ATat5raceatactivaprotSequncia
5'-GCGCCGACGGTCAGTATCCAC-3' 5'-CGAGAGTACACCGCGAGCAAC-3' 5'-GTTGCTCGCGGTGTACTCTCG-3' 5'-GTGAAGACGGCGATCTGGGAC-3' 5'-GCTCGGCGACGGCAGTGTGTA-3' 5'-TCGGCGGGGAACTCACGGTCG-3' 5'-CACGCCGCCGTACACACTGCC-3' 5'-GGATCCCCGGCGTACAGTGAC-3' 5'-CGACGAGACGCTGGAGTCCAA-3' 5'-CGGCAAGCACAATGTCACGAG-3' 5'-AAAGCCGGGAGCCACAGTC-3' 5'-GGCCGTCTTCTCGTCGTACAA-3' 5'-CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTATAGG-3' 5'-GCGAGCACAGAATTAATACGACT-3' 5'-CCGGGTAGTTGAGGTCGTTGC-3' 5'-GCATTGGCACTGTCGTCACAC-3' 5'-NGTCGASWGANAWGAA-3' 5'-TGWGNAGSANCASAGA-3' 5'-AGWGNAGWANCAWAGG-3' 5'-STTGNTASTNCTNTGC-3' 5'-GGCGTTCCTCCACCTTACCCA-3' 5'-GCGGCCACGGTTGCTCTACTC-3' 5'-CACCATTCTTAAACCGGACGTGAT-3' 5'-CTAACCGGACTCTTAACAACGTGT-3' 5'-GACGAGCGGAGAAGCCATGAACG-3' 5'-TCAGAAGGACTGAACTGATCCC-3'
15 16
FirstChoice RLM RACE Kit, Ambion. FirstChoice RLM RACE Kit, Ambion.
189
atactivaprot+ FADL300 FADL523 fadprotfadprot+ FADR207 FADR238 FADR258 FADR273 FADR536 LBa1 LBb1 mT1a mT1b mT2a mT2b mT2c mT3a mT3b MT3c rub+ervilha rub-ervilha RUBPRUBP+ trgtrg 14trg+ trg10trg11trg12trg12+ trg13trg13+ 190
5'-CACCACTCACACGCCTGCCTT-3' 5'-GCAAGGCAAGGTGATCTACC-3' 5'-GACGGCTCATTCTTCACAGG-3' 5'-CTACATGCGCCTCGAATCACTGT-3' 5'-CACCGGCTTCACCAACGACGGCTCATT-3' 5'-CACTGATCGCTTGAACATCG-3' 5'-AGTCCGTGTCGTCGCGCTTCT-3' 5'-CCCACATGGCCGCCTGCGATG-3' 5'-GCTCGTACAGCCCGCCCCACA-3' 5'-AAGAATGAGCCGTCGTTGG-3' 5'-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3' 5'-GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3' 5'-TTTCCTCTGCGCCGTGGGATA-3' 5'-CCGTGGTTTTCGCATCGACCG-3' 5'-CTCGCACTCGCCTTTCCAGGT-3' 5'-CCGAGGAAGGCAGGCGTGTGA-3' 5'-ATCACCCACAACGAATCTTCTTCTTCCATCGC-3' 5'-GCGCGGAACAGCTACTGGGAT-3' 5'-GGGATGGCGTCAAAGGCGAGA-3' 5'-GCTTGACTGCACTTCCTTTCT-3' 5'-GCCACCATTGACCAGAGA-3' 5'-TCATCAAGCTCCTTCAAGACT-3' 5'-GTGGCTTGAAGGCGATGA-3' 5'-GAGGGCATTAAGAAGTTCGAC-3' 5'-AANGCNGGRTARTTNARRTC-3' 5'-ACNGTNGTCATCCANGGC-3' 5'-GAYTCNGGNGARATHATHAA-3' 5'-CCAGCATCCCTACCACATCT-3' 5'-GAGTACTTGGCGTCCACGAT-3' 5'-TCNGGCCANACNCCNCTRTC-3' 5'-GAYACNGGNGTNTGGCCNGA-3' 5'-GTRTGNGTNCCRTGNCC-3' 5'-GGNCAYGGNACNCAYAC-3'
Lista dos primers utilizados neste trabalho
trg14+ trg2+ trg3trg3+ trg4+ trginner trgprottrgprot+ trgprot100+ trgprot1800+
5'-GCCNTGGATGACNACNGT-3' 5'-GTCCCAGATCGCCGTCTTCAC-3' 5'-CACGAACGGCGTGGACTCTGT-3' 5'-ACAGAGTCCACGCGGTTCGTG-3' 5'-CATGGGACTCACACAGCTTCA-3' 5'-TCGAGCGCGCTGTTGGGGTCCACGTGC-3' 5'-CTACCAGCATCCCTACCACATCTCT-3' 5'-CACCCCGACCGACCTCGACATC-3' 5'-CACCTTCGCGGCCGTCTTCTCG-3' 5'-CACCACGCTGGAGTCCAAGTCGC-3'
191
192
ANEXO II: Sequncia do cDNA dos polipptidos recombinantes

