BANCO DE SANGRE
(donante nico)
INDUSTRIA FARMACEUTICA
(ms de 1000 donantes)
MTODOS FSICOS
glbulos rojos, plasma, plaquetas, crioprecipitado
TECNOLOGIA DESARROLLADA
Albmina, Gammaglobulinas , factores de la coagulacin
SEGURIDAD
30s: hepatitis aguda 40s: hepatitis srica 70s: hepatitis a virus B 80s: VIH 90s: hepatitis noA-noB,
hepatitis C
sangre y hemoderivados
VIRUS TRANSMISIBLES
VIRUS
VIH VHB VHC VHA PV B19 CMV HTLV I-II VHG TTV VHH8 CJDv OTROS
CELULAS
SI SI SI SI SI SI SI ?
PLASMA
SI SI SI SI SI
HEMODERIVADOS
SI SI SI SI SI
?
?
???????????
INDUSTRIA FARMACEUTICA
Reanlisis serolgico Mtodos de purificacin (BPF y C) Mtodos de inactivacin viral Control por PCR en plasma y HD
INDUSTRIA FARMACUTICA
reanlisis serolgico
PLASMA
MTODOS DE PURIFICACION
Fracc. Alcohlico, Precipitacin qumica, Procesos cromatogrficos
TCNICAS DE PCR
ALBUMINA-GAMMAGLOBULINAS- FACT. COAGULACIN
INACTIVACION VIRAL
INACTIVACION VIRAL
TRATAMIENTOS FSICOS
Trmicos
PASTEURIZACION en solucin (60C-10 h) CALENTAMIENTO SECO a 100C-30 liofilizado CALENTAMIENTO estado liofilizado con vapor CALENTAMIENTO estado liofilizado con solventes orgnicos RADIACIONES GAMMA NANOFILTRACION (mtodo de eliminacin)
TRATAMIENTOS QUMICOS
SOLVENTE /DETERGENTE (tri-n-butl fosfato/ tween 80- Tritn X100- 24C 6hs) ACIDOS GRASOS /CAPRILATO DE SODIO BETA PROPIOLACTONA/uv
INACTIVACION VIRAL VALIDACION Demostrar que el mtodo seleccionado es capaz de DISMINUIR LAS INFECTIVIDAD DE LOS VIRUS TRANSMISIBLES por el plasma VIRUS RELEVANTES: aquellos que poseen un medio celular donde detectar la infectividad de los virus transmisibles (VIH) VIRUS MODELO: aquellos que poseen caractersticas fsico-qumicas similares a los virus transmisibles (virus animales, BVDV, PVP, etc)
VIRUS MODELOS
VIRUS Ac. ENVOLTURA RESISTENCIA NUCLEICO RNA RNA RNA RNA DNA RNA RNA RNA RNA DNA DNA SI SI SI SI SI NO NO NO NO NO NO MEDIA BAJA BAJA BAJA MEDIA ALTA MEDIA MEDIA ALTA MUY ALTA MUY ALTA
VSV PARAINFL. VIH SINDBIS PSEUDOR. POLIO EMC REOVIRUS VHA SV40 PV can/por.
PASTEURIZACIN
60C- 10hs
1-Fraccin II de Cohn GAMMAGLOBULINAS POLIESPECFICAS IM Y EV GAMMAGLOBULINAS ESPECFICAS (Antitetnica- Anti-Rh- AntiHBs)
1 Inactivacin viral
SOLVENTE / DETERGENTE
FACTOR VIII COMPLEJO PROTROMBNICO
2 Inactivacin viral
CALENTAMIENTO TRMICO
100C - 30 minutos
Gammaglobulina y ATIII
Virus Objetivo Virus modelo Virus envueltos GG / ATIII VIH VHC/VHG VHB VIH VDVB VHS-1 >5.0 / 5.2 >6.0 / 4.5 >5.7/ 4.4 FR (log)
Virus no envueltos
PB19 VHA PVP Polio-2 >4.0 / 4.1 >6.5 / 4.4
VDVB (virus diarrea bovina VHS (virus herpes simple) PVP(parvovirus porcino)
CINETICA DE INACTIVACION
Virus Polio-2
5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10
0 0 2 4 6 8 10
FACTOR VIII
Virus 1-Solvente/ detergente 2-Calor seco 100C - 30 FR (log) 1+2
Virus envueltos VIH VDVB VHB >5.2 >4.3 >5.0 >4.0 >4.5 >4.1 Virus no envueltos PVB VEB nd nd >4.5 >5.0 >4.5 >5.0 >9.2 >8.8 >9.1
nd: no determinado VDVB (virus diarrea bovina VHB (virus herpes bovino) VEB enterovirus bovino
SOLVENTE/DETERGENTE
Efecto del detergente
0.3% TNBP/0.2% NaDoc 0,3% TNBP/1% Triton X-100 0,3%TNBP/1,0% Tween 80 0,3%TNBP/1,0% Tween 80 (VSV)
Estudio PEI
Faccionamiento alcohlico
Ethanol Fractionation
cryo poor plasma
precipitate I (Cohn-Fraktion I) supernatant I
Mltiples efectos Particin por ppt, adsorcin ayuda filtros Inactivacin por etanol
supernatant III
precipitate II (Immunglobulin)
supernatant II
Parmetros crticos Concentracin de etanol Temperatura, agitacin PEI Condiciones de filtracin Condiciones de centrifugac.
