MTODO DE REDUO DO RADICAL LIVRE DPPH

Atividade Antioxidante

Antioxidantes

Antioxidantes so comumente compreendidos como substncias capazes de inibir ou retardar substancialmente a extenso de um processo oxidativo. Antioxidantes biolgicos podem ser enzimticos (por exemplo, superxido dismutase, catalase, e glutationa peroxidase) e noenzimticos, tais como inibidores de enzimas oxidantes (por exemplo, ciclo-oxigenase) , cofatores de enzimas antioxidantes, sequestrantes de ROS / RNS, e agentes quelantes de metais de transio. No modo de ao, podemos classificar os antioxidantes como primrios (interrompem a reao em cadeia gerando um radical menos ativo ) e secundrio (ou preventivos).

Antioxidantes

Antioxidantes primrios: interrompem a fase de propagao de processos de formao radicais livres, temos os agentes captadores de radicais (sequestradores de radicais), tais como fenis, cuja estrutura, em geral, deve possuir duas caractersticas importantes: a presena de substituintes volumosos nas duas posies vizinhas ao grupo hidroxilo, e na posio para a presena de um grupo que contribui para a transferncia de localizao do eltron no emparelhado, como so BHT e o cido cafeico.

Antioxidantes

Antioxidantes secundrios: como os agentes quelantes, sequestradores de ctions metlicos que agem na decomposio do perxido de hidrognio a radical hidroxilo; evitando assim a formao desses ltimos. Neste grupo temos a penicilamina, o EDTA, e o pr-frmaco dexrazoxano.

Antioxidantes

Os cidos graxos, presentes nas membranas celulares, so facilmente oxidados tanto por peroxidao enzimtica como por autoxidao, devido as reaes em cadeia dos radicais livres. Estas reaes constam das seguintes etapas:

Antioxidantes

Uma sustncia retarda as aes de oxidao quando inibe a formao de radicais livres na etapa de iniciao (etapa I) ou quando interrompe a propagao (etapa II) da cadeia de radicais livres. Um dos estudos mais importantes sobre a ao dos antioxidantes postula que estes inibem a reao em cadeia atuando como doadores de hidrognio ou como aceptores de radicais livres, e conclui que o aceptor de radicais livres (antioxidante: AH) reage sobre todo com o radical ROO e no com os radicais livres R em uma reao denominada reao de inibio:

Antioxidantes

Sabe-se que os polifenis tm uma maior atividade antioxidante (anti-radicais) que monofenis. Para cidos por exemplo, o cido cafeico um composto mais eficaz anti-radicais do que o cido cumrico, o seu homlogo monofenol (ARP = 9,1 e 0,02 respectivamente).

cido cafeico

cido cumrico

Antioxidantes

O cido glico, um trifenol, mais eficiente do que o cido protocatecuico, sua contraparte difenol (ARP = 12,5 e 7,14 respectivamente). A posio destes segundo e terceiro grupos hidroxilo importante. Esses compostos cujo segundo hidroxilo grupo est na posio orto ou para tem uma maior atividade do que quando ela meta.

cido protocatecuico

cido glico

Antioxidantes

A eficincia do difenol orto e para, em parte, devido estabilizao do radical aryloxyl por ligao de hidrognio ou por regenerao de outro difenis.

Mtodo DPPH

O DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazila) um radical livre que pode ser obtido diretamente por dissoluo do reagente em meio orgnico. Quando em soluo o radical se comporta de maneira a doar o eltron que possui a mais, possuindo nessa forma (forma reduzida) uma colorao rosada (absoro na faixa de 515 517 nm). Aps doar o seu eltron (passando assim para a forma oxidada) assume uma colorao amarelada (absoro na faixa 565 - 590 nm).

Mtodo DPPH

Mtodo espectrofotomtrico: Para a avaliao da atividade captadora do radical livre DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazina),alquotas das amostras e padres foram diludas com etanol para se obter as concentraes de 2,5 a 200 g/mL. A 2,5mL de cada amostra foi acrescentado 1,0 mL de soluo etanlica do radical livre DPPH 0,243 mM. Como controle, foi utilizado 1,0 mL de soluo etanlica de DPPH 0,243 mM e 2,5 mL de etanol.

Mtodo DPPH

Mtodo espectrofotomtrico: Aps 30 minutos de incubao temperatura ambiente, ao abrigo da luz, a reduo do radical livre DPPH foi mensurada pela leitura da absorbncia em 517 nm, contra um branco especfico em cada avaliao, formado somente pelas amostras nas suas respectivas diluies. Substncias com atividade antioxidante j conhecidas como rutina, quercetina, cido ascrbico, ou extratos com atividade antioxidante como o de Gingko biloba so utilizados como padres de comparao.

