PRCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

PRCTICA No. 1
NORMAS DE BIOSEGURIDAD CDIGOS

Smbolos de riesgo
Para manejar con seguridad las sustancias qumicas se han ideado diversos cdigos dependiendo de la casa fabricante, pero en general los sistemas clasifican las sustancias en las siguientes categoras:

 Sustancias explosivas Peligro. Este smbolo sealiza sustancias que pueden explotar bajo determinadas condiciones. Ejemplo: dicromato de amonio. Precaucin. Evitar choques, percusin, friccin, formacin de chispas y contacto con el calor. Sustancias oxidantes (comburentes) Peligro. Los compuestos comburentes pueden inflamar sustancias combustibles o favorecer la amplitud de incendios ya declarados, dificultando su extincin. Ejemplo: permanganato de potasio, perxido de sodio. Precaucin. Evitar cualquier contacto con sustancias combustibles.

 Sustancias fcilmente inflamables a. Sustancias autoinflamables. Ejemplo: alquilos de aluminio, fsforo. Precaucin. Evitar contacto con el aire b. Gases fcilmente inflamables. Ejemplo: butano, propano. Precaucin. Evitar la formacin de mezclas inflamables gas-aire y aislar de fuentes de ignicin. c. Sustancias sensibles a la humedad Productos qumicos que desarrollan emanaciones de gas inflamable al contacto con el agua. Ejemplo: litio, borohidruro de sodio. Precauciones: evitar contacto con agua o con humedad.

 Lquidos inflamables En trminos muy sencillos, los lquidos inflamables son aquellos que fcilmente pueden arder. El que un lquido arda con ms o menos facilidad depende de su punto de llama. Entre ms bajo sea este punto ms fcilmente arde el reactivo y por lo tanto mayor cuidado se ha de tener en su manejo, almacenamiento y transporte. Con estos lquidos se ha realizado una clasificacin teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto y su solubilidad en el agua:

 Sustancias txicas Peligro. Tras una inhalacin, ingestin o absorcin a travs de la piel pueden presentarse, en general, trastornos orgnicos de carcter grave o incluso la muerte. Ejemplo: trixido de arsnico, cloruro de mercurio(II). Precaucin. Evitar cualquier contacto con el cuerpo y en caso de malestar acudir inmediatamente al mdico. Sustancias nocivas Peligro. La incorporacin de estas sustancias por el organismo produce efectos nocivos de poca trascendencia. Ejemplo: tricloroetileno. Precaucin. Evitar el contacto con el cuerpo humano as como la inhalacin de vapores. En caso de malestar acudir al mdico.

 Sustancias corrosivas Peligro. Por contacto con estas sustancias se destruye el tejido vivo y tambin otros materiales. Ejemplo: bromo, cido sulfrico. Precaucin. No inhalar los vapores y evitar el contacto con la piel, los ojos y la ropa. Sustancias irritantes Peligro. Este smbolo destaca en aquellas sustancias que pueden producir accin irritante sobre la piel, los ojos y sobre los rganos respiratorios. Ejemplo: amonaco, cloruro de bencilo. Precaucin. No inhalar los vapores y evitar el contacto con la piel y los ojos.

 Peligroso para el ambiente Un laboratorio de qumica genera muchos y muy variados residuos qumicos. No todos los desechos son igualmente peligrosos o se tratan de la misma manera, por lo tanto es importante ensear al estudiante a llevar los desechos a un sitio previamente determinado por el profesor o el tcnico. No es correcto arrojar los residuos por el desage a menos que se especifique de esta manera. Cuando no es posible eliminar los residuos inmediatamente es necesario almacenarlos en frascos debidamente rotulados.

