Universidade Estadual de Campinas UNICAMP Instituto de Qumica IQ Bioqumica II QG651

Mdulo II: Carboidratos

Prof Ljubica Tasic PEDS: Alessandra Prando Fbio Henrique dos Santos Rodrigues

Aluno Eduardo Jos Creatto

RA 083454

Data do experimento: 6, 13 e 20 de Junho de 2011

1. Introduo Carboidratos, tambm conhecidos como hidratos de carbono devido a formula emprica muito freqente Cn(H2O)n, glicdios, glcidos, glucdeos, glcidos, glcides, sacardeos , acares, ou hidratos de carbono , so as biomolculas mais abundantes na natureza, constitudas principalmente por carbono, hidrognio e oxignio, podendo apresentar nitrognio, fsforo ou enxofre em sua composio 1. Os carboidratos, so mais simplesmente definidos como pollidroxialdeidos ou cetonas e seus derivados 2. Os monossacardeos, tambm chamados de acares simples, consistem numa s unidade poliidroxialdedica ou cetnica. O monossacardeo mais abundante o acar de seis carbonos D-glicose; o monossacardeo fundamental de onde muitos outros so derivados. A D-glicose o principal combustvel para a maioria dos organismos e o monmero primrio bsico dos polissacardeos mais abundantes, tais como o amido e a celulose. Os polissacardeos contem muitas unidades monossacardicas unidas em longas cadeias lineares ou ramificadas. A maioria dos polissacardeos possui unidades monossacardicas repetitivas de uma nica espcie ou de duas espcies alternadas2. Entre as diversas funes atribudas aos carboidratos, a principal a funo energtica. Tambm atuam como elementos estruturais e de proteo na parede celular das bactrias, fungos e vegetais, bem como em tecidos conjuntivos e envoltrio celular de animais. Agem como lubrificantes das articulaes esquelticas e fornecem coeso entre as clulas. Podem funcionar como sinalizadores celulares. Alguns carboidratos, como a ribose e a desoxirribose, fazem parte da estrutura de nucleotdeos e dos cidos nuclicos1. Todos os monossacardeos simples so slidos, cristalinos, brancos e altamente solveis em gua devido seus grupos carbonilicos e alclicos participarem de ligaes de hidrognio com esta, e insolveis em solventes orgnicos apolares. Todos os monossacardeos, exceto a diidroxiacetona, contm um ou mais tomos de carbono assimtrico e, portanto, so molculas quirais. Deve ser lembrado que D e L-gliceraldedos so os compostos de referncia para designar a configurao absoluta de todos os compostos estereoisometicos (Figura 1). A classificao D e L no possui ligao obvia entre d e l, de dextrorrotatrio e levorrotatrio, sendo estes baseados na rotao do plano da luz polarizada2.
CHO OH CHO H H

OH

CH2OH

CH2OH

L-gliceraldedo D-gliceraldedo Figura 1: Estereoismeros do gliceraldedo. Os mtodos cromatogrficos tm revolucionado a arte de isolar, separar e identificar os acares e seus derivados. A cromatografia em papel e a cromatografia de camada delgada so as mais empregadas. Para maior separao e anlise, as misturas de acares so cromatografadas em colunas de troca inica na presena de cido brico em excesso, o qual transforma os acares neutros em seus boratos complexos, fracamente cidos, e permite-lhes serem mais efetivamente separados com base na diferena de propriedades cido-bsicas. A estrutura desses complexos de borato no conhecida com certeza; eles se dissociam facilmente, formando o acar livre e cido brico2. 2

A refratometria muito utilizada para determinar a concentrao de acar em um fluido, tambm conhecido por ndice de Brix, em frutas, doces preparados, mel e outros alimentos, pela medida do ndice de refrao dessa substncia 3. Como veremos, h tambm testes especficos para caracterizao de carboidratos, como a reao do lugol, reao de Molish e reao com reagente de Fehling.

