Anda di halaman 1dari 25

Oleh : Dr. Ir. Tri Dewanti W., M.Kes.

PENGUJIAN BIOASSAY
Metode In Vivo dgn hewan percobaan Pengujian Bioassay

Metode In Vitro dgn darah dan cairan fisiologis (urin, fases, saliva dll.) pd hewan dpt dgn organ tubuh

in vivo mulai bnyk ditinggalkan krn pengorbanan mahluk hidup Pengujian in vitro mengurangi penggunaan hewan percobaan Pengujian in vitro memerlukan pemahanan fungsi anatomi, penggunaan model-model dan ketrampilan analitik Pemahanan fungsi anatomi perlu difahami untuk medptkn biomarker yg sesuai penggunaan kultur jaringan dgn parameter viabilitas dan enzimatis
Pengujian

Metode

uji in vitro berdasarkan teknik kultur dgn media sintetik yg sesuai sesuai dgn kondisi fisiologis alamiahnya kondisi lingkungan yg steril peralatan yg memadai (inkubator CO2 hrs ada)

Teknik ELISA
Enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) atau disebut sebagai uji penentuan kadar imunosorben taut-enzim Merupakan teknik pengujian serologi yang didasarkan pada prinsip interaksi antara antibodi dan antigen. Pada awalnya, teknik ELISA hanya digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi keberadaan antigen maupun antibodi dalam suatu sampel seperti dalam pendeteksian antibodi IgM, IgG, & IgA pada saat terjadi infeksi (pada tubuh manusia khususnya).

Kelebihan & Kekurangan Teknik ELISA


Teknik

ELISA memiliki beberapa kelebihan : Teknik pengerjaan relatif sederhana. Relatif ekonomis (karena jenis antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi) Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi. Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi dan antigen yang bersifat sangat spesifik)

Kekurangan dari teknik ELISA antara lain: Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen) Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif cukup mahal.

Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat

terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan blocking sehingga antibodi sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim signal dan menimbulkan signal. Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan harus dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan larutan untuk menghentikan reaksi).

Alat & Bahan Yang Digunakan Alat paling utama yang digunakan dalam teknik ELISA adalah microtiter. Microtiter ini berupa suatu papan plastik dengan cekungan sebanyak 96 buah (8 cekungan ke arah bawah dan 12 cekungan ke samping). Microtiter ini terbuat dari bahan polistirena. Cekungan dari microtiter memiliki tinggi sekitar 1 cm dan diameter 0,7 cm. Berikut ini adalah gambarnya:

Bahan lainyang umum digunakan dalam Teknik ELISA antara lain:


Antigen yangdimurnikan(jika sampel yang

hendak dideteksi atau dikuantifikasi berupa antibodi). Antibodi yang dimurnikan (jika sampel yang hendak dideteksi atau dikuantifikasi berupa antigen). Larutan standard (kontrol positif dan negatif). Sampel yang ingin dites Cairan pencuci (buffer). Antibodi atau antigen yang tertaut dengan enzim signal Substrat yang bersifat spesifik terhadap enzim signal ELISA reader (spektrofotometer) untuk pengukuran kuantitatif.

MACAM-MACAM TEKNIK ELISA


Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu : 1. Teknik ELISA kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim 2. Teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua(sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA sandwich

ELISA DIRECT
Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel. ELISA direct menggunakan suatu antibodi spesifik (monoklonal) untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji

Pada ELISA direct Pertama microtiter diisi dengan sampel yangmengandung antigen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel pada bagian dinding-dinding lubang microtiter Kemudian microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Lalu antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter sehingga antibodi dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan, Membilas microtiter untuk membuang antibodi tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antigen.

Lalu, kedalam lubang-lubang microtiter ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pendeteksian interaksi antara antibodidengan antigen tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan menggunakan kolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent end-point

ELISA

direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain:


Immunoreaktivitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertautdengan enzim. Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu danmahal. Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dariantibodi pada percobaan yang berbeda. Amplifikasi signal hanya sedikit. Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikansebelum digunakan untuk uji ELISA direct.Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain: Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibodi Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silangdengan antibodi lain (antibodi sekunder) dapat diminimalisasi.

ELISA Indirect
Pada

Teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan antibodi. ELISA indirect menggunakansuatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibodi yang diinginkan pada sampel yang diuji.

Pada ELISA indirect, Pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandung antigen spesifik, sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung antibodi yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang diinginkan. Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuang antibodi yang tidak berinteraksi dengan antigen spesifik.

Lalu, ke dalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal, sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal. Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang antibodi sekunder tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik. Pada tahap akhir, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut dengan antibodi sekunder spesifik yang telah berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkans ignal yang dapat dideteksi

ELISA INDIRECT MEMILIKI BEBERAPA KELEMAHAN, ANTARA LAIN:


Membutuhkan waktu pengujian yang relatif lebih lama daripada ELISA direct karena pada ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang diinginkan dan antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunder tertaut enzim signal, Pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi spesifik tertaut enzim signal.

KELEBIHAN DARI LAIN

ELISA INDIRECT ANTARA

Terdapat berbagai macam variasi antibodi sekunder yang terjual secara komersial di pasar Immunoreaktivitas dari antibodi yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh penautan enzim signal ke antibodi sekunder karena penautan dilakukan pada wadah berbeda. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibodi yang diinginkan memiliki beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibodi sekunder.

ELISA SANDWICH
Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibodi primer spesifik untuk menangkap antigen yang diinginkan dan antibodi sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA direct, Hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi.

Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan antibodi primer spesifik dan antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal, Teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISAsandwich, antibodi primer seringkali disebut sebagai antibodi penangkap, sedangkan antibodi sekunder seringkali disebut sebagai antibodi deteksi.

Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkanuntuk mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISAs andwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibodi. Pada ELISA sandwich, pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandung antibodi penangkap, sehingga antibodi penangkap tersebut dapat menempel pada bagian dinding lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antibodi penangkap yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi interaksi antara antibodi penangkap dengan antigen yang diinginkan.

Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuang antigen yang tidak berinteraksi dengan antibodi penangkap. Lalu, kedalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibodi detektor, sehingga pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi detektor. Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang antibodi detektor yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut pada antibodi detektor yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi