PRIMER CONGRESO DE LA ASOCIACIN URUGUAYA DE TCNICOS EN HEMOTERAPIA

SEGURIDAD VIRAL DE LOS DERIVADOS DEL PLASMA HUMANO

Mgter Mara Susana Vitali rea de Desarrollo de Productos y Procesos

DONACION VOLUNTARIA ALTRUISTA

HEMODERIVACION PRIMARIA HEMODERIVACION SECUNDARIA

BANCO DE SANGRE
(donante nico)

INDUSTRIA FARMACEUTICA
(ms de 1000 donantes)

MTODOS FSICOS
glbulos rojos, plasma, plaquetas, crioprecipitado

TECNOLOGIA DESARROLLADA
Albmina, Gammaglobulinas , factores de la coagulacin

CALIDAD DE LOS HEMODERIVADOS

EFICACIA TERAPEUTICA TOLERANCIA CLNICA SEGURIDAD BIOLGICA

HISTORIA DE TRANSMISION VIRAL

SEGURIDAD

30s: hepatitis aguda 40s: hepatitis srica 70s: hepatitis a virus B 80s: VIH 90s: hepatitis noA-noB,
hepatitis C

vacuna fiebre amarilla transfusin de sangre sangre y hemoderivados

sangre y hemoderivados

sangre y hemoderivados sangre y hemoderivados

00s: HTLV, VHA, PV B19

virus emergentes y reemergentes

VIRUS TRANSMISIBLES
VIRUS
VIH VHB VHC VHA PV B19 CMV HTLV I-II VHG TTV VHH8 CJDv OTROS

CELULAS
SI SI SI SI SI SI SI ?

PLASMA
SI SI SI SI SI

HEMODERIVADOS
SI SI SI SI SI

?
?

???????????

SEGURIDAD DE LOS HEMODERIVADOS

BANCO DE SANGRE Donantes voluntarios Seleccin del adecuada del donante

Control serolgico de cada unidad de sangre

INDUSTRIA FARMACEUTICA
Reanlisis serolgico Mtodos de purificacin (BPF y C) Mtodos de inactivacin viral Control por PCR en plasma y HD

INDUSTRIA FARMACUTICA
reanlisis serolgico

PLASMA

MTODOS DE PURIFICACION
Fracc. Alcohlico, Precipitacin qumica, Procesos cromatogrficos

(Fraccionamiento.Alcohlico, Precipitacin qumica, Procesos Cromatogrficos)

MTODOS DE INACTIVACION VIRAL

Mtodos fsicos y/o qumicos

TCNICAS DE PCR
ALBUMINA-GAMMAGLOBULINAS- FACT. COAGULACIN

SEGURIDAD HEMODERIVADOS MTODOS DE INACTIVACIN VIRAL ESPECFICOS

INACTIVACION VIRAL

- INACTIVAR LA MAYORIA DE LOS VIRUS ENVUELTOS Y NO ENVUELTOS

- NO MODIFICAR LA ESTRUCTURA O ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LA PROTEINA

- NO SER TOXICO, NO GENERAR NEOANTIGENOS - PERMITIR EL CONTROL Y REGISTRO ADECUADOS - PREVENIR LA CONTAMINACION CRUZADA

INACTIVACION VIRAL Principios

REPLICACION VIRAL ADHESION DEL VIRUS A LA CELULA VIA RECEPTOR PENETRACION DEL VIRUS A LA CELULA DESNUDAMIENTO DEL VIRUS, EXPOSICION DEL ANv REPLICACION DEL AN viral TRANSCRIPCION Y TRADUCCION DEL AN viral FORMACION DE NUEVAS PARTICULAS VIRALES LIBERACION AL ESPACIO EXTRACELULAR

INACTIVACION VIRAL
TRATAMIENTOS FSICOS

Trmicos

PASTEURIZACION en solucin (60C-10 h) CALENTAMIENTO SECO a 100C-30 liofilizado CALENTAMIENTO estado liofilizado con vapor CALENTAMIENTO estado liofilizado con solventes orgnicos RADIACIONES GAMMA NANOFILTRACION (mtodo de eliminacin)

