BIOMARCADORES

de contaminao de ambientes aquticos

em Hoplias malabaricus
Grupo multidisciplinar da UFPR (SCB),
em estudos e pesquisas com biomarcadores de
contaminao ambiental:

dep Biologia Celular - Labo Toxicologia Celular
dep Farmacologia - Labo Toxicologia Ambiental
dep Gentica - Labo Citogentica Animal
dep Fisiologia
- Labo Fisiologia Comparativa da Osmoregulao


dep Biologia Celular - Labo Bioensaios
BIOMARCADOR

ALTERAO MENSURVEL OU OBSERVVEL DE UMA
RESPOSTA BIOLGICA (EFEITO) RELACIONADA
EXPOSIO DE UM ORGANISMO (CAUSA)
A AGENTES EXGENOS OU XENOBIONTES.

PARMETRO MORFOLGICO OU FISIOLGICO ALTERADO
POUCA
RELEVNCIA
ECOLGICA
GRANDE
RELEVNCIA
ECOLGICA
RESPOSTA A
LONGO PRAZO
RESPOSTA A
CURTO PRAZO
parmetros
bioqumicos
enzimas de
desintoxicao
parmetros
imunolgicos
parmetros
histopatolgicos
condies
bioenergticas
populaes &
comunidades
capacidade
reprodutiva
parmetros
fisiolgicos
ADAMS et alii, 1989
SISTEMA HEPTICO
(HEPATCITO)

Expresso de METALOTIONENA
indut.: metais, EsROx e ESxH
tolerncia a EsROx, p.ex.:H
2
O
2

atividade antioxidante



HOMEOSTASE OXIDATIVA
tolerncia a EsROx
atividade antioxidante:
SOD, CATALASES,
peroxidases, GSHp
GSH S-t, GSHr
[GSH]


Expresso de P450
uso de EsROx em oxidaes
l catabolismo (MFOS):
oxidao de esterides
l ativ. monoxigenases associadas
p.ex.: EROD


Expresso de VITELOGENINA
regulada por 17|-Estradiol

xenobionte com:
ativ. estrognica
(machos e jovens)
ativ. anti-estrognica
(fmeas)

HOMEOSTASE DE Zn
&
ATIVIDADE DE METALOENZIMAS
SISTEMA REPRODUTOR
NEUROENDCRINO

CREBRO

HIPOTLAMO
GtRH (+) / DPM ()

HIPFISE
GtH I & GtH II (+)
e outros (+/)

TESTCULO/OVRIO
ESxH e outros fatores
dimorfismo sexual
gametognese (Zn)
incorpora VT (GtH I)

o-ALAd

inibio :
ANEMIA
PORFIRIA

l [ pre-HEME ]
[ HEME ]
l [ o-ALA ]

ESTRESSE
OXIDATIVO
dC
B
/ d
t
= [k
w
C
w
+ k
F
C
F
] - [k
EXC
+ k
MET
]C
B

C concentrao
k taxas constantes
no equilbrio

adaptado de van der OOST et alii, 2003
BIOACUMULAO em ORGANISMO AQUTICO
BIOCONCENTRAO
BIOMAGNIFICAO
DISTRIBUIO DE XENOBIONTES
EM COMPARTIMENTOS ECOSSISTMICOS AQUTICOS
21 g Pb
++
.g
-1
ww . 120 h
-1
HEPATCITOS
DE TRARA
MICROSCOPIA
ELETRNICA DE
TRANSMISSO
RESULTADOS
biomarcadores
morfolgicos
Pb
++

