OBJETIVOS
a) Conocer la tcnica de cromatografa en capa fina, c.c.f., sus caractersticas y los factores que en ella intervienen. b) Calcular valores de r.f. de varias sustancias y correlacionarlo a la seleccin adecuada del eluyente y deducir la relacin que existe entre la polaridad de las sustancias que se analizan y la de los eluyentes utilizados. c) Aplicar la tcnica de c.c.f. como criterio de pureza e identificacin de sustancias.
ANTECEDENTES
a) Concepto de cromatografa. Tipos de cromatografa. Cromatografa de adsorcin y cromatografa de particin. Ejemplos. b) La cromatografa en capa fina. Sus caractersticas y aplicaciones. c) Eluyentes, soportes y reveladores ms comunes para cromatografa en capa fina. d) Factores que influyen en una separacin por cromatografa de capa fina.
CONCEPTO DE CROMATOGRAFA.
La cromatografa se define como la separacin de una mezcla de dos o mas compuestos por distribucin entre dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra una fase mvil. Varios tipos de cromatografa son posibles, dependiendo de la naturaleza de las dos fases involucradas: slido-liquido (capa fina, papel o columna), liquido-liquido y gases-liquido ( fase vapor ). Todas las tcnicas cromatogrficas dependen de la distribucin de los componentes de la mezcla entre dos fases inmiscibles: una fase mvil, llamada tambin activa, que transporta las sustancias que se separan y que progresa en relacin con la otra, denominada fase estacionaria. La fase mvil puede ser un lquido o un gas y la estacionaria puede ser un slido o un lquido. Todos los slidos finamente pulverizados tienen el poder de adsorber en mayor o menor grado otras sustancias sobre su superficie; y, similarmente, todas las sustancias pueden ser adsorbidas, unas con ms facilidad que otras. Este fenmeno de adsorcin selectiva es el principio fundamental de la cromatografa.
CONCEPTO DE R.F.
Rf es el registro y se define como: Rf = distancia que recorre la muestra desde el punto de aplicacin / distancia que recorre el disolvente hasta el frente del eluyente El valor de Rf depende de las condiciones en las cuales se corre la muestra (tipo de adsorbente, eluyente, as como las condiciones de la placa, temperatura, vapor de saturacin, etc.). Tiene una reproducibilidad de 20%, por lo que es mejor correr duplicados de la misma placa.
a) Temperatura: a menor temperatura las sustancias se adsorben ms en la fase estacionaria. b) La cromatografa debe llevarse a cabo en un rea sin corrientes de aire. c) Limpieza de las placas. Muchas placas estn contaminadas con grasa o agentes plastificantes o adhesivos. Para el trabajo a pequea escala, stas deben limpiarse corriendo primero una mezcla de cloroformo y metanol y despus dejar secar completamente antes de aplicar la muestra. d) Pureza de los disolventes.
SUSTANCIAS Y REACTIVOS
Es un experimento comparativo en el que se desea saber cul sustancia es ms polar y cul menos polar. Para ello se le proporcionar a usted las soluciones 1 y 2. Prepare 3 cromatoplacas (Nota 1) y aplique estas soluciones en cada una de ellas (Nota 2), de tal manera que queden como se indica en la siguiente figura:
Eluya la primera cromatoplaca con hexano, la segunda con ACOEt y la tercera con MeOH. En cada caso, una vez que se ha eludo cada placa, sacar de la cmara de elucin y dejar evaporar el eluyente para posteriormente revelar con luz ultravioleta y posteriormente con yodo, observe y anote sus resultados (Nota 3), luego revele con yodo, observe nuevamente (Nota 4). Con base en los resultados obtenidos, conteste: a) Cul es el eluyente adecuado? por qu? b) Cul es la sustancia ms polar (solucin 1 2)? por qu? c) Cul es la sustancia menos polar (solucin 1 2)? por qu?
Se desea saber cul es el efecto de la concentracin de una sustancia en c.c.f. Para ello se le proporcionar a usted la solucin 5. Prepare una cromatoplaca y en ella haga 3 aplicaciones de esta solucin en orden creciente de concentracin como se indica en la siguiente figura:
Eluya entonces con AcOEt. Revele con luz U.V y. posteriormente con yodo. En cada caso observe la intensidad de la coloracin de las manchas. Cul es la relacin que existe entre la intensidad de la coloracin de las manchas y la concentracin de la sustancia, en cada caso?