Sequncia do polipptido T1800 utilizado para produzir anticorpos policlonais em rato: fragmento da subtilisina de trigo, SBT_Triticum, e extremidade N-terminal caracterstica do vector (aminocidos a sublinhado): MHHHHHHGKPIPNPLLGLDSTENLYFQGIDPFTTLESKSPLDTEGHGTHTAS TAAGSPVDGAGFYDYARGRAVGMAPGARIAAYKICWKAGCLDSDILAAFDEAVG DGVNVISLSVGSTYAADFYEDSIAIGAFGAVKKGIVVSASAGNSGPGEYTASNIAP WILTVGASTVDREFPADAVLGDGSVYGGVSLYAGDPLNSTKLPLVYAADCGSRL CLIGELDKDKVAGKMVLCERGVNARVEKGAAVGKAGGIGMILANTEESGEELIAD PHLIPSTMVGQKFGDKIRHYVKTDPSPTATIVFHGTVIGKSPSAPRVASFSSRGPN SRAAEILKPDVTAPGVNILAAWTGEASPTDLDIDPRRVPFNIISGTSMSCPHVSGL AALLRQAHPEWSPAAVKSALMTTAYNLDNSGEIIKDLATGTESTPFVRGAGHVDP NSALDPGLVYDADTADYIGFLCALXYTPSQIAVFTRDGSVADCLKKXARSGDLNY PAFAAVFSSYKDSVTYHRVVRNVGSDASAVYEAKVESPAGVDAKVTPAKLVFDE EHRSLAYEITLAVSGNPVIVDAKYSFGSVTWSDGKHNVTSPIAVTWPESAGAASM
Sequncia do polipptido AT, utilizado para produzir anticorpos policlonais em rato: fragmento da subtilisina de A. thaliana, SBT_AT, e extremidade N-terminal caracterstica do vector (aminocidos a sublinhado): MHHHHHHGKPIPNPLLGLDSTENLYFQGIDPFTILKPDVIAPGVNILAGWTGM VGPTDLDIDPRRVQFNIISGTSMSCPHVSGLAALLRKAHPDWSPAAIKSALVTTAY DVENSGEPIEDLATGKSSNSFIHGAGHVDPNKALNPGLVYDIEVKEYVAFLCAVG YEFPGILVFLQDPTLYDACETSKLRTAGDLNYPSFSVVFASTGEVVKYKRVVKNV GSNVDAVYEVGVKSPANVEIDVSPSKLAFSKEKSVLEYEVTFKSVVLGGGVGSV PGHEFGSIEWTDGEHVVKSP
193
194
ANEXO III: Correlao de Pearson entre os transcritos de RbcS e de cada uma das proteases analisadas de A. thaliana
Na tabela seguinte apresenta-se o coeficiente de correlao de Pearson entre a probe set: 264474_s_at (RbcS) e a probe set associada a cada locus anotado na pgina do TAIR como protease ou metalloendoprotease (TAIR, 2007a; 2007b). Este coeficiente foi calculado, um a um, no servidor do Genevestigator (Zimmermann et al., 2004). Na primeira coluna encontra-se o locus que se pretende estudar, seguido da probe set utilizada quando um locus est associado a mais do que uma probe set. No chip da Affymetrix existem algumas probe set que representam mais do que um locus e denominam-se _s_at, como o caso da probe set 264474_s_at que corresponde aos 4 loci codificantes da SSU. Outras probe set tem oligonucletidos que no so nicos a essa probe set e representam, por isso, mais do que um locus, designando-se por _x_at. Na segunda coluna apresenta-se o coeficiente de correlao de Pearson (r2), em que as variveis foram transformadas para o logartmo de base 2; n. f.- not found: loci que no tm uma probe set associada. Tabela II- Coeficiente de correlao de Pearson
Locus AT1G01300 AT1G01650 AT1G01900 AT1G02170 AT1G02300 AT1G02305 AT1G02560 AT1G02990 AT1G03103 AT1G03580 AT1G04110 AT1G04860 AT1G05140 AT1G05450 AT1G05820 r
2
AT1G05840 AT1G06200 AT1G06260 AT1G06430 AT1G06900 246855_at AT1G07190 AT1G07200 AT1G07510 AT1G07747 AT1G08210 AT1G08740 261452_s_at AT1G08740 262019_s_at AT1G09130
0,023 0,001 0,028 0,461 0,244 0,039 n. f. 0,113 n. f. 0,035 0,025 0,063 0,310
AT1G09730 AT1G09750 AT1G10570 AT1G11750 AT1G11910 AT1G12100 AT1G12410 AT1G14270 AT1G16860 AT1G17110 AT1G17860 AT1G17870 AT1G18280 AT1G18600 AT1G18660 AT1G19740
0,078 0,367 0,024 0,267 0,101 0,025 0,341 0,491 0,000 0,015 0,124 0,008 0,111 0,002 0,184 0,455
AT1G20150 AT1G20160 AT1G21020 AT1G21030 AT1G21470 AT1G21580 AT1G21920 AT1G22670 AT1G24140 AT1G25510 AT1G25886 AT1G27210 AT1G27780 262403_s_at AT1G27950
0,002 0,103 0,025 0,063 n. f. 0,001 0,007 0,058 0,102 0,138 0,001 0,005 0,000 0,058
0,008 0,054 0,134 0,001 0,212 0,001 0,364 n. f. n. f. n. f. 0,170 0,001 0,465 0,024 n. f.
195
AT1G28120 AT1G29080 AT1G29090 AT1G29110 AT1G30600 AT1G30900 AT1G31150 AT1G31450 AT1G32280 AT1G32840 263254_x_at AT1G32840 257777_x_at AT1G32840 246640_x_at AT1G32840 252636_x_at AT1G32840 252635_x_at AT1G32840 252634_x_at AT1G32850 AT1G32940 262403_s_at AT1G32950 AT1G32960 AT1G32970 261215_at AT1G32980 AT1G33050 AT1G33360 AT1G34610 AT1G34740 246643_s_at AT1G35110 AT1G35340 AT1G35612 AT1G35625 AT1G35630 AT1G35650
0,029 0,009 0,014 0,003 0,169 0,015 0,014 0,038 n. f. 0,002 0,006 0,012