40 DIAS
8 doses
21 g Pb
++
.g
-1
ww . 120 h
-1
21 g Pb
++
.g
-1
ww . 120 h
-1
0,3 g TBT .g
-1
ww. 120 h
-1
21 g Pb
++
.g
-1
biomassa . 120 h
-1
0,3 g TBT .g
-1
biomassa . 120 h
-1
IO
D -
1
2
3
4
5
6
7
8
Pb I
Pb II control II
group
With Control
Dunnett's
0,05
Densidade ptica Integrada: [DNA]
MICROSCOPIA DE LUZ
IMPRINT
REAO DE FELGEN
8 doses 4 doses
21 g Pb
++
.g
-1
ww . 120 h
-1
Significantly higher than control C (p<0.05)
Significantly higher than control C (p<0.05)
T
Significantly higher than treatment A (p<0.05)
N = 4 Normal metaphase
plates
Mean (SD)
Altered metaphase
plates
Mean (SD)
Altered plates
(%)
Control C 202 (4.6) 2.3 (1.7) 1.1
Treatment A
(18 days, 4 doses)
122.3 (38.8) 42 (14.6) 25.6
Treatment B
(41 days, 8 doses)
135.6 (39.1) 31.6 (9.1)
T
19.1
Genetic damages induced by trophic doses of lead evaluated by
comet assay and chromosomal aberrations in the neotropical
fish Hoplias malabaricus (Characiformes, Erythrinidae)

M. Margarete CESTARI; Priscilla Maria M. LEMOS; Ciro Alberto de OLIVEIRA RIBEIRO;
Joo Ricardo M. ALVES COSTA; Emilien PELLETIER; Marcos V. M. FERRARO;

Mrio Srgio MANTOVANI; Alberto Sergio FENOCCHIO.
MUTATION RESEARCH
21 g Pb
++
.g
-1
ww . 120 h
-1
13 doses; 63 days; X= mean; Pb = lead; NC = negative control
P value < 0,0001, highly significant
Number of cells Classes
Treatments
Analyzed Tailed cells 0 1 2 3
Scores _2
NC 100 16 84 16 0 0 16
NC 100 06 94 5 0 1 8
NC 100 23 77 22 1 0 24
TOTAL 300 45 255 43 1 1 X = 16
15,0
%
85,0
%
14,3
%
00,3
%
00,3
%
Pb 100 17 83 16 0 3 19
Pb 100 66 34 50 16 0 82
Pb 100 58 42 48 8 2 66
Pb 100 15 85 13 4 0 17
Pb 100 56 44 42 10 4 74
Pb 100 54 46 54 0 0 54
TOTAL 600 266 334 223 38 9 X = 52 74,80
44,3
%
55,7
%
37,2
%
06,3
%
01,5
%
21 g Pb
++
.g
-1
ww . 120 h
-1
NEUROTOXICIDADE PS-SINPTICA
receptor nicotnico:
canal de Na
+
transmembrana
Na
+

Na
+

AChE ACh
NEUROTOXICIDADE PS-SINPTICA
receptor nicotnico:
canal de Na
+
transmembrana
ACh
Na
+

Na
+

AChE
Na
+

NEUROTOXICIDADE PS-SINPTICA
receptor nicotnico:
canal de Na
+
transmembrana
ACh
Na
+

Na
+

Pb-S-
-SH + DTNB COR AMARELA
RESULTADOS
atividade das ChEs
Atividade colinestersica com msculo axial de Hoplias malabaricus
exposio SUBCRNICA por VIA TRFICA:
21 g Pb
++
.g
-1
biomassa . 120 h
-1

n = 3 por grupo
4 doses: 18 dias de exposio
8 doses: 41 dias de exposio
controles 4 doses 8 doses
0
5 0
1 00
1 50
2 00
2 50
Pb
++
Pb
++
A
t
i
v
i
d
a
d
e
C
h
E
(
q
m
o
l
x
m
i
n
u
t
o
-
1
x
m
g
-
1

d
e

p
r
o
t
e

n
a
)
ATIVIDADE ChE

Mdias e intervalo de confiana da atividade ChE.



A
t
i
v
i
d
a
d
e

C
h
E

(
?
m
o
l
.
m
i
n

1
m
g

m
g


p
r
o
t
e
i
n
a


controle
Pb
++

0
30
60
90
120
150
crebro ( p < 0,05 ); n = 6 + 6
14 doses; 70 dias; 0,3 g TBT .g
-1
biomassa . 120 h
-1

Mdias e intervalo de confiana da atividade ChE.

A
t
i
v
i
d
a
d
e

C
h
E

(
?
m
o
l
.
m
i
n

1
m
g

m
g


p
r
o
t
e
i
n
a


controle TBT
0
10
20
30
40
50
60

crebro ( p > 0,05 ); n = 6 + 6

Mdias e intervalo de confiana da atividade ChE.