Cromatografa
Elimina virus envueltos y no envueltos Eliminacin limitada entre 1-4 log10 Eliminacin variable segn el virus que se trate Eliminacin depende capacidad del gel (uso)
NANOFILTRACIN
Virus HIV HCV HBV HAV
Parvovirus B19
Tamao de poro
Producto
Fibrinogeno F VIII
IgG F IX
FACTORES DE RIESGO
ERRORES HUMANOS Y DE LABORATORIO
CAMBIOS EPIDEMIOLGICOS
PERODO de ventana serolgico
HEMODERIVADOS
ALTO RIESGO F I: Fb, VIII, IX y X BAJO RIESGO F II: Igs F IV y V: SPP F V: ASH
RECATEGORIZACION
HISTORIA DE USO LARGA ASH - SPP - IgG CORTA
F VIII, IX, CP
PCR/VHC
IMPLEMENTACION DE NAT
1994
FDA: CPMP/ICH: Transmisin del VHC por Gammaglobulina No inactivada viralmente (PCR/VHC +) PCR en productos sin IV SOGAT/Validacin de PCR/VHC
CPMP/UE: PCR/VHC Julio 1999 WHO/NIBSC: 100 UI/ml (SI/VHC) PEI: FDA/CBER: PCR/VHC (Bco de Sgre- DI 5000 UI/ml) PCR/VHC y VIH /B. Sgre/ HD/100 UI/ml
WHO/NIBSC: SI VIH, VHB, B19, Multiplex. WR FE: PCR/B19 pooles de plasma para produccin de anti-Rh, sensibilidad 10.000 UI/ml
CPMP: Co. de Productores. de Medicamentos de la CE- Sogat: Grupo de Trabajo. sobre la PCR CBER: Ctro de evaluacin de biolgicos e Investigacin. NIBSC: Instituto Nacional de control y de estandares biolgicos
23
53 70 82 98
75
45 28 16
>50 das
60
80
100
120
Ventana (das)
Acortamiento
DESARROLLO PCR
FORMAR RRHH EN Biologa Molecular INVERSIONES EN EQUIPAMIENTO DISEO DE AREAS EXCLUSIVAS DE TRABAJO DESARROLLO O DISEO DE UN MTODO DE PCR COSTO/BENEFICIO mtodo Automatizados vs in house OPTIMIZACIN EVALUACIN DE LA SENSIBILIDAD
OPTIMIZACION DE PCR
Controles: diluciones de plasmas positivos (100/1000 UI/ml) plasmas con diferentes genotipos, CN Validez de PCR: ausencia de amplificacin del C(+) o CI contaminaciones cruzadas (PP/C (-)
VALIDACIN in house
ESPECIFICIDAD
Se analizaron 100 pooles de plasma negativos para en ARN/VHC analizados en el laboratorio y pooles de plasma analizados y caracterizados por otra institucin
ROBUSTEZ
Variaciones en la concentracin de reactivos, utilizando equipos diferentes (termocicladores) y distintos operadores, en das distintos utilizando diluciones del SI a una concentracin prxima al valor del cut off. Ausencia de contaminacin cruzada alternando muestras de plasmas negativas y positivas alternadas bajo estricto cuidados durante la ejecucin del anlisis.
Plasma PCR/VHC (+) (663.876 UI/ml Amplicor HCV Monitor, Roche) Plasma analizado contra el SI: 554.452 UI/ml Potencia relativa: dilucin 10E-04 101.587,13 (60.751,26- 166.232,66)
STANDARD SECUNDARIO
ALGORITMO DE CONTROL
POOL DE PLASMA DE PRODUCCION 5000 donantes 100 UI/ml)
500
500
500
500 +
500
100
100 +
100
100
100
50 +
50
25
25 +
25 unidades individuales
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD
POEs: POE minipooles, conservacin, prevencin de contaminaciones cruzadas,
preparaciones de referencia, equipos, controles, evaluaciones estadsticas).