AT1G35770 261283_s_at AT1G35770 246712_at AT1G36150 AT1G36970 256478_at AT1G36970 AT1G37020 AT1G42460 AT1G42515 AT1G43300 AT1G43665 AT1G43667 AT1G43777 AT1G44880 AT1G45090 260965_s_at AT1G45090 257394_at AT1G47128 AT1G47710 AT1G48750 AT1G49050 AT1G49630 AT1G49970 AT1G50250 AT1G50670 AT1G50690 AT1G50890 AT1G51150 AT1G51330 AT1G51710 AT1G51980 AT1G52020 AT1G52087 AT1G53780 AT1G54700 AT1G55260 AT1G59850
0,009 0,028 0,000 0,001 0,112 0,002 0,002 n. f. n. f. n. f. n. f. n. f. 0,024 0,006 0,062 0,136 0,063 0,278 0,037 0,001 0,358 0,493 0,160 n. f. 0,091 n. f. n. f. 0,450 0,291 n. f. n. f. n. f. 0,038 0,222 0,018
AT1G59970 AT1G60220 AT1G61070 AT1G62160 AT1G62170 264732_at AT1G62170 264733_at AT1G62290 AT1G62340 AT1G62500 AT1G62510 AT1G62790 AT1G63280 AT1G63690 AT1G63870 AT1G64010 AT1G64020 AT1G64030 AT1G64235 AT1G64830 AT1G65050 AT1G65240 AT1G65630 AT1G65640 AT1G66180 AT1G66210 AT1G66220 AT1G66670 AT1G66850 AT1G67700 AT1G68660 AT1G69100 AT1G70170 AT1G70250 264694_at AT1G70250 264695_at AT1G71150 AT1G71980
0,012 0,088 0,000 n. f. 0,002 0,006 0,055 0,016 0,005 0,164 0,245 0,018 0,016 0,085 0,042 0,025 0,003 n. f. 0,020 n. f. 0,050 0,066 0,012 0,188 0,112 0,107 0,162 0,019 0,439 0,455 0,095 0,098 0,001 0,045 n. f. 0,068
AT1G72290 AT1G73170 AT1G73260 AT1G73325 AT1G73330 AT1G73550 AT1G73560 AT1G73780 AT1G73890 AT1G73990 AT1G74130 AT1G74140 AT1G75460 AT1G76740 AT1G76965 AT1G77480 AT1G77660 AT1G78880 AT1G79330 AT1G79560 AT1G79720 AT2G02100 AT2G02120 AT2G02130 AT2G02140 AT2G02210 AT2G03120 AT2G03140 261291_at AT2G03200 AT2G04160 AT2G04980 AT2G05400 AT2G05410 AT2G05450 AT2G05460 AT2G05560 AT2G05562 AT2G05920
0,039 0,145 0,157 n. f. 0,065 n. f. 0,022 0,116 n. f. 0,074 n. f. 0,057 0,470 0,003 n. f. 0,051 0,089 n. f. 0,043 0,028 0,315 0,185 0,167 0,243 0,008 n. f. 0,012 0,111 0,132 0,022 n. f. 0,004 n. f. n. f. n. f. n. f. 0,000 0,001
0,012
0,014 0,025 0,001 0,000 0,012 0,064 0,009 0,003 0,045 0,203 0,048 0,001 n. f. 0,391 n. f. 0,005 0,005 0,063
196
Correlao de Pearson entre os transcritos de RbcS e de cada uma das proteases analisadas de A. thaliana AT2G06430 AT2G06860 AT2G07170 AT2G07240 AT2G07280 AT2G07290 AT2G07510n AT2G10350 252783_at AT2G10350 262267_at AT2G10350 263310_s_at AT2G10940 AT2G11345 AT2G12100 257394_ar AT2G13295 AT2G13820 AT2G14010 AT2G14130 263359_x_at AT2G14540 AT2G14600 AT2G14740 AT2G14770 AT2G14846 AT2G15140 AT2G15190 AT2G15325 AT2G16180 AT2G16592 AT2G16594 AT2G16630 AT2G17760 AT2G18370 AT2G19170 AT2G19260 AT2G20140 253755_at n. f. n. f. 0,101 0,109 0,001 0,001 n. f. 0,002 0,004 0,213 0,459 n. f. 0,062 n. f. 0,005 0,031 0,031 0,055 n. f. 0,032 0,001 n. f. n. f. n. f. 0,033 n. f. n. f. n. f. 0,068 0,008 0,234 0,016 n. f. 0,019 AT2G20725 AT2G21430 AT2G22310 AT2G23945 AT2G24640 AT2G24930 255099_at AT2G25240 AT2G25740 AT2G26140 AT2G26390 AT2G27130 AT2G27350 AT2G27395 AT2G28010 AT2G28030 266159_at AT2G28030 264067_x_at AT2G28040 AT2G28220 AT2G29080 AT2G29240 AT2G29970 AT2G30290 AT2G30950 267196_at AT2G31140 AT2G31980 AT2G32480 AT2G32780 AT2G32870 AT2G32880 AT2G34940 AT2G35170 AT2G35570 AT2G35580 266631_at AT2G35580 266632_at 0,419 0,000 0,043 0,022 0,104 0,007 0,100 0,167 0,076 0,114 0,013 0,105 0,073 0,042 0,022 0,042 n. f. n. f. 0,000 0,063 0,256 0,050 0,520 n. f. 0,004 0,377 0,021 n. f. 0,469 0,009 0,143 n. f. 0,000 0,011 AT2G35580 266629_at AT2G35580 266630_at AT2G35590 AT2G35615 AT2G36305 AT2G36670 AT2G37870 AT2G38025 AT2G38860 AT2G38870 AT2G38900 AT2G39320 AT2G39850 AT2G40130 AT2G40930 AT2G41790 AT2G42980 AT2G43070 AT2G44290 AT2G44300 AT2G45040 AT2G45180 AT2G45270 AT2G47940 AT2G48130 AT2G48140 AT3G02070 AT3G02450 AT3G02740 AT3G03380 259048_at AT3G03380 259047_at AT3G04320 AT3G04330 AT3G05750 AT3G05780 AT3G05790 AT3G06910 AT3G07450 0,050 n. f. n. f. n. f. 0,321 0,003 n. f. 0,115 0,232 0,000 0,000 0,485 0,106 0,108 0,000 0,016 0,054 n. f. 0,049 0,001 0,558 0,180 0,236 0,200 0,225 0,006 0,292 0,128 0,119 0,314 0,167 n. f. 0,006 0,000 0,009 AT3G09170 AT3G10300 AT3G11825 AT3G11910 AT3G12490 256235_at AT3G12545 AT3G12700 AT3G14067 AT3G14240 AT3G14400 AT3G16290 AT3G16480 AT3G16540 AT3G16550 AT3G18280 AT3G18490 AT3G18845 AT3G19170 AT3G19390 AT3G19400 AT3G19720 257044_at AT3G19720 257045_at AT3G20015 AT3G20630 AT3G21280 AT3G22142 AT3G22260 AT3G22570 AT3G22580 AT3G22600 AT3G22620 256929_at AT3G22620 256937_at AT3G23645 0,037 0,110 0,048 0,016 n. f. 0,288 0,065 n. f. 0,273 0,363 0,025 0,010 0,158 0,082 0,004 0,028 0,000 0,621 n. f. 0,151 0,310 0,004 0,064 0,080 0,010 0,314 0,091 n. f. 0,029 0,148 n. f. 0,145 0,061 0,200 n. f.