PRCTICA No. 2
COLORACIONES GRAM Y ZIELH NEELSEN

COLORACIN GRAM
Debe su nombre al bacterilogo dans Crhistian Gram en 1884. La pared externa de la envoltura celular de una bacteria Gram positiva tiene como base qumica fundamental el peptidoglucano, que es un polmero de glucosamina La tincin de GRAM aporta dos ideas bsicas para la definicin de las bacterias: el color que adquieren tras la tincin y la forma que presentan las clulas bacterianas. En lo relativo a la coloracin: Gram-positivos color azul-violeta Gram negativos color rojo-rosado

Cocos.- Micrococos, aislados y dispersos tras la divisin celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococos, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares

Espirales (Treponemas, Borrelias ...)

Racimos: forma tpica de Staphylococcus sp, como S. aureus

Cocos Gram-positivos

Tetradas: forma tpica de Micrococcus sp

Cadenas: forma tpica de Streptococcus sp, como S. pneumoniae, Streptococcus grupo B

STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

PEDIOCOCCUS

Bacilos Gram-negativos
Bacilos finos: forma usual enterobacteriaceae, como E. Coli de

E. COLLI

Pseudomonas_aeruginosa

Bacilos Gram-negativos
Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp, como H. influenzae

Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N. meningitidis Tambin Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfologa de diplococos. Acinetobacter puede ser pleomrfico, y a veces aparece como coco Gram-positivo.

NEISSERIA GONORROEAE
DIPLOCOCO GRAM NEGATIVO

Cocos Gram-negativos Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp, que puede ser Gram-variable.

Bacilos Gram-negativos
Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V. cholerae, y Campylobacter sp, como C. jejuni

Bacilos Gram-negativos
Forma de aguja fina: forma usual de Fusobacterium sp

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

TINCIN DE ZIEHL-NEELSEN
Es una tcnica de tincin diferencial que se basa en que las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan Bacilos cido-alcohol resistentes o BAAR.

 La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.

Coloracin de Ziehl Nielsen Se realiza con fuscina segn Ziehl Nielsen y se debe calentar mientas se colorea la lmina.

Uso: Para identificacin de bacilo tuberculoso (Acido alcohol resistente) Desventaja: Emisin de vapores fenlicos por el calentamiento.

 Teido en rojo bacilos de Mycobacterium tuberculosis Baciloscopia de esputo: visin directa en esputo del bacilo de tuberculosis, con tcnicas de tincin para bacilos cido-alcohol resistentes (Ziehl-Neelsen) o auramina. Cultivo de muestra biolgica.

PRCTICA No. 3
MEDIOS DE CULTIVO

Agar sangre
COMPOSICIN EN g/litro Sustrato nutritivo (extracto de levadura, peptona, hidrolizado de hgado) 23,0
sodio cloruro 5,0 sangre de cordero 65 ml

agar-agar 15,0. Sustrato nutritivo

AGAR CHOCOLATE
Medio extremadamente nutritivo , preparado con adicin de sangre de cordero calentada sobre 80C hasta que el medio se torne parduzco, para liberar la hemoglobina y entregar al medio todos los factores de crecimiento

AGAR MC CONKEY
Medio selectivo por contener sales biliares y violeta cristal que inhiben el crecimiento de bacterias no entricas. Tambin es un medio diferencial porque contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro). Las bacterias capaces de fermentar lactosa producirn un cambio en el pH del medio por liberacin de productos cidos. Como consecuencia sus colonias aparecern de color fucsia/violeta, contrastando con la coloracin amarillenta de las colonias incapaces de fermentar la lactosa.

MEDIO INCLINADO
Medio selectivo y diferencial para el aislamiento e identificacin de Staphylococcus aureus. NaCl 7,5% le proporciona lo selectivo ya que slo estos microorganismos osmotolerantes u osmfilos pueden multiplicarse en l. Manitol es el nico azcar fermentado por las cepas patgenas de este gnero bacteriano. La produccin de cidos proveniente de la fermentacin del manitol es detectada por el viraje del indicador de pH presente en el medio (rojo fenol) a amarillo. Staphylococcus epidermidis no fermenta el manitol, dar lugar a colonias pequeas rodeadas de un halo prpura.