VALIDACIN de la PCR y de los equipos (gua ICH de validacin) REACTIVOS: registro de todos los reactivos utilizados (T, Nlote,fecha) CONTROLES:
Control positivo, que posee una concentracin equivalente a 3 veces el cut- off Control de corrida o working reagent NIBSC/WHO y controles internos (referencias secundarias) evaluados frente al SI. Control negativo, ausencia de ARN/VHC
CONTROLES DE CALIDAD EXTERNOS: participacin en programas de calidad nacional y/o internacional CALIFICACIN DEL PERSONAL: capacitacin y validacin trabajo realizado
CONTROL DE CALIDAD EXTERNOS Proficiency testing study of European Directorate for the quality of medicines (EDQM)
PTS: determinacin de VHC en pool de plasma (2005-2008) MUESTRAS
20 viales con muestras duplicadas negativas y positivas con genotipos VHC 1, 3a, 4a, 6a con 100, 32, 20, 10 UI/ml
25 LABORATORIOS PARTICIPANTES
RESULTADOS
Satisfactorio para todos los genotipos y con excelente sensibilidad para el genotipo 3a
PCR/B19
% PCR-positive Pools
25
20
15
10
< 10
10 -10
10 -10
10 -10
106-107
107-108
>108
PARVOVIRUS B 19
FE: requiere sensibilidad de 10.000 UI/ml en pool de plasma (anti-Rh) Mtodo semicuantitativo in house Acido Nucleico es tipo ADN
SENSIBILIDAD
282 pb PCR - 101 pb Nested
ANALISIS DE POOLES
P 100 unidades P 50 unidades P 25 unidades
UNIDAD POSITIVA
Proficiency testing study of European Directorate for the quality of medicines (EDQM)
PTS 064: determinacin de Parvovirus B19 en pool de plasma
MUESTRAS
1 viales 107, 2 con 105 , 1 con 104 , 2 con 103 y 1 con 102 UI/ml 1 vial con A6 (106) y muestras negativas
RESULTADOS
VIRUS EMERGENTES
Enfermedades Infecciosas Emergentes
EIE a cualquier enfermedades (latente) que en las dos ltimas dcadas haya incrementado su incidencia en humanos: viruela, dengue y nuevas como SARS y HHV-8
CATEGORIA 1:
WNV)
ETT con prevalencia y/o incidencia significativa de casos documentados factor pnico pblico alto o bajo a la enfermedad (Chagas, HTLV I/II, VHC ,
CATEGORIA 2: CATEGORIA 3:
ETT con prevalencia y/o incidencia baja de casos documentados factor pnico pblico alto o bajo a la enfermedad (HHV8, B19, Dengue, vCJV) ETT casos no documentados de transmisin factor pnico pblico alto a la enfermedad
(Sars- WNV)
ESTADO VIGILANTE
ENFERMEDADES EMERGENTES/REEMERGENTES
Guerra ganada contra ENFERMEDADES INFECCIOSAS (Viruela,
Lepra, Polio) Guerra sigue pendientes: 15-25 mill pers/ao mueren enfermedades infecciosas (prematuros y nios)
Enfermedades reemergentes (enfermedades nuevas que atacan nuevamente): tuberculosis, dengue, clera, paludismo, difteria, meningitis meningocccica, fiebre amarilla Enfermedades emergentes: SIDA, hepatitis C y E, CJD, fiebre hemorrgica Ebola, legionelosis, criptosporidiasis, OMS Cul es el freno ???
ENFERMEDADES EMERGENTES/REEMERGENTES
OMS propone: - Mejorar la infraestructura y los sistema de salud pblica - Fomentar la formacin de tcnicos en epidemiologa - Formar tcnicos en brotes y epidemias - Procurar que los gobiernos reaccionen con la diligencia necesaria para contener brotes y epidemias
BIOSEGURIDAD
PCR
RIESGO 0 ??
CONTROL ARNv
>2000
1990/2000
VHC - CJDv
VIRUS DESNUDOS
HEMOFILICOS
VIH (1985) Inact Viral VHC (preval. Acs elevada) Vacunacin ???
BANCO DE SANGRE
Donantes voluntarios Seleccin del donante Control serolgico
INDUSTRIA FARMACUTICA
Reanlisis serolgico BPFC mtodos de purificacin Mtodos de inactivacin viral/ NAT
AUTOSUFICIENCIA
PASADO
marcadores serolgicos virales mtodos de inactivacin viral
PRESENTE
marcadores serolgicos virales mtodos de inactivacin viral NAT/VHC/VIH NAT/VHB ? NAT/B19
FUTURO
marcadores serolgicos virales mtodos de inactivacin viral NAT/VHC/VIH NAT/VHB/B19 NAT/ mltiples
inmunoPCR DNA chip
GRACIAS !!!
Mara Susana Vitali