0,014
197
AT3G24390 AT3G25700 AT3G26085 AT3G26260 AT3G26530 261452_s_at AT3G26530 262019_s_at AT3G26805 AT3G27925 AT3G29152 AT3G29210 AT3G30440 263302_at AT3G30440 257777_x_at AT3G30640 AT3G30645 AT3G31910 AT3G32393 AT3G32896 AT3G32900 256538_x_at AT3G32900 265980_at AT3G32900 257777_x_at AT3G32960 AT3G42530 252782_at AT3G42530 252814_at AT3G42550 AT3G42580 AT3G42690 AT3G42700 AT3G42730 246643_s_at AT3G42730 252760_x_at
0,001 n. f. 0,276 n. f. 0,025 0,063 n. f. 0,338 n. f. 0,006 0,001 0,006 0,006 n. f. 0,000 n. f. 0,010 0,000 0,003 0,006 0,016 0,024 0,100 0,007 0,126 0,020 0,104 0,001 0,063
AT3G42730 262403_s_at AT3G42820 AT3G42910 AT3G42920 AT3G43390 252749_at AT3G43390 255986_at AT3G43460 255208_at AT3G43460 264414_s_at AT3G43720 AT3G43960 AT3G44500 255362_x_at AT3G44500 257777_x_at AT3G44500 246640_x_at AT3G44500 252635_x_at AT3G44500 252634_x_at AT3G45220 AT3G45310 AT3G45450 AT3G46840 252499_s_at AT3G46850 252499_s_at AT3G46860 AT3G47060 AT3G47260 263302_at AT3G47260 263279_x_at AT3G47260 257777_x_at AT3G47260 266112_x_at
0,000 0,083 0,050 0,013 0,001 0,016 0,002 0,042 0,126 0,011 0,001 0,006 0,012 0,014 0,025 0,020 0,002 0,034 0,016 0,016 0,001 0,059 0,001 0,003 0,006 0,006
AT3G47260 252465_x_at AT3G47260 263358_x_at AT3G48480 AT3G48870 AT3G49340 AT3G49600 AT3G50020 AT3G50050 AT3G51330 AT3G51340 AT3G51350 AT3G51360 AT3G52130 AT3G52500 AT3G53980 AT3G54400 AT3G54940 AT3G57310 AT3G57470 AT3G57680 AT3G57810 AT3G58230 AT3G58290 AT3G58300 AT3G58320 AT3G58330 AT3G58550 AT3G59080 AT3G59080 AT3G59455 AT3G61820 AT3G61980 AT3G62940 AT3G63095 AT4G00165 AT4G00230 AT4G00690
0,012 0,031 0,098 n. f. 0,093 0,023 n. f. 0,029 0,033 n. f. 0,160 0,017 0,048 0,281 0,065 0,000 0,015 n. f. 0,011 0,171 0,004 0,036 0,032 0,002 n. f. 0,003 0,186 0,018 0,018 n. f. 0,106 0,039 0,241 n. f. n. f. 0,026 0,278
AT4G00780 AT4G01270 AT4G01320 AT4G01390 249244_at AT4G01575 AT4G01610 AT4G03300 AT4G03913 AT4G03970 AT4G04010 255363_x_at AT4G04010 263254_x_at AT4G04010 257777_x_at AT4G04010 246640_x_at AT4G04010 261235_x_at AT4G04010 257110_x_at AT4G04010 252634_x_at AT4G04130 246691_at AT4G04130 255373_s_at AT4G04130 246664_at AT4G04390 AT4G04400 AT4G04530 AT4G04545 AT4G04820 AT4G04985 AT4G05280 246643_s_at AT4G05280 255273_at AT4G05581
0,530 0,060 0,265 0,011 0,018 0,185 0,001 n. f. 0,213 0,001 0,002 0,006 0,012 0,014 0,024 0,025 0,050 0,109 0,250 0,024 0,002 0,046 0,090 0,019 n. f. 0,001 0,036 n. f.
198
Correlao de Pearson entre os transcritos de RbcS e de cada uma das proteases analisadas de A. thaliana AT4G06500 AT4G06638 AT4G07452 AT4G07580 AT4G07670 AT4G07680 AT4G08340 AT4G08430 248949_at AT4G08430 255144_at AT4G08430 245922_at AT4G08430 255143_at AT4G08530 AT4G08670 AT4G08880 262403_s_at AT4G08880 252749_at AT4G08880 255986_x_at AT4G08880 255119_at AT4G08880 265055_at AT4G08880 246643_s_at AT4G09280 AT4G09290 AT4G09560 AT4G09780 AT4G10510 AT4G10520 AT4G10530 AT4G10540 254978_at AT4G10540 254976_at AT4G10550 n. f. n. f. 0,014 n. f. 0,074 n. f. 0,021 0,000 0,002 0,003 0,033 0,152 0,083 0,000 0,001 0,016 0,041 0,043 0,001 0,037 0,059 0,088 n. f. 0,061 0,005 0,005 0,056 0,061 0,203 AT4G10570 254984_s_at AT4G10590 254984_s_at AT4G11320 AT4G12360 AT4G12470 AT4G12490 AT4G12500 AT4G12510 AT4G12520 AT4G12530 AT4G12545 AT4G12825 AT4G12920 AT4G14110 AT4G14805 AT4G14815 AT4G15040 AT4G15160 AT4G15715 AT4G15880 AT4G16500 AT4G16563 AT4G16640 AT4G17040 AT4G17080 AT4G17100 AT4G17740 