MEDIO POR PICADURA

PRCTICA No. 4
ANTIBIOGRAMA

ANTIBIOGRAMA

PRCTICA No 6
(corresponde a la prctica No. 6 en el programa de clases)

IDENTIFICACIN DE FAMILIAS GRAM POSITIVA

TIPO DE HEMOLISIS

www.telmeds.org

Imgenes: ww.coli.usal.es/Web/educativo/Meningitis/hemolisis-beta.jpg

www.telmeds.org

Imgenes: ww.coli.usal.es/Web/educativo/Meningitis/hemolisis-beta.jpg

Sndrome de la piel escaldada estafiloccica

Enfermedad de Ritter.- eritema e inflamacin cerca de la boca, se extiende a todo el cuerpo, se forman vesculas y ampollas seguidas de descamacin de la piel. Las ampollas no tienen leucocitos. Recuperacin 7-1 das, al aparecer los anticuerpos protectores.

PRUEBA DE LA CATALASA

PRUEBA DE LA COAGULASA

NOVOBIOCINA
Se usa el agar Mueller-Hinton, como el antibiograma tambin en agar sangre. Se utiliza para identificar que tipo de Staphylococcus coagulasa negativos es. Pueden ser sensibles o no a la novobiocina (5 g). Staphylococcus epidermidis es sensible, mientras que Staphylococcus saprophyticus no lo es.

PRUEBA DE MANITOL

PRUEBA DE CAMP
Se realiza en agar sangre. Se usa para poder identificar que estreptococo puede ser (A, B, D). Se basa en que los estreptococos del grupo B (Streptococcus agalactiae) producen un factor llamado CAMP (factor de monofosfato de adenina cclica) que aumenta la zona de hemlisis producida por un estafilococo productor de lisina.

PRUEBA DE CAMP
RESULTADO La prueba positiva se evidencia por la presencia de una zona de potenciacin de la hemlisis en forma de puntas de flecha en el lugar donde se contactan las dos estras

PRUEBA DE LA BILIS ESCULINA

PRUEBA OPTOQUINA

PRACTICA No. 7
UROCULTIVO

AGAR SANGRE: Siembra para contajes de colonias bacterianas en orina

Agar Mac conkey

BACTERIAS LACTOFERMENTADO RAS Citrobacter Escherichia coli Enterobacter Klebsiella Serratia

BACTERIAS NO LACTOFERMENTADORAS Hafnia Salmonella spp. Marganella Proteus spp. Yerssinnia Shigella spp

PRACTICA No. 8
PRUEBAS BIOQUMICAS PARA BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Prueba del citrato

Este medio indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato. Contiene citrato como nica fuente de carbono, fosfato de amonio como nica fuente de fosfato y azul de bromotimol como como indicador de pH. nicamente las bacterias capaces de metabolizar citrato podrn multiplicarse en este medio, al utilizar los fosfatos presentes liberan iones amonio (bsicos) que junto con la eliminacin de citrato (cido) generar una fuerte basificacin del medio que ser aparente con un cambio de color del indicador de pH de verde a azul.

Prueba de la fenilalanina

Medio SIM
(gas sulfhdrico, indol y motilidad)

Prueba de la rea

SISTEMA API PARA ENTEROBACTERIAS

Sistema que permite obtener todos los resultados de las mismas pruebas realizadas arriba, de manera simultnea, rpida y con una menor cantidad de muestras y reactivos.