2. Parte Experimental 2.1. Extrao do Amido da Batata Limpou-se 4 batatas medias e cortou-as em pedaos. Triturou-se as mesmas com o auxlio de um triturador eltrico. A pasta obtida foi transferida para um bquer de 800 mL previamente pesado. Adicionou-se 200 mL de gua destilada e misturou-se com uma bagueta. Separou-se o amido suspenso na gua, do dendrito, pela filtrao com pano para outro bquer de massa conhecida. O filtrado foi retornado ao bquer contendo o amido e filtrado novamente. Este processo foi repetido 8 vezes. A ltima retirada de gua foi feita com uma pipeta de Pasteur conectada a uma trompa d'gua. Secou-se o amido em estufa e guardou-o em geladeira. Determinou-se a porcentagem de amido na batata. 2.2. Cromatografia em Camada Delgada (CCD) Aplicou-se em duas placas de alumnio cobertas com alumina na altura de 2 cm da borda inferior, amostras de concentrao 0,1 mol L -1 de glicose, lactose, sacarose, amido, xilose, frutose e metil--D-glicopiranosdeo. Utilizou-se como fase mvel uma mistura de n-butanol:cido actico:ter de etla:gua na proporo de 10:2:3:1 (v/v/v/v). Deixou-se eluir por cerca de 40 min, aps a eluio secou-se as placas ao ar e borrifou-se soluo de cido sulfrico e deixou-as por 15 min em estufa a 110 C. 2.3. Reaes de Caracterizao de carboidratos Reao do Lugol: adicionou-se em um tubo de ensaio 2 mL de soluo de amido 1% e 2 gotas de lugol (1 g de iodo e 5 g de KI em 100 mL de gua). Aqueceu-se. E posteriormente resfriou-se. Reao de Molish: adicionou-se em oito tubos de ensaio enumerados gua destilada e as solues 1 % de glicose, lactose, sacarose, amido, xilose, frutose e metil--D-glicopiranosdeo, respectivamente. Adicionou-se 1 mL do reagente de Molish (5 g de -naftol em 100 mL de lcool etlico) em cada um dos tubos. A seguir, adicionou-se 2 mL de cido sulfrico concentrado a cada um todos tubos, deixando escorrer pela parede, de forma que os lquidos no se misturem. Reao com Reagente de Fehling: enumerou-se oito tubos de ensaio e adicionou-se gua destilada e as solues 1 % de glicose, lactose, sacarose, amido, xilose, frutose e metil--D-glicopiranosdeo, respectivamente. Adicionou-se em cada um dos tubos 2 mL do reagente de Fehling (Fehling A: 34,6 g de sulfato de cobre pentahidratado em 1 L de gua, Fehling B: 173 g de tartarato de sdio e 125 g de NaOH em 1 L de gua) misturado. Deixou-os em banho fervente por 1min. Hidrlise da Sacarose: Colocou-se em um tubo de ensaio 5,0 mL de da soluo de sacarose (0,1 mol/L) e 1,0 mL de cido clordrico 3,0 mol/L. Colocou-se o tubo durante em banho de gua fervente por 5 min. Resfriou-se e alcalinizou-se com 18 gotas de NaOH 6 mol/L. Adicionou-se 2,0 mL de Fehling. Aqueceu-se novamente o tubo por 1 min. 2.4. Hidrlise cida do Amido 3