AT4G17895 AT4G18370 AT4G19310 AT4G19320 AT4G20110 AT4G20310 AT4G20430 AT4G20850 AT4G21323 AT4G21326 AT4G21630 AT4G21640 25395_at AT4G21640 254377_at AT4G21650 25395_at AT4G21650 AT4G22050 AT4G22420 AT4G22460 AT4G22470 AT4G22485 AT4G22490 AT4G22505 AT4G22513 AT4G22517 AT4G22520 AT4G22610 AT4G22630 AT4G22666 AT4G22720 AT4G23520 AT4G23940 AT4G24090 AT4G24560 AT4G26330 AT4G30020 AT4G30030 AT4G30040 AT4G30350 AT4G30610 AT4G30880 AT4G30890 AT4G31110 AT4G31670 AT4G33410 AT4G33550 AT4G33620 AT4G34360 0,078 0,027 0,385 0,027 0,385 0,004 0,000 0,047 0,009 n. f. 0,184 n. f. n. f. n. f. n. f. 0,097 n. f. n. f. 0,225 0,002 0,046 0,531 0,028 0,012 0,007 0,008 0,017 0,069 0,029 n. f. 0,125 n. f. 0,018 0,069 0,015 0,004 0,181 AT4G34980 AT4G35880 AT4G36880 AT4G38225 AT4G39370 AT4G39910 AT5G01440 AT5G02190 AT5G03330 AT5G03620 AT5G04170 AT5G04250 AT5G05040 AT5G05060 AT5G05110 AT5G05740 AT5G05960 AT5G06600 AT5G07030 AT5G07230 AT5G08630 AT5G09370 AT5G10080 AT5G10540 AT5G10760 AT5G10770 AT5G10790 AT5G11940 AT5G13900 AT5G15250 AT5G18350 AT5G18370 AT5G19660 AT5G19740 AT5G20750 AT5G22030 AT5G22035 AT5G22760 AT5G22850 0,173 0,005 0,062 0,280 0,005 0,134 0,007 0,037 n. f. 0,028 0,012 0,014 n. f. 0,175 0,000 0,349 0,021 0,000 0,019 0,001 0,082 0,021 n. f. 0,314 0,317 0,008 0,000 0,022 0,155 0,009 0,001 0,059 0,110 n. f. n. f. 0,152 n. f. 0,009 0,089
0,326 0,326 n. f. 0,050 0,003 0,043 0,011 0,062 0,063 0,004 n. f. n. f. 0,026 0,357 n. f. 0,028 0,066 0,341 n. f. 0,026 0,204 0,094 0,000 0,203 0,000 n. f. 0,213 0,114 0,368 0,002 0,001 0,044 0,040 0,001 0,141 0,267 0,043
199
AT5G23140 AT5G24820 AT5G26015 AT5G26280 246825_at AT5G26280 2446855_at AT5G26860 AT5G26910 AT5G27660 AT5G28170 AT5G28235 248949_at AT5G28235 245922_at AT5G28240 AT5G28250 AT5G28270 AT5G28480 AT5G28600 AT5G28810 AT5G28930 AT5G28970 AT5G33220 AT5G33340 246685_at AT5G33340 246684_at AT5G34900 255363_x_at AT5G34900 257777_x_at AT5G34900 263254_x_at AT5G34900 246640_x_at AT5G34900 261235_x_at AT5G34900 257110_x_at
0,092 0,073 n. f. 0,234 0,244 0,248 0,002 0,409 0,003 0,000 0,003 0,001 n. f. 0,047 0,007 0,065 0,003 0,001 0,002 n. f. 0,038 0,126 0,001 0,001 0,002 0,012 0,014 0,024
AT5G34900 252634_x_at AT5G34970 AT5G34990 AT5G35025 AT5G35210 246654_s_at AT5G35220 246654_s_at AT5G35660 AT5G36020 AT5G36030 AT5G36040 AT5G36260 AT5G36850 AT5G36860 AT5G36950 AT5G37540 AT5G38160 AT5G38170 AT5G38180 AT5G38195 AT5G39830 AT5G40200 AT5G40560 AT5G42270 249245_at AT5G42270 249244_at AT5G42390 AT5G42620 AT5G43060 AT5G43100 AT5G43570 AT5G44265 AT5G44530 AT5G44890 261452_s_at AT5G44890 262019_s_at
0,025 0,001 n. f. n. f. 0,266 0,266 n. f. 0,001 n. f. n. f. 0,036 0,000 0,001 0,051 0,034 0,001 0,057 0,019 0,000 0,289 0,418 0,014 0,248 0,462 0,223 0,010 0,293 0,011 n. f. n. f. 0,271 0,025 0,063
AT5G45120 AT5G45230 AT5G45390 AT5G45570 248949_at AT5G45570 255144_at AT5G45640 248960_at AT5G45650 248960_at AT5G45890 AT5G46390 248899_at AT5G46740 AT5G46890 AT5G46900 AT5G47040 AT5G47550 AT5G48490 AT5G49840 AT5G50340 AT5G50920 AT5G51070 AT5G51540 AT5G51740 AT5G51750 AT5G52160 AT5G53170 AT5G53350 AT5G53540 AT5G54740 AT5G54745 AT5G55410 AT5G55420 AT5G55450 AT5G55460 AT5G56480 AT5G56730 AT5G56910
0,020 0,040 0,156 0,000 0,002 0,041 0,437 0,018 0,396 0,024 n. f. 0,059 0,180 0,033 0,184 0,014 0,001 0,372 0,085 0,265 0,230 0,056 0,003 0,183 0,005 0,168 0,067 n. f. n. f. 0,023 0,299 n. f. 0,006 0,143 0,023
AT5G56920 AT5G56990 AT5G57990 AT5G58810 AT5G58820 AT5G58830 AT5G58840 247799_at AT5G58840 247784_at AT5G58870 AT5G59090 AT5G59100 AT5G59120 AT5G59130 AT5G59190 AT5G59330 AT5G59810 AT5G60190 AT5G60360 AT5G60750 AT5G62065 AT5G62080 AT5G62580 AT5G63660 AT5G64080 AT5G64240 AT5G65450 AT5G65620 AT5G67090 AT5G67170 AT5G67360 ATCG00670
0,066 n. f. 0,147 n. f. 0,014 0,233 0,039 0,091 0,226 0,131 0,053 0,024 0,466 0,073 0,008 0,102 0,185 0,060 0,156 n. f. 0,09 0,185 0,215 0,042 0,259 0,036 0,104 0,012 n. f. 0,057 0,491
200
ANEXO IV: Intensidade de transcrio dos loci seleccionados de A. thaliana