PRCTICA No. 9
HECES FECALES PARSITOS

Trofozoito de Entamoeba histolytica

Quiste de Entamoeba histolytica

Quistes de Entamoeba histolytica con tincin Wright

Quistes de Entamoeba coli

Quiste Iodamoeba butschlii

Quiste Chilomastix mesnili

Trofozoito teido con Giemsa

Quiste de Giardia lamblia

Quiste de Giardia lamblia

Ciclo de vida de Giardia

Huevos de scaris lumbricoides

Adultos de scaris lumbricoides

Adulto de scaris lumbricoides

Larva de Strongyloides stercoralis

Larva de Strongyloides stercoralis encontrada en esputo

Ciclo de vida de Strongyloides stercoralis

Huevo de Himenolepis nana

Huevo de Himenolepis nana

Huevos de Taenia solium

Huevo de taenia solium

Gusano adulto de Taenia solium

Cabeza o esclex de Taenia solium

Huevo de Trichuris trichiura

Trichuris trichiura adulto hembra

Huevo de Enterobius vermicularis

Enterobius vermicularis adulto macho

PRCTICA No. 10
COPROCULTIVO MEDIOS EMPLEADOS

Agar Mc conkey con colonias de Proteus vulgaris (no lactoferment adora Agar Mc conkey con colonias de E. coli (lactofermentadora

Agar entrico Hectoen con colonias de Shiguella

Agar entrico Hectoen con colonias de E.scherichia coli

Agar SS

MEDIO DE AGAR EMB (EOSIN METHYLENE BLUE)

Contiene sucrosa y lactosa. Utiliza como inhibidor e indicador a eosina azul de metileno. Prueba negativa si se mantiene igual color al medio (rojo), indicativo de la no fermentacin de azcares. Escherichia coli produce un color verde metlico caracterstico para esta prueba positiva.

PRCTICA No. 11
INFECCIONES DE TRANSMICIN SEXUAL

Secrecin vaginal producida por Gardenerella vaginalis

GARDNERELLA 10X

Garnerella vaginalis (clulas claves)

Trichomona vaginalis

Trichomona vaginalis

Trichomona vaginalis

Cndida albicans

Virus papiloma humano (HPV) en cuello de tero

Lesin blanca originada por HPV.

(HPV) 6 y 11 causan en 90% verrugas anogenitales

(HPV) 6 y 11 causan en 90% verrugas anogenitales

CONDILOMA

HPV
verrugas en dedos de pies y manos

HPV

Calymmatobacterium granulomatis
La donovanosis es una infeccin bacteriana progresivamente destructiva de la regin genital, caracterizada por ulceracin e hiperplasia epiteliomatosa. Sinnimos: granuloma inguinal, granuloma venreo.

Este microorganismo causa granuloma inguinal, a lesiones venereas con destrucion local de tejido en los genitales, zona inguinal y regin perianal.

UREOPLASMA UREALITICUM

UREOPLASMA UREALITICUM

UREOPLASMA UREALITICUM

Phthirus pubis

Sarcoptes scabiei

Haemophilus ducreyi

Neisseria ghonorreae

Treponema pallidum

Treponema pallidum

Treponema pallidum

Treponema pallidum

Treponema pallidum

Treponema pallidum

PRCTICA No 12
MICOSIS

ESPECIMENES CLINICOS Secrecin heridas Biopsias Orina Cutneas Exudado mucosas (pelo, piel, uas) Mdula sea Sangre Secrecin vas resp. bajas

Tia

Tia

Tia

Tia

Tia

Tia

Tia

Toma de Muestras/Pitiriasis Versicolor

Lesiones por Cndida

Lesiones por Cndida

Lesiones por Cndida

Lesiones por Cndida

Toma de Muestras/Tias

Examen Directo

Examen Directo/Cabello

Cndida examen en fresco

(KOH 20%)

Examen Directo/Artefactos

Examen Directo/Artefactos

Cndida Tincin Gram. +

Agar Saboraud

Caractersticas de las colonias luego de sembrar en un medio de cultivo

Color

Topografa Textura Tasa crecimiento

Algodonosa

Granular o polvorienta

Aterciopelada

Examen de un Cultivo
Hifas Conidias Clula conidigena Estructura de sostn Cuerpos fructferos Otros

PRCTICA No. 13
TCNICAS BSICAS DE INMUNOLOGA

MICROELISA

Fases del inmunoensayo de ELISA

1. Conjugacin del anticuerpo o del antgeno con un

enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina,...). El anticuerpo conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, etc.. El antgeno marcado se emplea en ensayos de competicin de antgeno.