A
t
i
v
i
d
a
d
e

C
h
E

(
?
m
o
l
.
m
i
n

1
m
g

m
g


p
r
o
t
e
i
n
a


Controle
Pb
++

0
40
80
120
160
msculo axial ( p < 0,05 ); n = 6 + 6


Mdias e intervalo de confiana da atividade ChE.

A
t
i
v
i
d
a
d
e

C
h
E

(
?
m
o
l
.
m
i
n

1
m
g

m
g


p
r
o
t
e
i
n
a

Controle
TBT
40
50
60
70
80
90
Mdias e intervalo de confiana da atividade ChE.
A
t
i
v
i
d
a
d
e

C
h
E
(
q
m
o
l
.
m
i
n

1
m
g

m
g


p
r
o
t
e
i
n
a
Controle
TBT
40
50
60
70
80
90
msculo axial ( p > 0,05 ); n = 6 + 6
14 doses; 70 dias; 21 g Pb
++
.g
-1
biomassa . 120 h
-1
0
250
500
750
*
TBTcontrol
Pb
++
control
TBT
Pb
++
C
h
E

a
c
t
i
v
i
t
y
(
n
m
o
l
.
m
i
n
-
1
.
m
g
-
1
p
r
o
t
e
i
n
)
14 doses; 70 dias;
21 g Pb
++
.g
-1
ww . 120 h
-1
0,3 g TBT .g
-1
ww. 120 h
-1
0
25
50
75
100
125
150
175
Controle MeHg
A
t
i
v
i
d
a
d
e

C
h
E
(
?

m
o
l

.

m
i
n
-
1
.
m
g
-
1

p
r
o
t
e

n
a
)
*
14 doses; 70 dias;
75 ng H
3
C-Hg
+
.g
-1
biomassa . 120 h
-1
INIBIO DA
o-AMINOLEVULINATO DESIDRATASE
(o-ALAd)

o-ALAd uma ENZIMA CITOSLICA SULFIDRLICA
SH: afinidade qumica ao substrato
grupos tilicos em estado reduzido (stio ativo)

importante na formao do grupo HEME
hemoprotenas:
hemoglobina
catalases, compx. citocromo P450
outros citocromos

ao cataltica diretamente inibida pelo Pb
sensvel a vrios metais in vitro
sensvel somente ao Pb (e Hg ?) in vivo

hemesintese
o-ALAs: sintetase do o-aminolevulinato
o-ALA: o-aminolevulinato (linear)
o-ALAd: desidratase do o-aminolevulinato
PBG: porfobilinognio (1 anel)
sHEME: heme-sintetase ou ferro-quelatase
4PBG
o-ALAd
PBG
o-ALA + o-ALA
o-ALAs
o-ALA
GLICINA +
4X
5 ENZIMAS
4 ETAPAS
3 COMPOSTOS
INTERMEDIRIOS
PROTOPORFIRINA IX
(4 anis)
KREBS
SUCCINIL-CoA
HEME
(4 anis)
HEMEs
Fe
++

o-ALA
o-ALA
o-ALA
o-ALA
o-ALA o-ALA
o-ALA
o-ALA
o-ALA + o-ALA
o-ALAd
PBG + p-dimetil-ABA
RESULTADOS
atividade da
-ALAd
eritrocitria
Pb
++
x Oreochromis niloticus
exposio hdrica de 96 h
ctrl
100

g.L
-1
3
00

g.L
-1
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
o -ALAd activity at 550 nm, 37
o
C per 1h
(
O
D
)
.
(
D
)
.
(
[
H
b
]
)
-
1
.
(
t
)
-
1
**
**
41.29%
(SD = 15.6)
39.57%
(SD = 11.92)
n = 5
Hg
++
x Oreochromis niloticus
exposio hdrica de 96 h
ctrl-Hg
15

