Parvovrus: terapia gnica

Mestrado em Engenharia Biomdica: Especializao em EBTO Virologia e Terapia Gnica 2 ANO (1 Semestre )

Kevin Sales & Snia Vaz Ano lectivo 2012-2013

Parvovrus
Vrus mais pequenos ( = 18-26 nm)

Dependovirus
Parvovirinae
(vertebrados)

Parvoviridae
Densovirinae
(invertebrados)

Parvovrus autnomos

Dependovirus

Nem todos requerem a ajuda do adenovrus (exemplo:

herpesvrus, alguns retrovrus);

Alguns podem replicar na ausncia do vrus ajudante; Usados como vectores de genes:

Produo em massa de determinadas protenas; Tratamento de vrias doenas genticas.

No est associado a qualquer doena;

Parvovirus autnomo

No necessita de vrus ajudante; Vrus B19:

Foi descoberto no soro de um dador de sangue saudvel; Infecta os precusores dos glbulos vermelhos; Infeco assintomtica; Doenas associadas: - artrite aguda; - anemia aplstica; - quinta doena.
Fonte:Carter, J. and Sauders, V. (2007). Virology: principles and applications. England: John Wiley & Sons, Ltd

PARVOVRUS: Virio
GENOMA CPSIDE

ssDNA linear (4-6 kb); Simetria icosadrica;

Existncia partir de 60 sequncias complementares no final da Formada ade pequenas molculas proteicas; molcula de DNA (dsDNA forma a Pairing);da estrutura da Uma espcie de protena -> Base maioria cpside;

Aproximadamente esfrica;

Cada vrtice apresenta uma salincia com um poro no centro;

Fonte: Carter, J. and Sauders, V. (2007). Virology: principles and applications. England: John Wiley & Sons, Ltd

PARVOVRUS: Replicao
Depende de protenas da clula hospedeira; Apenas disponveis durante a fase S do ciclo celular (sntese de DNA);

Ocorre apenas durante a fase S (ao contrrio de outros vrus de

DNA).

PARVOVRUS: Replicao
LIGAO E ENTRADA:

Fonte:Carter, J. and Sauders, V. (2007). Virology: principles and applications. England: John Wiley & Sons, Ltd

PARVOVRUS: Replicao
Converso ssDNA para dsDNA e Replicao DNA:

Converso mediada por DNA polimerase celular; Extremidade 3-terminal actua como primer (local onde a enzima

polimerase se liga);

Ocorre por replicao rolling-hairpin;

Fonte:Carter, J. and Sauders, V. (2007). Virology: principles and applications. England: John Wiley & Sons, Ltd

PARVOVRUS: Replicao
TRANSCRIO E TRADUO:

Fonte: Carter, J. and Sauders, V. (2007). Virology: principles and applications. England: John Wiley & Sons, Ltd

PARVOVRUS: Ciclo de Replicao

Fonte: Carter, J. and Sauders, V. (2007). Virology: principles and applications. England: John Wiley & Sons, Ltd

AAV: Caracterizao
Protenas Primer da replicao Protenas Integrao do genoma viral e funcionais 5kb estruturais (VP1, VP2, VP3) sua desintegrao

Adaptado de: Buning H., Perabo L., Coutelle O., Quadt-Humme S. & Hallek M. (2008). Recent developments in adeno-associated virus vector technology. The journal of gene medicine 10: 717-733.

14 serotipos pequenas diferenas na sequncia das protenas da cpside

Especificidade para diferentes tecidos

AAV: Infeco
EtapasAAV-2 da infeco
3 1 Ligao ao receptor celular 2 Entrada na clula 3 4 2 5

E o que acontece depois de Transporte endossomal entrar endossoma no ncleo? Libertao do

4
Adaptado de: Ortolano S., Spuch C. & Navarro C. (2012). Present and future of adeno associated vrus based gene therapy approaches. Recent patents on endocrine, metabolic & immune drug discovery 6: 47-66.

5 Desencapsulao e entrada no ncleo

AAV: Ciclo Ltico vs Latncia

Vrus auxiliar

Ciclo ltico
Replicao do genoma do AAV Expresso de genes Produo de viries

Ciclo latncia Expresso das protenas Rep Ligam-se s ITR e ao AAVS1 Integrao do genoma viral

Locus: 19q13.4

AAV: Estratgias de terapia gnica

Ex vivo
1. Colheita e cultivo In das in vitrovivo clulas 1. do paciente do Formulao 2. Transduo com o vector AAV com AAV com transgene 2. transgene Injeco directa do 3. Seleco etecido vector no expanso das alvo do paciente clulas com transgene 4. Reintroduo dessas clulas no paciente
Adaptado de: Menck C. F. M. & Ventura A. M. (2007). Manipulando genes em busca de cura: o futuro da terapia gnica. Revista USP 75: 50-61.

AAV: Produo de vectores

Purificao

Cpside: poder ser Alternativa: de diferentes Clulas de insectos serotipos 5 vezes (produo superior)

Adaptado de: Buning H., Perabo L., Coutelle O., Quadt-Humme S. & Hallek M. (2008). Recent developments in adeno-associated virus vector technology. The journal of gene medicine 10: 717-733.