Quercetina

Mtodo DPPH

Mtodo espectrofotomtrico:

Amostra Inicial

1 diluio

2 diluio

2,5 mL amostra 1 + 1 mL EtOH (BRANCO)

2,5 mL amostra 1 + 1 mL de DPPH (TESTE)

2,5 mL amostra 2 + 1 mL EtOH (BRANCO)

2,5 mL amostra 2 + 1 mL de DPPH (TESTE)

Mtodo DPPH

Para avaliar a atividade captadora de radical, foi obtida a porcentagem de inibio, conforme a equao:

(% AA : Porcentagem de atividade antioxidante; Am : Absorbncia da amostra; Ab : Absorbncia do branco; Acontrol : Absorbncia do reativo DPPH)

A relao (Am - Ab)/Acontrol nos indica o exceso de DPPH que no reagiu com os compostos antioxidantes presentes na amostra (amostra pura ou extrato).

Mtodo DPPH

A determinao da IC50, ou seja, concentrao da amostra ou padro que causa 50% de inibio da concentrao inicial de DPPH, obtida por progresso linear dos pontos plotados graficamente. Para a plotagem dos pontos, so utilizados os valores das mdias obtidas de triplicatas realizadas para cada um dos testes.
100.0 80.0 y = 1.1032x + 5.4228 R = 0.993

% AAO

60.0 Series1 Linear (Series1)

y = 1,1032x + 5,4228 50 = 1,1032. IC50 + 5,4228

IC50 = 40,410 g/mL

40.0

20.0

0.0 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 [ ] G/mL Extrato comercial de Gingko biloba

Mtodo DPPH

Vrios grupos de pesquisa tm utilizado protocolos amplamente variveis que diferem na concentrao de DPPH (22,5-250 M), tempo de incubao (5 min - 1 h), solvente de reao e pH da mistura reacional. Elevadas concentraes de DPPH na mistura reacional pode gerar absorbncias alm da preciso das medies espectrofotomtricas. Oxignio, luz, solvente e o pH da mistura de reao tambm afetar a absorbncia do DPPH.

Mtodo DPPH

Efeito do solvente: a polaridade do solvente, o coeficiente de absortividade , e a dissoluo do reagente no solvente bem como o ph do mesmo podem influir na cintica da reao e na absoro por parte dos reagentes.
A ordem de absorbncia mais elevada em soluo tamponada metanlica, seguida por solues metanlica e etanlica. Maior absoro em solues metanlicos implica melhor sensibilidade frente a soluo etanlica vis--vis de DPPH.

Mtodo DPPH

Efeito do solvente:
% AAO (Mdia) % AAO (Mdia)
100.00 y = 13.987x + 0.4563 R = 0.9994 % AAO (Mdia) Linear (% AAO (Mdia)) 80.00 60.00 40.00 20.00 0.00 0.00 % AAO (Mdia) Linear (% AAO (Mdia)) y = 17.835x - 0.0898 R = 0.9886

100.00 80.00 60.00 40.00 20.00 0.00 0.00

2.00

4.00

6.00

2.00

4.00

6.00

Quercetina em Metanol

Quercetina em etanol

Mtodo DPPH

Efeito do solvente:
% AAO (Mdia)
100.00 80.00 60.00 40.00 20.00 0.00 0.00 % AAO (Mdia) Linear (% AAO (Mdia)) y = 10.254x + 48.527 R = 0.7314

2.00

4.00

6.00

Quercetina em Metanol:gua (1:1)

Mtodo DPPH

Estudos demonstram que a velocidade de reao do DPPH com o antioxidante maior em solventes alcolicos do que em outros solventes orgnicos.

A proporo de solvente no meio importante, pois quanto maior a proporo de gua, menor a atividade antioxidante das amostras. A cintica de consumo de DPPH dependente do tipo de solvente e da concentrao de antioxidante presente na amostra.

Referncias

BRAND-WILLIAMS W., CUVELIER M. E., BERSET C. 1995. Use of a Free radical Method to Evaluate Antioxidant Activity. LWT Food Science and Thecnology 28: 25-30. MARIO C. FOTI, CARMELO DAQUINO, CORRADA GERACI. 2004. Electron-Transfer Reaction of Cinnamic Acids and Their Methyl Esters with the DPPH Radical in Alcoholic Solutions - J. Org. Chem. 69: 2309-2314. GRZEGORZ LITWINIENKO, K. U. INGOLD. 2003. Abnormal Solvent Effects on Hydrogen Atom Abstractions. 1. The Reactions of Phenols with 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (dpph ) in Alcohols - J. Org. Chem. 68: 3433-3438. OM P. SHARMA , TEJ K. BHAT. 2009. DPPH antioxidant assay revisited - Food Chemistry 113: 12021205.

Referncias

DEJIAN HUANG, BOXIN OU, RONALD L. PRIOR. 2005. The Chemistry behind Antioxidant Capacity Assays - J. Agric. Food Chem. 53: 1841-1856. GOLFER MUEDAS TAIPE, ADOLFO LA ROSA TORO GMEZA, JUANA ROBLES CAYCHOB. 2008. Evaluacin electroqumica de la actividad antioxidante del extracto alcohlico de la Bauhinia guianensis var. kuntiana Aubl. - Rev Soc Qum Per. 74 (4): 233246.