Enumerou-se 10 tubos de ensaio e adicionou-se 5,0 mL de gua destilada em cada um. Adicionou-se 30 mL de soluo de amido 1% e 30 mL de cido clordrico 3 mol/L em um erlenmayer de 125 mL. Colocou-se o erlenmayer em banho de gua quente, coletou-se imediatamente uma alquota de 2 mL e transferiu-a para o tubo nmero 1. Aps 4 min coletou-se outra alquota de 2,0 mL e adicionou-se o tubo 2. O mesmo foi feito para os demais tubos. Aps isto, adicionou-se 2 gotas de soluo de lugol. A seguir alcalinizou-se o meio com 13 gotas de NAOH 6,0 mol/L e adicionou-se 2,0 mL da soluo do reagente de Fehling em cada tubo. Aqueceu-se os tubos em banho de gua fervente por 5 min. 2.5. Precipitao do Amido A 5 mL de soluo de amido adicionou-se 5 mL de soluo saturada de sulfato de amnio. Agitou-se fortemente e deixou-se em repouso por cerca de 20 min. Filtrou-se e determinou-se a presena de amido no filtrado e no precipitado pelo teste do lugol. A 1 mL de soluo de amido adicionou-se 5 mL de lcool etlico, agitou-se e filtrou-se. Determinou-se a presena de amido no filtrado e no precipitado pelo teste do lugol. 2.6. D-Glicose do Amido Ressuspendeu-se o amido obtido em 100 mL de gua e transferiu-se para o balo de 500 mL. Adicionou-se HCl concentrado at obter concentrao de 6 mol/L, e montar um sistema de refluxo com pedras de ebulio. Utilizou-se manta aquecedora e deixou-se o sistema em ebulio por 1 h. resfriou-se o hidrolisado em gua corrente, e em seguida filtrou-se com carvo ativo. Os demais procedimento no puderam ser realizados por erros ocorridos.

3. Resultados e Discusso 3.1. Extrao do Amido da Batata Amido um polissacardeo, sintetizado pelos vegetais para ser utilizado como reserva energtica. Sua funo, portanto, anloga ao do glicognio nos animais. Amido uma mistura de dois polissacardeos, amilose e amilopectina, cujos monmeros so a glicose. A amilose constituda de 250 a 300 resduos de D-glicopiranose, ligadas por pontes glicosdicas -1,4, que conferem molcula uma estrutura helicoidal. A amilopectina, menos hidrossolvel que a amilose, constituda de aproximadamente 1400 resduos de -glicose ligadas por pontes glicosidicas -1,4, ocorrendo tambm ligaes -1,6, que do a ela uma estrutura ramificada. A amilopectina constitui, aproximadamente, 80% dos polissacardeos do amido. Isto confere a baixa solubilidade do amido em gua, que foi utilizada neste experimento para separar-lo do dendrito. Com este procedimento pode-se determinar o teor de amido na batata de 10,65% (m/m), bem prximo do valor de 13% encontrado na literatura [4]. O menor valor encontrado sugere que o mtodo falha ao extrair totalmente o amido do tubrculo. 3.2. Cromatografia em Camada Delgada (CCD) A cromatografia em camada delgada baseia-se na afinidade entre as molculas do analito e do solvente. A mistura de solventes utilizada como fase mvel apresenta-se majoritariamente apolar, assim, espera-se que os carboidratos cuja estrutura seja apolar percorra maior distncia e apresente maior Rf. As duas corridas realizadas encontram-se em anexo, a ordem de aplicao foi, da esquerda para a direita, sacarose, xilose, lactose, glicose, frutose, metil--D-glicopiranosdeo e amido. Os Rf's encontrados para cada molcula encontram-se na Tabela 1. 4

Tabela 1: Dados da cromatografia em camada delgada. Molcula Rf Sacarose 0,05 Xilose Lactose 0,05 Glicose 0,34 Frutose 0,34 metil--D-glicopiranosdeo 0,41 Amido 0,00 Os resultados obtidos podem ser explicados pela estrutura de cada molcula, como mostrado a seguir. No se sabe o que houve com a amostra de xilose, que aparentemente no foi revelada. J o amido no eluiu pelo seu tamanho.