g.L
-1
4
5

g.L
-1
0.000
0.025
0.050
0.075
o -ALAd activity at 550 nm, 37
o
C per 1h
(
O
D
)
.
(
D
)
.
(
[
H
b
]
)
-
1
.
(
t
)
-
1
n = 5
0 9 1 8 2 7 3 6 4 5 5 4 6 3 7 2 8 1
0 . 0
0 . 4
0 . 8
1 . 2
1 . 6
2 . 0
2 . 4
2 . 8
POLINMIO DE 3
a
. ORDEM
TEMPERATURA (
o
C )
O
D
/
O
D

a

3
7
o
C
RESULTADO - CINTICA da o-ALAd para
Hoplias malabaricus
6 animais
Temperatura de Incubao:
37
o
C
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
[ o - ALA] ( mM)
A
t
i
v
i
d
a
d
e

r
e
l
a
t
i
v
a
:
O
D
/
O
D
m
a
x
Li ne we ave r-Burk Pl ot
- 3. 0 - 2. 5 - 2. 0 - 1. 5 - 1. 0 - 0. 5 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 2 . 5 3 . 0
0 . 5
1 . 0
1 . 5
2 . 0
1/ [ o - ALA]
1
/
O
D
[o-ALA]: 4 mM
~ 11 vezes K
m

K
m
= 0,3653
RESULTADO - CINTICA da o-ALAd para
Hoplias malabaricus
7 animais
At i vi dade da o - ALAd e ri t roci t ri a de
Hopl i as mal abar i cus
CTRL
Pb
++
(8) Pb
++
(14) HgCH
3
+
(14)
0 . 00
0 . 01
0 . 02
0 . 03
0 . 04
0 . 05
0 . 06
0 . 07
**
**
21 g Pb
++
. g
-1
ww. 120 h
-1
75 ng HgCH
3
+
. g
-1
ww. 120 h
-1
(
O
D
)
.
(
D
)
.
(
[
H
B
]
)
-
1
.
(
t
)
-
1
***
n = 3
41 days
63.75%
(SD = 0,43)
P < 0.01
n = 5
70 days
60.34%
(SD = 27.4)
P < 0.001
n = 5
70 days
51.46%
(SD = 10.2)
P < 0.01
n = 9
One-way analysis of variance
Tukey's Multiple Comparison Test
METALOTIONENA (MT-SH)

60 aas (1/3: cistenas -SH)
FORTE LIGANTE DE METAIS PESADOS
l TOLERNCIA FISIOLGICA
AGENTE REDUTOR
ANTIOXIDANTE (TAMPO OXIDATIVO)

EXPRESSO CELULAR INDUZVEL
cdmio, cobre, zinco, mercrio, cobalto, bismuto,
nquel e prata
glicocorticides, glucagon, interleucina 1,
catecolaminas, progesterona, ESTRGENOS,
etanol, interferon e
ESPCIES REATIVAS DE OXIGNIO

BIOMARCADOR DE EXPOSIES A METAIS
RESULTADOS
quantificao
indireta da
MT-SH
MICROPLACA: 200 l a 405 nm
(mdias dos 3 modos de leitura)
0 60 120 180 240 300 360 420 480 540
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
[GSH] (M)
(
O
D
)
.
(
1
0
0
0
)
r
2
= 0,998


y = (0,5794) x + 220,3
-SH + DTNB COR AMARELA
MT- SH e m brnqui a de
Hopl i as mal abar i cus
CTRL
HgCH
3
+
0
50
100
150
200

m
o
l

C
Y
S

.
g
-
1

t
e
c
i
d
o
75 ng H
3
C-Hg
+
.g
-1
biomassa .120 h
-1

TESTE t
n = 7
TRFICO
70 dias
14 doses
MT-SH e m f gado de
Hopl i as mal abar i cus
CTRL
HgCH
3
+
0
10
20
30
40
50

m
o
l

C
Y
S

.
g
-
1

t
e
c
i
d
o
TESTE t
n = 8
TRFICO
70 dias
14 doses
75 ng H
3
C-Hg
+
.g
-1
biomassa .120 h
-1


VITELOGENINA (VTG)

VTG: glico-fosfo-lipoprotena com cerca de 170 a 180 kDa
principal constituinte do VITELO

sintetizada em HEPATCITOS
expresso sob controle multi-hormonal
transcrio (RNA
m
) ativada por estrgenos: 17|-estradiol (E
2
)

expresso heptica ou supresso por fatores exgenos indica,
respectivamente:
efeitos ESTROGNICOS em machos e jovens
efeitos ANTI-ESTROGNICOS em fmeas