Na tabela seguinte pode consultar-se a intensidade de transcrio nas folhas de A. thaliana, para os loci seleccionados. Estes transcritos esto presentes, preferencialmente, nos tecidos fotossintticos e, no caso das proteases, tm maior expresso nas folhas senescentes. Tabela III- Intensidade de transcrio em folhas de A. thaliana
Rosette leaf 2 Subtilisin-like serine protease- AT3G14067 FtsH7- AT3G47060 Cysteine proteinase RD21A identicalAT1G47128 Chloroplast nucleoid DNA-binding like protein- AT5G10760 Putative chloroplast nucleoid DNA-bindingAT3G18490 Putative ATPaseAT1G73170 ClpR1- AT1G49970 Meprin and TRAF domain-containing protein- AT4G00780 ClpR3- AT1G09130 FtsH9- AT5G58870 ClpP5- AT1G02560 ClpC1- AT5G50920 RbcL ATCG00490 RbcS AT1G67090 Protease inhibitor/seed storage/lipid transfer protein familyAT2G45180
Rosette Rosette Rosette Rosette Rosette Median leaf 4 leaf 6 leaf 8 leaf 10 leaf 12 (rosette leaf) (x2) 316,4 58,9 261,6 58,4 220,6 43,7 885,1 227,3 51,1 726,6 217,3 51,0 683,3 244,4 53,4 829,7
Senescing Control a leaf (x1) signal 1145,0 205,2 3024,5 222,4 67,3 965,7
Log2
(x1/x2)
380,7 55,8
2,2 1,9 1,6
1538,9 1195,3 1046,3
573,3
877,4
787,4
415,9
277,4
108,4
494,6
1168,1
21,7
1,2
906,7 223,5 742,2
796,2 199,9 699,2
640,9 179,2 584,8 994,6
581,1 178,9 686,6 795,2
591,1 180,9 568,6 529,0
561,5 180,6 562,2 316,9
616,0 180,7 635,7 894,9 577,3 376,3 1341,6 1611,5 890,3 5844,4 3634,1
1391,2 313,3 1116,8 1459,6 941,2 585,4 1846,2 2026,6 585,5 2544,1 370,9
1015,7 159,0 470,1 201,3 427,3 317,4 753,7 1050,5 442,8 3748,7 749,4
1,2 0,8 0,8 0,7 0,7 0,6 0,5 0,3 -0,6 -1,2 -3,3
1489,9 1172,6
690,3 586,1 590,9 547,7 568,6 553,9 542,2 473,5 420,6 329,8 332,1 301,4 1286,9 1273,4 1212,3 1396,4 1402,5 1444,1 2125,6 1801,8 1541,0 1612,4 1610,5 1428,7 732,0 867,4 872,0 1058,3 1028,8 908,6 4734,9 5146,3 5983,1 5829,7 6304,2 5859,2 3615,4 3652,8 3709,7 3841,9 3509,9 3374,0
Putative protease inhibitor/seed 519,6 1367,0 1681,0 2520,1 2664,6 2547,0 2100,6 7,6 1059,8 -8,1 storage/lipid transfer protein- AT2G10940 Valores retirados do servidor The Bio-Array Resource Arabidopsis Functional Genomics-BAR (Winter et al., 2007) para cada um dos loci. a- control signal representa a moda do sinal de todas experincias pertencentes ao Development map do servidor BAR.
201
202
ANEXO V: Determinaes efectuadas nas amostras de folhas de trigo com crescimento em meio completo ou em meio sem azoto
Tabela IV- Comprimento, peso fresco e protena total solvel das amostras de folhas de trigo com crescimento em meio completo ou em meio sem azoto.
N da amostra Designao da amostra* Um quinto do Peso fresco da Concentrao da Protena total comprimento amostra protena total solvel no solvel (mg) por total da folha recolhida tampo de extraco** grama de peso -1 (cm) (g) fresco (mg.g p.f.) (g/L) 2,97 0,0902 0,632 7,58 3,05 0,0791 0,666 7,99 3,05 0,0875 0,755 9,06 2,97 0,0928 0,848 10,18 3,05 0,0824 0,804 9,65 3,05 0,0887 0,640 7,68 2,97 0,0358 0,531 6,38 3,05 0,0350 0,652 7,82 3,05 0,0361 0,421 5,05 3,32 0,0939 0,503 6,04 2,95 0,0867 0,427 5,12 3,12 0,0850 0,801 9,61 3,32 0,0864 0,726 8,71 2,95 0,0825 0,547 6,56 3,12 0,0831 0,562 6,74 3,32 0,0396 0,495 5,94 2,95 0,0312 0,511 6,13 3,12 