Aplicaciones de la propagacin masiva de plantas.

Molecular Farming
Dra. Mara Alejandra Alvarez
malvarez@centromilstein.org.ar

Instituto de Ciencia y Tecnologa Dr. Csar Milstein CONICET- Fundacin Pablo Cassar
Jornada de Actualizacin en Propagacin Masiva de Plantas y sus Aplicaciones Buenos Aires 2 de noviembre 2009

Molecular Farming
Se define como una estrategia alternativa de producir molculas (protenas, cidos grasos) de aplicacin teraputica o industrial en organismos transgnicos (animales, vegetales) Los motores primarios de este desarrollo son economa, eficiencia y seguridad. La demanda de USA de protenas recombinantes se expande en un 13% por ao.
Mercado actual: 50 mil millones de U$. Mercado estimado en 2010: 10 mil millones de U$.

Ventajas
Bioseguridad Maquinara de sntesis proteica eucarionte Produccin en condiciones controladas (sistemas confinados)

Aspectos crticos
Glicosilacin: no siempre debe ser idntica, hay estrategias para resolverlo (humanizacin de glicoprotenas). Tiempo: optimizacin del esquema de produccin

DSP: igual que para cualquier otra plataforma, se resuelve si el producto no requiere purificacin, usando fusin a oleosinas o con cultivos in vitro (secrecin al medio).
Rendimiento: Al menos 1% de protena total soluble para ser competitivo con otros sistemas. Optimizacin a distintos niveles: ingeniera gentica, actividad proteoltica, etc.

Sistemas de produccin
Planta a campo Sistemas confinados (cultivos in invernculos, piletas, hidroponia, etc.)

vitro,

Cultivos in vitro
Callos Cultivos de rganos (races, tallos) Frascos agitados Bioreactores Suspensiones celulares Frascos agitados Bioreactores

Races transformadas
Rpido crecimiento Estado de organizacin

Estabilidad de produccin

Biorreactores para el cultivo de races

Bioreactor de lecho de goteo con malla para inmovilizar a las races
Inculo
Salida de aire Malla de inmovilizacin

Bioreactor de lecho de niebla (nutrient mist reactor)

Adicin de nutrientes Bomba peristltica Filtro de aire

Bomba de aire

Generador de niebla Aire Aire Reservorio Intensidad On Off Controlador Condensador de niebla

Bomba

Cmara de cultivo

Tomado de:Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Suspensiones celulares
Frascos agitados
Pequeos volmenes Conocimiento del sistema Estudios para escalado

Bioreactores
Volumen 1 -3000 litros Produccin en gran escala Modelo acorde al sistema y escala de produccin

Tipos de bioreactores usados en cultivos vegetales

Consideraciones para el diseo

Crecimiento y demanda de oxgeno Estado de agregacin y propiedades reolgicas Sensibilidad a las fuerzas de corte Formacin de espuma/ pared celular

Crecimiento y demanda de oxgeno

Tiempos de duplicacin altos ( 20-100hs) BY-2: 12 hs NT-1, Xanthi: 18-24 hs Tasa de captacin de oxgeno (OUR): 5-10 mmol- O2/l h (microorganismos: 10-90, clulas animales: 0.02-0.1 x 10-9) A alta densidad celular, productividad volumtrica limitada por la transferencia de oxgeno. Concentracin de oxgeno disuelto crtica: 1.3 1.6 g m3, 20% saturacin. KLa en bioreactor: 10 50 hs -1 (microorganismos: 100-1000; clulas animales: 0.25-10), rango restringido. Aireacin: 0.5 1 vvm (neumticos), 0.05-0.1 vvm (tanques agitados), altos niveles txicos.

Agregados-reologa
Distribucin de tamaos segn la especie, inculo, medio de cultivo, tipo de bioreactor, condiciones de cultivo, etc. Gradiente de nutrientes y oxgeno en el interior de los agregados Reologa: vara a lo largo de la curva de crecimiento (redondeadas- elongadas).