TRATAMIENTOS QUMICOS

SOLVENTE /DETERGENTE (tri-n-butl fosfato/ tween 80- Tritn X100- 24C 6hs) ACIDOS GRASOS /CAPRILATO DE SODIO BETA PROPIOLACTONA/uv

INACTIVACION VIRAL VALIDACION Demostrar que el mtodo seleccionado es capaz de DISMINUIR LAS INFECTIVIDAD DE LOS VIRUS TRANSMISIBLES por el plasma VIRUS RELEVANTES: aquellos que poseen un medio celular donde detectar la infectividad de los virus transmisibles (VIH) VIRUS MODELO: aquellos que poseen caractersticas fsico-qumicas similares a los virus transmisibles (virus animales, BVDV, PVP, etc)

VIRUS MODELOS
VIRUS Ac. ENVOLTURA RESISTENCIA NUCLEICO RNA RNA RNA RNA DNA RNA RNA RNA RNA DNA DNA SI SI SI SI SI NO NO NO NO NO NO MEDIA BAJA BAJA BAJA MEDIA ALTA MEDIA MEDIA ALTA MUY ALTA MUY ALTA

VSV PARAINFL. VIH SINDBIS PSEUDOR. POLIO EMC REOVIRUS VHA SV40 PV can/por.

PASTEURIZACIN
60C- 10hs
1-Fraccin II de Cohn GAMMAGLOBULINAS POLIESPECFICAS IM Y EV GAMMAGLOBULINAS ESPECFICAS (Antitetnica- Anti-Rh- AntiHBs)

2-Fraccin IV de Cohn ANTITROMBINA III

1 Inactivacin viral

SOLVENTE / DETERGENTE
FACTOR VIII COMPLEJO PROTROMBNICO
2 Inactivacin viral

CALENTAMIENTO TRMICO
100C - 30 minutos

Gammaglobulina y ATIII
Virus Objetivo Virus modelo Virus envueltos GG / ATIII VIH VHC/VHG VHB VIH VDVB VHS-1 >5.0 / 5.2 >6.0 / 4.5 >5.7/ 4.4 FR (log)

Virus no envueltos
PB19 VHA PVP Polio-2 >4.0 / 4.1 >6.5 / 4.4

VDVB (virus diarrea bovina VHS (virus herpes simple) PVP(parvovirus porcino)

CINETICA DE INACTIVACION

Virus de la Estomatitis Vesicular

7 8 7 6 6

Virus Polio-2

Ttulo Viral (log)

5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10

Ttulo Viral (log)

0 0 2 4 6 8 10

Tiempo (h) Lmite de deteccin VSV

Tiempo (h) Lmite de deteccin Polio-2

FACTOR VIII
Virus 1-Solvente/ detergente 2-Calor seco 100C - 30 FR (log) 1+2

Virus envueltos VIH VDVB VHB >5.2 >4.3 >5.0 >4.0 >4.5 >4.1 Virus no envueltos PVB VEB nd nd >4.5 >5.0 >4.5 >5.0 >9.2 >8.8 >9.1

nd: no determinado VDVB (virus diarrea bovina VHB (virus herpes bovino) VEB enterovirus bovino

SOLVENTE/DETERGENTE
Efecto del detergente

Inactivation of BVDV (VSV)

6
virus titer [log10TCID 50/mL]

5 4 3 2 1 0 0 60 120 180 240 300 360 time [min]

0.3% TNBP/0.2% NaDoc 0,3% TNBP/1% Triton X-100 0,3%TNBP/1,0% Tween 80 0,3%TNBP/1,0% Tween 80 (VSV)

Estudio PEI

Faccionamiento alcohlico
Ethanol Fractionation
cryo poor plasma
precipitate I (Cohn-Fraktion I) supernatant I

Mltiples efectos Particin por ppt, adsorcin ayuda filtros Inactivacin por etanol

Eliminacin y/o inactivacin

precipitate II/III (Cohn-Fraktion II/III) supernatant II/III

incompleta(1- 5 log10) Escalado a nivel laboratorio es difcil de lograr

precipitate III (Cohn-Fraktion III)

supernatant III

precipitate II (Immunglobulin)

supernatant II

Parmetros crticos Concentracin de etanol Temperatura, agitacin PEI Condiciones de filtracin Condiciones de centrifugac.