0,0332 0,374 4,48 3,07 0,0872 0,481 5,77 3,10 0,0890 0,799 9,59 3,15 0,0898 0,682 8,18 3,07 0,0808 0,876 10,52 3,10 0,0907 0,853 10,24 3,15 0,0854 1,239 14,87 3,07 0,0309 0,813 9,76 3,10 0,0358 0,832 9,99 3,15 0,0349 0,958 11,50 3,25 0,0950 1,018 12,22 3,15 0,0896 1,008 12,10 3,28 0,0848 0,764 9,17 3,25 0,0892 0,787 9,44 3,15 0,0835 0,944 11,33 3,28 0,0784 0,923 11,08 3,25 0,0350 0,528 6,34 3,15 0,0331 0,479 5,75 3,28 0,0318 0,545 6,55 3,15 0,1222 0,515 6,18 3,32 0,1145 0,473 5,68 3,05 0,0889 0,358 4,30
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
0_CS_2_b 0_CS_2_b 0_CS_2_b 0_CS_2_m 0_CS_2_m 0_CS_2_m 0_CS_2_t 0_CS_2_t 0_CS_2_t 5_C_2_b 5_C_2_b 5_C_2_b 5_C_2_m 5_C_2_m 5_C_2_m 5_C_2_t 5_C_2_t 5_C_2_t 5_S_2_b 5_S_2_b 5_S_2_b 5_S_2_m 5_S_2_m 5_S_2_m 5_S_2_t 5_S_2_t 5_S_2_t 10_C_2_b 10_C_2_b 10_C_2_b 10_C_2_m 10_C_2_m 10_C_2_m 10_C_2_t 10_C_2_t 10_C_2_t 10_S_2_b 10_S_2_b 10_S_2_b
203
Caracterizao da subtilisina relacionada com a degradao da ribulose bisfosfato carboxilase de plantas N da amostra Um quinto do Peso fresco da Concentrao da Protena total comprimento amostra protena total solvel no solvel (mg) por total da folha** recolhida tampo de extraco*** grama de peso -1 (g) (cm) fresco (mg.g p.f.) (g/L) 40 10_S_2_m 3,15 0,1007 0,446 5,35 41 10_S_2_m 3,32 0,1122 0,491 5,89 42 10_S_2_m 3,22 0,0918 0,497 5,96 43 10_S_2_t 3,15 0,0417 0,195 2,34 44 10_S_2_t 3,32 0,0450 0,189 2,27 45 10_S_2_t 3,22 0,0415 0,278 3,34 46 15_C_2_b 3,17 0,0853 0,420 5,04 47 15_C_2_b 3,37 0,0932 0,354 4,25 48 15_C_2_b 3,30 0,1024 0,484 5,81 49 15_C_2_m 3,17 0,0868 0,511 6,13 50 15_C_2_m 3,37 0,0915 0,342 4,10 51 15_C_2_m 3,30 0,0955 0,466 5,59 52 15_S_2_b 2,90 0,0970 0,101 1,21 53 15_S_2_b 3,36 0,1233 0,214 2,57 54 15_S_2_b 3,36 0,1240 0,275 3,30 55 15_C_3_b 4,00 0,1443 0,618 7,42 56 15_C_3_b 4,00 0,1362 0,868 10,41 57 15_C_3_b 3,97 0,1339 0,947 11,37 58 15_C_3_m 4,00 0,1396 0,624 7,49 59 15_C_3_m 4,00 0,1268 0,849 10,19 60 15_C_3_m 3,97 0,1276 0,786 9,43 61 15_C_3_t 4,00 0,0394 0,672 8,06 62 15_C_3_t 4,00 0,0316 0,539 6,46 63 15_C_3_t 3,97 0,0518 0,452 5,43 64 15_S_3_b 3,57 0,1447 0,339 4,07 65 15_S_3_b 3,62 0,1343 0,407 4,89 66 15_S_3_b 3,50 0,1180 0,155 1,86 67 15_S_3_m 3,57 0,1301 0,486 5,83 68 15_S_3_m 3,62 0,1005 0,329 3,95 69 15_S_3_m 3,50 0,1063 0,481 5,77 70 15_S_3_t 3,57 0,0270 0,117 1,40 71 15_S_3_t 3,62 0,0402 0,119 1,43 72 15_S_3_t 3,50 0,0414 0,115 1,38 73 15_C_4_i 18,50 0,2969 0,786 9,43 74 15_C_4_i 18,55 0,2779 0,764 9,17 75 15_C_4_i 18,55 0,2292 0,656 7,87 76 15_S_4_i 15,70 0,2258 0,445 5,34 77 15_S_4_i 16,75 0,2459 0,549 6,59 78 15_S_4_i 16,10 0,2420 0,543 6,52 * Designao da amostra (tal como definida na Tabela 4): Tempo_Tratamento_N da folha_ Parte da folha; Tempo: 0, 5, 10 e 15 dias; Tratamento: C- crescimento em meio completo, Screscimento em meio sem azoto, CS- amostra do tempo zero que corresponde ao incio da experincia, aps um perodo de crescimento em meio completo, durante 12 dias; N da folha: 2, 3 e 4- folha nmero dois, trs e quatro, respectivamente; Parte da folha: b- basal, m-mdia, tterminal, i-inteira. ** mdia do comprimento das folhas utilizadas. *** Valor mdio de trs repeties para cada uma das amostras. Designao da amostra*
204