Sacarose

Xilose

Lactose

Glicose

Frutose

metil--D-glicopiranosdeo

Amido 3.3. Reaes de Caracterizao de carboidratos Reao do Lugol: o lugol ou soluo de Lugol uma soluo de I 2 em equilbrio com KI em gua destilada. Foi nomeada em honra ao mdico francs J. G. A. Lugol. O iodeto de potssio adicionado para aumentar a solubilidade do iodo por formao do nion triatmico I3- [5]: I2 I I 3 Com o amido a colorao tpica o azul escuro, resultante da incorporao do triiodeto a hlice de -amilose, como mostrado na Figura 2.

a) b) Figura 2: Milhares de molculas de glicose polimerizam-se para formar molculas imensas de -amilose, como mostrado esquematicamente em a). Em b) apresentado um esquema em que a espcie de iodo I3- incorporada a hlice de amilose [6]. Observou-se que ao adicionar o lugol a soluo ficou azul intensa, resultado da interao do triiodeto com o amido. Ao aquecer-se a soluo, esta ficou amarelada. Isto ocorre, pois o aquecimento abre a estrutura helicoidal do amido, liberando o on I3-, perdendo assim sua colorao caracterstica. Ao resfriar-se novamente, a estrutura fechada com adsoro da espcie de iodo, retomando sua colorao inicial. Reao de Molish: os monossacardeos podem ser facilmente desidratados por ao de cidos fortes concentrados, como o cido sulfrico. O cido rompe facilmente as ligaes glicosdicas presentes em molculas de polissacardeos, quebrando-os e fornecendo seus monossacardeos. Esses, por sua vez, so desidratados e podemos ter como produto: o furfural, quando o monossacardeo desidratado for uma pentose, e o hidroximetilfurfural (HMF), quando for uma hexose. Tanto o furfural quanto o HMF so substncias incolores, impedindo que a reao seja visualizada. Para resolver esse problema, adiciona-se um composto fenlico ao meio, o -naftol. Este reage com os produtos incolores, e provoca o aparecimento de um anel de colorao lils, como mostrado na Figura 3.

Figura 3: Esquema reacional da Reao de Molish7. A Tabela 2 apresenta os dados encontrados neste teste. Tabela 2: Resultado da Reao de Molish. Contedo Fase inferior Interface Fase superior Anis amarelo e gua Incolor Amarelada branco Anis amarelo, Glicose Incolor Amarelada preto e branco Anis preto e Lactose Incolor Amarelada cinza Anel castanho e Sacarose Castanho precipitado Amarelada amarelo Anis amarelo e Precipitado branco Amido Incolor preto coloidal Anis castanho, Xilose Incolor Amarelada violeta e branco Anis castanho e Frutose Incolor Amarelada branco metil--DAnis verde e Incolor Amarelada glicopiranosdeo branco Comparando-se os resultados com o branco, no vemos claramente a colorao violeta, apenas para a xilose, porm, as coloraes castanha, verde, preta e etc, servem tambm como resultados positivos, como era de se esperar. Reao com Reagente de Fehling: a soluo de Fehling, tambm chamada de reagente de Fehling, uma soluo desenvolvida pelo qumico alemo Hermann von Fehling, usada para se diferenciar entre os grupos funcionais cetona e aldedo, muito aplicada a carboidratos. A soluo a ser testada aquecida junto com a soluo de Fehling; um precipitado de cor vermelha indica a presena de um aldedo. As cetonas no reagem. A reao dada por8
RCHO Cu2O R COOH 2CuO aldedo reagente de Fehling cido carboxlico xido cuproso ( ppt vermelho)

Apenas as solues de amido, xilose e metil--D-glicopiranosdeo no apresentaram o precipitado vermelho, inclusive o branco. Assim, confirma-se que estas no apresentam grupamento aldedo disponvel para a oxidao, enquanto as demais amostras so aldoses. O amido, apesar de conter glicose em sua estrutura, no apresenta resultado positivo para o teste pois seu grupo aldol est associado a outra molcula no polmero, impossibilitando a reao. A soluo de sacarose apresentou colorao castanha mesmo no tendo grupos aldedos livres, indicando contaminao desta. Hidrlise da Sacarose: como dito, carboidratos podem ser hidrolisados por cidos fortes, neste caso o cido clordrico. A hidrlise acida da sacarose gera glicose e frutose. Dessa forma o teste de Fehling aps a hidrlise deve apresentar resultado positivo para aldedo devido a presena dessas carboidrato livres para a reao de oxidao.