Cromatografa
Elimina virus envueltos y no envueltos Eliminacin limitada entre 1-4 log10 Eliminacin variable segn el virus que se trate Eliminacin depende capacidad del gel (uso)

Para evitar contaminacin cruzada, correcta sanitizacin

Factores crticos:Tamao de la columna, tipo de gel o matriz, velocidad de
flujo, presin, conductividad, composicin de la solucin de elucin

NANOFILTRACIN
Virus HIV HCV HBV HAV
Parvovirus B19

Tamao (nm) 80-130 40-50 40-45 28-30 18-26

Tamao de poro

Producto
Fibrinogeno F VIII

50nm 35nm 15-20 nm

IgG F IX

Aplicacin depende del tamao de la protena a filtrar

Condiciones controladas y evitar la agregacin de los virus
Factores crticos: Presin, velocidad y tiempo de flujo, carga viral a filtrar, composicin de la protena, concentracin, fuerza inica y temperatura filtracin

CALIDAD DE MATERIA PRIMA

CALIDAD DE LOS HEMODERIVADOS

FACTORES DE RIESGO
ERRORES HUMANOS Y DE LABORATORIO

-Problemas en el sistema anlisis/equipos/GLP

-Sensibilidad insuficiente de las tcnicas de control -Entrenamiento tcnico deficiente
SEROCONVERSIONES ATPICAS VARIANTES VIRALES

CAMBIOS EPIDEMIOLGICOS
PERODO de ventana serolgico

HEMODERIVADOS
ALTO RIESGO F I: Fb, VIII, IX y X BAJO RIESGO F II: Igs F IV y V: SPP F V: ASH

RECATEGORIZACION
HISTORIA DE USO LARGA ASH - SPP - IgG CORTA

F VIII, IX, CP

PCR/VHC

en pooles de plasma para la produccin de hemoderivados

IMPLEMENTACION DE NAT
1994
FDA: CPMP/ICH: Transmisin del VHC por Gammaglobulina No inactivada viralmente (PCR/VHC +) PCR en productos sin IV SOGAT/Validacin de PCR/VHC

CPMP/UE: PCR/VHC Julio 1999 WHO/NIBSC: 100 UI/ml (SI/VHC) PEI: FDA/CBER: PCR/VHC (Bco de Sgre- DI 5000 UI/ml) PCR/VHC y VIH /B. Sgre/ HD/100 UI/ml

WHO/NIBSC: SI VIH, VHB, B19, Multiplex. WR FE: PCR/B19 pooles de plasma para produccin de anti-Rh, sensibilidad 10.000 UI/ml
CPMP: Co. de Productores. de Medicamentos de la CE- Sogat: Grupo de Trabajo. sobre la PCR CBER: Ctro de evaluacin de biolgicos e Investigacin. NIBSC: Instituto Nacional de control y de estandares biolgicos

Perodo ventana para VHC

PCR-RNA
ALT ELISA-3 ELISA-2 ELISA-1 0 20 40

23
53 70 82 98

75
45 28 16

>50 das

60

80

100

120

Ventana (das)

Acortamiento

DESARROLLO PCR
FORMAR RRHH EN Biologa Molecular INVERSIONES EN EQUIPAMIENTO DISEO DE AREAS EXCLUSIVAS DE TRABAJO DESARROLLO O DISEO DE UN MTODO DE PCR COSTO/BENEFICIO mtodo Automatizados vs in house OPTIMIZACIN EVALUACIN DE LA SENSIBILIDAD

VALIDACIN SEGN REQUERIMIENTOS REGULATORIOS

IMPLEMENTACIN Y LOGSTICA DE TRABAJO

OPTIMIZACION DE PCR
Controles: diluciones de plasmas positivos (100/1000 UI/ml) plasmas con diferentes genotipos, CN Validez de PCR: ausencia de amplificacin del C(+) o CI contaminaciones cruzadas (PP/C (-)

Ensayos de recuperacin , control de inhibidores

P500 (+) anlisis por duplicado, y apertura de P100

Controles de amplificacin (ADNc) , PCR y Nested

VALIDACIN in house
ESPECIFICIDAD
Se analizaron 100 pooles de plasma negativos para en ARN/VHC analizados en el laboratorio y pooles de plasma analizados y caracterizados por otra institucin

ROBUSTEZ
Variaciones en la concentracin de reactivos, utilizando equipos diferentes (termocicladores) y distintos operadores, en das distintos utilizando diluciones del SI a una concentracin prxima al valor del cut off. Ausencia de contaminacin cruzada alternando muestras de plasmas negativas y positivas alternadas bajo estricto cuidados durante la ejecucin del anlisis.