 2.- Unin del antgeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unin de anticuerpos o antgenos se realiza con facilidad a la superficie de plsticos tratados que tienen gran afinidad por protenas.

 3.- Formacin de una o mas capas de inmunocomplejos. En el caso del antgeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antigeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antigeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto).

 4. Revelado de la
reaccin enzimtica. Despus de un lavado para eliminar todos las molculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se aade el sustrato enzimtico en solucin. Se deja reaccionar y se lee la densidad ptica (D.O.) mediante espectrofotometra. En el esquema se muestra la reaccin asociada a un ELISA directo.

EQUIPOS PARA REALIZAR MICROELISA

ELISA de Competicin

ELISA de Competicin
Se trata de un ELISA de capturacompeticin que emplea dos anticuerpos monoclonales (AcM) especficos frente a dos eptopos diferentes de la protena estructural E2, uno de ellos tapizando las placas (anticuerpo de captura) y el otro conjugado con peroxidasa (anticuerpo detector). Como antgeno utiliza una protena recombinante obtenida mediante el sistema de baculovirus.

ELISA Indirecto

ELISA Indirecto
Las placas de se encuentran tapizadas con un antgeno del VPPC, y tras la incubacin con el suero a testar, la reaccin se pone de manifiesto utilizando como conjugado protena Aperoxidasa. El gran inconveniente de los tres mtodos descritos es que no permiten diferenciar los anticuerpos de enfermedad de los anticuerpos vacunales, de las vacunas actualmente comercializadas en la actualidad.

Fotografa de una placa de ELISA revelada para la enzima

AGLUTINACIN

Cuantifica Ag marcados con radioactividad

Se basa en la competencia por el Ac especfico: entre una concentracin conocida de material marcado y otra desconocida de material no marcado

Radioinmunoanlisis

Despus los complejos que se forma de Ag-Ac se separan y se mide la cantidad de radioactividad

Radioinmunoanlisis

Inmunofluorescencia
Colorantes fluorescentes se unen por covalencia a molculas de Ac Se hacen visibles con luz ultravioleta en el microscopio de fluorescencia. Como estreptococos, treponemas , o en cl. en cortes histolgicos.

El Ac. Marcado se usa para ver Ag. En la superficie de bacterias

Inmunofluorescencia

Fijacin del complemento:

El Sist. de Complemento est constituido por 20 o ms protenas plasmticas . Estas protenas interactan entre si y con las membranas celulares. Cada componente proteico debe ser activado en secuencia y en condiciones apropiadas para que la reaccin progrese. Los complejos Ag-Ac se cuentan entre los activadores y la prueba de fijacin del complemento puede usarse para

Fijacin del complemento

Pruebas de hemaglutinacin:
Hemaglutinacin activa: Ciertos virus aglutinan los eritrocitos de algunas especies.
Esta accin puede ser inhibida por un anticuerpo en forma especfica contra el virus (Inhibicin de la hemaglutinacin) efecto que puede usarse para medir la presencia y concentracin de ese

Hemaglutinacin

PRCTICA No. 14
MALARIA O PALUDISMO

Plasmodium vivax

Trofozoito P. vvax

Esquizonte P. vvax

Gametocitos P. vvax

CICLO DE INFECCION:

Forma marginal

Forma de anillo

Doble anillo

Forma de anillo

Trofozoito inmaduro

Trofozoito

Esquizonte joven

Esquizonte

Esquizonte maduro

Hembra

Macho

3. Trofozoito inmaduro:

Plasmodium Falciparum

4. Trofozoito maduro

Plasmodium Falciparum

6. Gametocito macho
Plasmodium Falciparum