3.4. Hidrlise cida do Amido Da mesma forma como para a sacarose, o amido tambm pode sofrer hidrlise cida, liberando neste caso, apenas molculas de glicose. Aps a adio do lugol, as solues de menor tempo reacional apresentaram colorao azul bastante intensa, como observa-se no anexo. Clareando at a colorao caractersticas do lugol na ausncia de amido. Isto indica grande concentrao de amido no inicio da reao, e consumo total deste aps os 40 min de reao. A adio do reagente de Fehling seguida de aquecimento gerou precipitado vermelho apenas nos tubos de ensaio a partir do nmero 6. Neste caso, este teste comprova a hidrolise do amido observando a presena de glicose que foi oxidada gerando o xido cuproso. 3.5. Precipitao do Amido Os resultados mostraram que a soluo saturada com sulfato de amnio precipita o amido, porm, segundo o teste do lugol indicado pela colorao azul, ainda h amido na soluo aps filtrada. O sulfato de amnio induz a precipitao do amido devido o aumento da forma inica, de acordo com o observado pela srie de Hofmeister. Por sua vez, o etanol induz a precipitao pois este interage fortemente com a gua, levando a ausncia de molculas de gua na solvatao do amido, resultando na sua precipitao. Precipitao esta muito mais eficaz que a do sulfato de amnio, no havendo presena de amido na soluo aps filtrao, como indicado pelo teste do lugol. 3.6. D-Glicose do Amido Novamente, neste procedimento deseja-se hidrlise do amido, para a obteno da D-glicose. Contudo, o aquecimento da mistura reacional foi realizado com manta de aquecimento, provocando a degradao do amido como evidenciado pela colorao preta obtida. Neste caso, o ideal seria promover um aquecimento de forma mais branda pela utilizao de banho de gua fervente. Na sequncia da hidrlise, a Dglicose seria cristalizada e seu teor no amido determinado.

4. Concluso Neste experimento pudemos extrair o amido presente na batata por um processo simples, utilizando apenas gua e filtrao, baseando-se na baixa solubilidade do amido. Pode-se tambm determinar a porcentagem deste na batata, com excelente acordo com o encontrado na literatura. Foi realizada tambm uma cromatografia de 8

camada delgada de diversos carboidratos, onde pode-se relacionar seu tamanho e polaridade as distncias por estes percorridas. Reaes de caracterizao de carboidratos tambm foram estudadas. Verificou-se a aplicao da reao do lugol na identificao de amido; reao de Molish na identificao de carboidratos em geral; e da reao com reagente de Fehling para identificao de aldoses e cetoses. Por fim, estudou-se a hidrlise cida do amido, e a utilizao de sulfato de amnio ou etanol na precipitao do mesmo, onde este ltimo apresentou maior eficcia.

5. Referncias [1] http://pt.wikipedia.org/wiki/Carboidrato, acessado em 19/06/2011 s 03:15; [2] Lehninger, A. L. Bioqumica; traduo da 2 edio americana. So Paulo, Edgard Blcher, 1976, vol. 1 Componente moleculares das clulas, pg. 109-124; [3] http://pt.wikipedia.org/wiki/Refract%C3%B3metro, acessado em 20/06/2011 s 20:35; [4] http://w3.ufsm.br/ppgcs/congressos/Fertbio2004/Fs356.pdf, acessado em 20/06/2011 s 21:21; [5] http://pt.wikipedia.org/wiki/Lugol, acessado em 20/06/2011 s 23:08; [6] Skoog, D. A.; West, D. M.; Holler, J.; Crouch, S. R. Fundamentos de Qumica Analtica, Traduo da 8 edio norte-americana, So Paulo: Thomson Learning, 2007,pg 531-532,541 [7] http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_ch/molisch.htm, acessado em 21/06/2011 s 15:44; [8] http://pt.wikipedia.org/wiki/Solu%C3%A7%C3%A3o_de_Fehling, acessado em 22/06/2011 s 21:28.

Anexos
Cromatogramas

Hidrlise cida do Amido

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