Sensibilidad a las fuerzas de corte

Tamao celular (largo: 100- 500 m , dimetro: 20-50 m) mayor a bacterias (dimetro < 1 m), hongos (largo <100 m, dimetro: 510 m), clulas animales ( dimetro: 10-100 m) Alto volumen de vacuolas (90% volumen total) Pared celular rgida, no- flexible. Alta sensibilidad durante la fase tarda de crecimiento exponencial y estacionaria temprana (elevado tamao celular, elevado tamao vacuolar) Influye sobre: viabilidad, liberacin al medio de compuestos intracelulares, cambios metablicos, cambios morfolgicos, patrones de agregacin. Valores de productividad menores a los de cultivos en frascos agitados

Espuma/pared celular
En la fase de crecimiento exponencial Exacerbada durante la fase estacionaria Las clulas entrampadas en la espuma tienen deficiencia de nutrientes y oxgeno: cada de la productividad Crecimiento en pared, impeler, sensores. Taponamiento de filtros de aire. Estrategias posibles: menor velocidad de agitacin y aireacin, agregado de anti-espumas (0.01 % del V), por aeracin de superficie o sin burbujeo, uso de disrruptor mecnico de espuma.

Estrategias para productos intracelulares

Aumento de la tasa de crecimiento Aumento de la concentracin de biomasa Fase exponencial ms extensa Batch-/batch alimentado a alta densidad celular Cultivo semi-continuo o continuo para evitar grandes agregados celulares y adhesin a superficies

Estrategias para productos extracelulares

Mayor tasa de crecimiento Mayor concentracin de biomasa Fase exponencial ms extensa Batch, batch alimentado, perfusin en cultivos de alta densidad celular Recuperacin de producto in situ Mayor estabilidad de protenas por agregado de aditivos estabilizantes o inhibidores de proteasas.

Tanques agitados
Agitador de paletas planas o Rushton

Pros
Flexibilidad Altos coeficientes de transferencia de masa Homogneos Aplicable a cultivos de alta densidad Agitador de paletas inclinadas Permite trabajar en GMP Sistema de mezclado (shear stress) Costos Generacin de calor Riesgos de contaminacin en vlvulas

Cons

Neumticos: burbujeo
Pros
Fcil de escalar Bajos costos Bajos riesgos de contaminacin Sin generacin decalor Bajo shear stress

Cons
Transferencia de oxgeno pobre Mezclado ineficiente en cultivos de alta viscosidad Formacin de espuma a alta aireacin

Neumticos: airlift
Pros
Direccionamiento del burbujeo Buena transferencia de oxgeno Menor shear stress, sin generacin de calor Menores tiempos de mezclado Menores costos, sencillez de escalado, eficiente circulacin de fluidos

Cons
Mezclado ineficiente en cultivos de alta viscosidad Formacin de espuma a alta aireacin

Wave
Pros
Shear stress Transferencia de oxigeno Costos operacionales

Cons
Escalado Transferencia de calor Estrategias operacionales avanzadas

De membrana
Pros
Remocin de productos extracelulares Bajo shear stress Bajos costos operacionales

Cons
Escalado Oxigenacin Baja transferencia de calor Monitoreo on- line

Algunos ejemplos comerciales

Producto Vacunas aviares glucocerebrosidasa paclitaxel Sistema Suspensiones celulares de tabaco (4-40 mg l-1) Suspensiones celulares de zanahoria (Fase III) Suspensiones celulares de Taxus Compaa Dow AgroSciences Protalix Biotherapeutics Phyton Biotech

IPLEX (macasermin rinfabato )

Suspensiones celulares (2 g l-1)

Phyton Biotech+ Insmed

Eco-Pod
Reactor temporario para algas. Produccin de biocombustibles.

Muchas gracias por su atencin

malvarez@centromilstein.org.ar