Luego eluya una de las cromatoplacas con AcOEt revelando con luz U.V. y despus con yodo. Anote sus observaciones.. La otra cromatoplaca elyala varias veces (4 por lo menos) con un eluyente menos polar, por ejemplo una mezcla de hexano-AcOEt (4:1), dejando secar la placa entre una elucin y otra. Observe la placa a la luz U.V. despus de cada elucin. Si despus de la cuarta elucin la mezcla no se separa, siga eluyendo hasta la separacin. Finalmente revele con yodo. Anote sus observaciones.
2. Se desea identificar el principio activo de un medicamento comercial, por medio de su comportamiento en c.c.f., comparndolo con un estndar bajo las mismas condiciones experimentales. Para esto, se le proporcionar una muestra problema de de un analgsico comercial, el cual se identificar por comparacin con las siguientes soluciones estndar: A (cido acetilsaliclico), B (cafeina) y C (acetaminofen) (Nota 5). Prepare dos cromatoplacas, aplique los estndares de dos en dos y eluya con hexano, con ACOEt y con hexano-AcOEt (1:3) y revele con luz U.V. o con yodo. Calcule el Rf de cada una de ellas, y seleccione el eluyente ideal
Prepare tres cromatoplacas, aplique cada estndar y su muestra problema, como se muestra:
Eluya cada placa con el eluyente ideal y revele con luz U.V. y posteriormente con yodo. Anote sus observaciones. Finalmente identifique que compuesto contiene el producto comercial que se leproporciono.
Notas:
1) Para preparar las cromatoplacas se introducen dos portaobjetos juntos, limpios y secos, en una suspensin de gel de slice al 35% en AcOEt. Para mayor facilidad se pueden usar cromatofolios comerciales. 2) Para aplicar las soluciones a las cromatoplacas utilice capilares, que previamente deber ser estirados en la flama del mechero con el fin de que tengan el dimetro adecuado. Ver figura. 3) Precaucin, nunca mire directamente la luz ultravioleta, sta puede causar daos severos al ojo. Una vez revelada la placa, marque ligeramente con un lpiz el contorno de las manchas para mejor ubicacin de las mismas. 4) Para mayor claridad de los resultados, incluya en su informe los dibujos de las cromatoplacas de todos los experimentos de esta prctica. Hgala del mismo tamao de las placas. 5) En este caso son soluciones estndar de productos puros.
MANEJO DE RESIDUOS
D1 a D5: Guardar los disolventes para recuperarlos por destilacin D6: Empacar cuidadosamente para incineracin. D7: Se puede recuperar para su reuso, previo lavado y secado
CUESTIONARIO
a) En el experimento 1, cul de las dos sustancias, la ms polar o la menos polar, recorre mayor distancia en la placa a partir del punto de aplicacin? Porqu? b) En ese mismo experimento, calcular los valores r.f. y contestar cul de las dos sustancias tiene r.f. mayor y cul menor? Frasco de elucin Revelado con luz UV Placa Papel filtro Punto de aplicacin Disolvente Frente del eluyente c) Qu significa que una sustancia tenga: a) rf < 0.5 ? b) rf = 0.5 ? c) rf > 0.5 ? d) En el experimento 4, cul de las dos formas de elucin permiti mayor separacin de la mezcla?, a qu se debe esto? e) Porqu la c.c.f. es un criterio parcial y no total de identificacin? F) Cul ser el resultado de los siguientes errores en cromatografa en capa fina? a) Aplicacin de solucin muy concentrada. b) Utilizar eluyente de alta polaridad. c) Emplear gran cantidad de eluyente en la cmara de cromatografa. g) Una serie de colorantes es separada por cromatografa en capa fina. Calcular los valores de Rf de cada colorante de acuerdo a la siguiente tabla. Colorantes Distancia Recorrida (mm) Eluyente 66.0 Rojo de metilo 56.0 Rodamina B 38.0 Rojo Congo 0.5 h) Qu tratamiento es necesario darle a la alumina para reutilizarla?