Plasma PCR/VHC (+) (663.876 UI/ml Amplicor HCV Monitor, Roche) Plasma analizado contra el SI: 554.452 UI/ml Potencia relativa: dilucin 10E-04 101.587,13 (60.751,26- 166.232,66)

STANDARD SECUNDARIO

ALGORITMO DE CONTROL
POOL DE PLASMA DE PRODUCCION 5000 donantes 100 UI/ml)

MAXI-POOLES (500 unidades)

500

500

500

500 +

500

Mini pooles (100 unidades)

100

100 +

100

100

100

Midi pooles (50/25 unidades)

50 +

50

25

25 +

25 unidades individuales

unidad positiva (+)

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD
POEs: POE minipooles, conservacin, prevencin de contaminaciones cruzadas,
preparaciones de referencia, equipos, controles, evaluaciones estadsticas).

VALIDACIN de la PCR y de los equipos (gua ICH de validacin) REACTIVOS: registro de todos los reactivos utilizados (T, Nlote,fecha) CONTROLES:
Control positivo, que posee una concentracin equivalente a 3 veces el cut- off Control de corrida o working reagent NIBSC/WHO y controles internos (referencias secundarias) evaluados frente al SI. Control negativo, ausencia de ARN/VHC

CONTROLES DE CALIDAD EXTERNOS: participacin en programas de calidad nacional y/o internacional CALIFICACIN DEL PERSONAL: capacitacin y validacin trabajo realizado

CONTROL DE CALIDAD EXTERNO

Instituto Superior de la Sanidad de Italia
1-External Quality Assesment (EQA/3) Vox Sang 82: 211 (2002)
Control de la eficiencia en la deteccin RNA/VHC por NAT, de las productoras de hemoderivados, laboratorios de equipos diagnsticos y bancos de sangre.

2-External Quality Assesment (EQA/4) Vox Sang 85: 114 (2003)

Control de la eficiencia en la deteccin de los 6 genotipos principales del VHC por NAT.

3-External Quality Assesment (EQA/5) Vox Sang 87: 91 (2004)

Control de la eficiencia en la deteccin RNA/VHC, VIH por NAT, de las productoras de hemoderivados, laboratorios de equipos diagnsticos y bancos de sangre.

CONTROL DE CALIDAD EXTERNOS Proficiency testing study of European Directorate for the quality of medicines (EDQM)
PTS: determinacin de VHC en pool de plasma (2005-2008) MUESTRAS
20 viales con muestras duplicadas negativas y positivas con genotipos VHC 1, 3a, 4a, 6a con 100, 32, 20, 10 UI/ml

25 LABORATORIOS PARTICIPANTES

15 OMCLs (autoridades de control), 10 productores de HD

RESULTADOS

Satisfactorio para todos los genotipos y con excelente sensibilidad para el genotipo 3a

PCR/B19

en pooles de plasma para la produccin de gammaglobulina anti-Rh

Detection of B19 DNA in Plasma Pools

(PEI Study)
30

% PCR-positive Pools

25

20

15

10

< 10

10 -10

10 -10

10 -10

106-107

107-108

>108

Range B19-DNA [geq/mL]

222 of 372 pools B19-DNA positive

Schmidt et al. 2001. Vox Sang. 81:228-235

PARVOVIRUS B 19
FE: requiere sensibilidad de 10.000 UI/ml en pool de plasma (anti-Rh) Mtodo semicuantitativo in house Acido Nucleico es tipo ADN

SENSIBILIDAD
282 pb PCR - 101 pb Nested

< 3000 UI/ml

ANALISIS DE POOLES
P 100 unidades P 50 unidades P 25 unidades

UNIDAD POSITIVA

CONTROL DE CALIDAD EXTERNO

B19 (2005-2008)

Proficiency testing study of European Directorate for the quality of medicines (EDQM)
PTS 064: determinacin de Parvovirus B19 en pool de plasma
MUESTRAS
1 viales 107, 2 con 105 , 1 con 104 , 2 con 103 y 1 con 102 UI/ml 1 vial con A6 (106) y muestras negativas