RESULTADOS
expresso heptica
induzida
da VTG
VITELOGENINA (VTG) em plasma de Hoplias malabaricus
evidenciada por SDS-PAGE descontnuo (Coomassie Brilliant Blue)
empilhamento em ACRILAMIDA a 4 % \\ separao em ACRILAMIDA a 9 %
INDUO in vivo com hexaidrobenzoato de estradiol (E
2
)
dose via intraperitoneal: 20 g E
2
. g
-1
biomassa iip E
2
(+)
linha 1: 200 nl dos animais 3 e 6 (pool de plasma), MACHOS jovens E
2
(-)
linha 2: 200 nl do animal 4, FMEA jovem E
2
(-)
linha 3: 50 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E
2
(+)
linha 4: 200 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E
2
(+)
linhas 5 a 8: 50 nl de VTG redissolvida em NaCl 1 M, aps PRECIPITAO (2x), com EDTA/MgCl
2
e H
2
O

linha 5: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 2,5
linha 6: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 2,0
linha 7: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 1,5
linha 8: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 1,0

animal 11, iip E
2
(+) :
1 2 3 4 5 6 7 8
MWM
205 kDa
116 kDa
97,4 kDa
66 kDa
45 kDa
29 kDa
VITELOGENINA (VTG) em plasma de Hoplias malabaricus
evidenciada por SDS-PAGE descontnuo (Coomassie Brilliant Blue)
empilhamento em ACRILAMIDA a 4 % \\ separao em ACRILAMIDA a 9 %
INDUO in vivo com hexaidrobenzoato de estradiol (E
2
)
dose via intraperitoneal: 20 g E
2
. g
-1
biomassa iip E
2
(+)
linha 1: 400 nl dos animais 3 e 6 (pool de plasma), MACHOS jovens E
2
(-)
linha 2: 400 nl do animal 4, FMEA jovem E
2
(-)
linha 3: 100 nl do animal 11, sexo indefinido, iip E
2
(+)
linha 4: 400 nl do animal 1, FMEA jovem E
2
(-)
linhas 5 a 8: 150 nl de VTG redissolvida em NaCl 1 M, aps PRECIPITAO (2x), com EDTA/MgCl
2
e H
2
O

linha 5: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 2,5
linha 6: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 2,0
linha 7: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 1,5
linha 8: [EDTA] : [Mg
++
] = 1,0 : 1,0

animal 11, iip E
2
(+) :
1 2 3 4 5 6 7 8
MWM
116 kDa
97,4 kDa
45 kDa
29 kDa
RESULTADOS
osmolaridade e
eletrlitos
plasmticos
OSMOREGULATION (PLASMA)
TREATMENT
[Osm]
(mOsm.kgH
2
O
-1
)
[Cl
-
]
(Mm)
[Mg
++
]
(mM)
[Ca
++
]
(mM)
CTRL 299 22.7 (5) 110
4.7 (8)
1.02
0.09 (8)
1.39
0.09 (7)
TBT
(4 doses)
295 10.0 (2) 121
2.3 (3)
1.18
0.02 (3)
1.53
0.07 (3)
TBT
(8 doses)
269 19.4 (3) 87
0.7

(3)
0.68
0.05

(3)
1.54
0.08 (3)
Pb
++
(4 doses)
194 55.3 (3) 99
9.7 (3)
0.88
0.03 (3)
1.73
0.10 (3)
Pb
++
(8 doses)
209 21.9 (3) 108
4.5 (3)
1.00
0.04 (3)
1.57
0.17 (3)
21 g Pb
++
.g
-1
biomassa . 120 h
-1
0,3 g TBT .g
-1
biomassa . 120 h
-1
Significant differences ( p < 0.05 ):
contaminated different from control;
Pb
++
different from TBT for same number of doses;


8 doses different from 4 doses, same contaminant.
OUTROS
RESULTADOS

parmetros hematolgicos
cultivo de hepatcitos
captao de luz na retina
(Labo Comportamento Animal, dep Psicologia - USP)