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Universidade Tcnica de Lisboa

Instituto Superior de Agronomia

CARACTERIZAO DA SUBTILISINA RELACIONADA COM A DEGRADAO DA RIBULOSE BISFOSFATO CARBOXILASE DE PLANTAS

INTRODUO............................................................................................................ 1 DEGRADAO DA RUBISCO ........................................................................................ 2

1.2 1.3 2 2.1 2.2

DOSEAMENTO DE PROTENAS ....................................................................................25

EXTRACO DE CIDOS NUCLEICOS .......................................................................... 31

AMPLIFICAO DE CIDOS NUCLEICOS POR PCR....................................................... 34

CLONAGEM DOS PRODUTOS DE PCR EM E. COLI ....................................................... 35

VITRO, DEGRADA PREFERENCIALMENTE A FORMA OXIDADA DA RUBISCO ...... 39 3.1 3.2

INTRODUO ........................................................................................................... 39 MATERIAL E MTODOS ............................................................................................. 43

RESULTADOS E DISCUSSO ......................................................................................59

SBT_AT.............................................................................................................................................77 3.3.4 CARACTERIZAO BIOQUMICA DA SBT_TRITICUM...................................................................83

RELACIONAMENTO DA DEGRADAO DA RUBISCO COM A SUBTILISINA,

SBT_TRITICUM E SBT_AT ............................................................................................95 4.1 4.2

INTRODUO ............................................................................................................95 MATERIAL E MTODOS ..............................................................................................99

AVALIAO DO TEOR DE RUBISCO E DE SBT_TRITICUM EM FOLHAS DE TRIGO COM CRESCIMENTO

EM MEIO COMPLETO OU SUJEITO A AUSNCIA DE AZOTO ......................................................................104

4.2.3 4.2.4 4.2.5 4.2.6

RESULTADOS E DISCUSSO ....................................................................................113

PROTEASE E DOS GENES RBCL E RBCS..........................................................................................113 4.3.2 4.3.3

AT3G14067 CODIFICANTE PARA A SUBTILISINA ..................................................................................147

Fig. 5.1 Modelo proposto para a degradao da rubisco ............................................... 162

A tod@s muito obrigada, Joana

PALAVRAS-CHAVE: degradao, rubisco, senescncia, stresse, subtilisina.

TTULO DA TESE: Characterization of the subtilisin correlated with rubisco proteolysis

KEY-WORDS: proteolysis, rubisco, senescence, stress, subtilisin.

Caracterizao da subtilisina relacionada com a degradao da ribulose bisfosfato carboxilase de plantas

1.1 Degradao da rubisco

1.1.1 Inibio da degradao e susceptibilizao degradao

Caracterizao da subtilisina relacionada com a degradao da ribulose bisfosfato carboxilase de plantas

Caracterizao da subtilisina relacionada com a degradao da ribulose bisfosfato carboxilase de plantas

1.1.2 Degradao cloroplstica da rubisco

Caracterizao da subtilisina relacionada com a degradao da ribulose bisfosfato carboxilase de plantas

1.1.3 Senescncia do cloroplasto

Caracterizao da subtilisina relacionada com a degradao da ribulose bisfosfato carboxilase de plantas

1.1.4 Degradao vacuolar

Caracterizao da subtilisina relacionada com a degradao da ribulose bisfosfato carboxilase de plantas

Caracterizao da subtilisina relacionada com a degradao da ribulose bisfosfato carboxilase de plantas

1.2 Proteases de subtilisina

Caracterizao da subtilisina relacionada com a degradao da ribulose bisfosfato carboxilase de plantas

Tabela 1 Caractersticas de algumas subtilisinas

Referncias ARA12 At5g67360 Arabidopsis thaliana Caractersticas bioqumicas

AIR3 At2g04160 Arabidopsis thaliana

Referncia XSP1 At4g00230 Arabidopsis thaliana Caractersticas bioqumicas

ALE1 At1g62340 Arabidopsis thaliana

Referncia SBT_AT AT3G14067 Arabidopsis thaliana Caractersticas bioqumicas

LeSBT1 Lycopersicum esculentum

Caracterizao da subtilisina relacionada com a degradao da ribulose bisfosfato carboxilase de plantas

P69A Lycopersicum esculentum

Referncia Ag12 Alnus glutinosa Caractersticas bioqumicas

P2* Triticum aestivum

78 kDa, resistente a 40 C, actividade ptima a pH 10-11.

Referncia Protease C1 Glycine max Caractersticas bioqumicas

*Podero ser a mesma protena.

Caracterizao da subtilisina relacionada com a degradao da ribulose bisfosfato carboxilase de plantas

H] leucina (5,22 TBq.mmol-1) foi obtido na Amersham

2.2 Material biolgico

Caracterizao da subtilisina relacionada com a degradao da ribulose bisfosfato carboxilase de plantas

2.2.1 Condies de cultura de Lemna minor

.s-1) e em meio de cultura completo ou em meio de cultura completo contendo

2.2.2 Condies de cultura de Triticum aestivum

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