22 LABORATORIOS PARTICIPANTES TCNICAS

10 OMCLs (autoridades de control), 12 productores de HD

2 in house, otros automatizados y real time

RESULTADOS

Satisfactorio para todas las concentraciones y deteccin de la variante A6

VIRUS EMERGENTES
Enfermedades Infecciosas Emergentes
EIE a cualquier enfermedades (latente) que en las dos ltimas dcadas haya incrementado su incidencia en humanos: viruela, dengue y nuevas como SARS y HHV-8
CATEGORIA 1:
WNV)

ETT con prevalencia y/o incidencia significativa de casos documentados factor pnico pblico alto o bajo a la enfermedad (Chagas, HTLV I/II, VHC ,

CATEGORIA 2: CATEGORIA 3:

ETT con prevalencia y/o incidencia baja de casos documentados factor pnico pblico alto o bajo a la enfermedad (HHV8, B19, Dengue, vCJV) ETT casos no documentados de transmisin factor pnico pblico alto a la enfermedad

(Sars- WNV)

Profesionales de la medicina transfusional deben estar en

ESTADO VIGILANTE

para poder monitorear un agente emergente.

ENFERMEDADES EMERGENTES/REEMERGENTES
Guerra ganada contra ENFERMEDADES INFECCIOSAS (Viruela,

Lepra, Polio) Guerra sigue pendientes: 15-25 mill pers/ao mueren enfermedades infecciosas (prematuros y nios)

Enfermedades reemergentes (enfermedades nuevas que atacan nuevamente): tuberculosis, dengue, clera, paludismo, difteria, meningitis meningocccica, fiebre amarilla Enfermedades emergentes: SIDA, hepatitis C y E, CJD, fiebre hemorrgica Ebola, legionelosis, criptosporidiasis, OMS Cul es el freno ???

DETECCIN RPIDA + REACCIN INMEDIATA =

Resultado complejo

ENFERMEDADES EMERGENTES/REEMERGENTES
OMS propone: - Mejorar la infraestructura y los sistema de salud pblica - Fomentar la formacin de tcnicos en epidemiologa - Formar tcnicos en brotes y epidemias - Procurar que los gobiernos reaccionen con la diligencia necesaria para contener brotes y epidemias

- En lo posible intensificar las vacunaciones

BIOSEGURIDAD
PCR

RIESGO 0 ??

CONTROL ARNv

MTODOS DE INACTIVACIN VIRAL

CONTROL MARCADORES VIRALES

>2000

VIRUS EMERGENTES Otros ???......

1990/2000

VHC - CJDv

1980/1990 PLASMA HUMANO

Virus del SIDA/ hepatitis NA NB

IMPACTO DE LA INACTIVACION VIRAL VIRUS ENVUELTOS

VIRUS DESNUDOS

HEMOFILICOS

VHB (1970) Coinfecc/VHC

(1980-vacunados)

VHA (Leve, ms agresiva

pac.VIH)

VIH (1985) Inact Viral VHC (preval. Acs elevada) Vacunacin ???

PV B19 (elevada prevalencia,

crtico en pac.VIH) Vacunacin??? UN PROBLEMA RESUELTO ??

BANCO DE SANGRE
Donantes voluntarios Seleccin del donante Control serolgico

INDUSTRIA FARMACUTICA
Reanlisis serolgico BPFC mtodos de purificacin Mtodos de inactivacin viral/ NAT

USO TERAPUTICO Anlisis previo de cada caso particular

AUTOSUFICIENCIA

PASADO
marcadores serolgicos virales mtodos de inactivacin viral

PRESENTE
marcadores serolgicos virales mtodos de inactivacin viral NAT/VHC/VIH NAT/VHB ? NAT/B19

FUTURO
marcadores serolgicos virales mtodos de inactivacin viral NAT/VHC/VIH NAT/VHB/B19 NAT/ mltiples
inmunoPCR DNA chip

GRACIAS !!!
Mara Susana Vitali

Magister en Ciencias Qumicas rea de Desarrollo de Productos y Procesos UNC-HEMODERIVADOS svitali@hemo.unc.edu.ar