AAV: Terapia gnica

Caractersticas vector ideal Vector AAV
Vantagens Desvantagens Fcil produo No patolgico Difcil produo e No gerar resposta imune Pouca estimulao do purificao a larga Expresso do transgene sistema imune escala Larga escala de e a longoEspao limitado para prazo eficiente infecciosidade o transgene particulas 1 1014 Especificidade para o tecido das Estimulao virais/ml alvo clulas T citotxicas Especificidade para Inicio lento da determinados tecidos expresso do transgene

Cpside AAV-2

Aplicao de AAV em terapia gnica: Doenas

Doena Amaurose Congnito de Leber Parkinson Hemofilia B Distrofia muscular de Ducheme Falha cardaca severa Artrite reumatide Fibrose cstica Tecido alvo Serotipo(s)

Olho
CNS Fgado, msculo esqueltico Msculo esqueltico Corao Junes Pulmo

AAV-2
AAV-2 AAV-2 AAV-1/2 AAV-1; AAV-6 AAV-2 AAV-2

Cancro expresso do factor de necrose tumoral para induzir apoptose

Aplicao de AAV em terapia gnica: Doenas

HEMOFILIA B: Doena gentica associada ao cromossoma X; Consiste numa deficincia no factor de coagulao IX (FIX);

Tratamento actual:

Injeces intravenosas do factor de coagulao concentrado (2 a 3 vezes por semana); Carcter profiltico; Extremamente dispendioso.
Alternativa: TERAPIA GNICA

Aplicao de AAV em terapia gnica: Doenas

HEMOFILIA B: Terapia Gnica

Transferncia do gene mediada pelo vector AAV; Permite a restaurao da actividade de coagulao;
- a produo do factor diminui progressivamente;
- torna-se indetectvel 14 semanas aps o tratamento.

AAV-2

COMO RESOLVER O PROBLEMA?

O hospedeiro desenvolve uma resposta imunitria contra as protenas da cpside do vector AAV-2.

Aplicao de AAV em terapia gnica: Doenas

HEMOFILIA B: Terapia Gnica (cont.)

Modificao da cpside para impedir resposta do SI:

-

Insero de ligandos; Uso da cpside do AAV-8 ou de outros AAV (requerimento: < seroprevalncia);

Fonte:Buning H., Perabo L., Coutelle O., Quadt-Humme S. & Hallek M. (2008). Recent developments in adeno-associated virus vector technology. The journal of gene medicine 10: 717-733.

Exemplo de um estudo clnico: Nathwani, A.C. et al.

HEMOFILIA B: Mtodos

AAV2/8

Transporta consigo o gene que codifica o FIX

Administrao intravenosa
(diferentes concentraes)

AAV-8 Cpside

AAV-2 ITR

Monitorizao overnight

Exemplo de um estudo clnico: Nathwani, A.C. et al.

HEMOFILIA B: Caractersticas dos pacientes antes e aps transferncia do gene

Nathwani A.C. et al. (2011). Adenovirus-Associated Virus VectorMediated Gene Transfer in Hemophilia B. The New England Journal of Medicine 365 (25): 2357-2365.

Exemplo de um estudo clnico: Nathwani, A.C. et al.

HEMOFILIA B: Resultados e Discusso

Quanto maior a dose administrada -> maiores os nveis de FIX; 4 (dos 6 pacientes) pararam de receber o tratamento profiltico (injeco de FIX concentrado) -> retomando as actividades que estavam impedidos de realizar devido doena;

2 pacientes diminuram o nmero de injeces de FIX concentrado necessrias; (soluo possvel: aumentar a dose de administrao do transgene -> aumento da expresso de FIX);

Exemplo de um estudo clnico: Nathwani, A.C. et al.

HEMOFILIA B: Resultados e Discusso (cont.)

Nenhum paciente apresenta uma resposta imunolgica contra o transgene FIX;

A administrao do transgene FIX provoca um aumento dos nveis de aminotransferase (soluo: administrao de glucocorticides, que no afectam a expresso do FIX);

Esta estratgia permite assim a expresso, a longo prazo, do transgene FIX (a nveis teraputicos) -> sem apresentar uma toxicidade aguda e a longo prazo;

MAS . . . Est associada ao risco de disfuno heptica;

Concluses
necessrio conhecer e compreender melhor o processo infeccioso de modo a superar as limitaes e optimizar a eficincia e segurana dos vectores virais Continua por resolver o problema associado resposta imunitria

Bibliografia

Buning H., Perabo L., Coutelle O., Quadt-Humme S. & Hallek M. (2008). Recent developments in adeno-associated virus vector technology. The journal of gene medicine 10: 717-733. Carter, J. & Sauders, V. (2007). Virology: principles and applications. England: John Wiley & Sons, Ltd. Giacca M. & Zacchigna S. (2012). Virus-mediated gene delivery for human gene therapy. Journal of controlled release 161: 377-388. Menck C. F. M. & Ventura A. M. (2007). Manipulando genes em busca de cura: o futuro da terapia gnica. Revista USP 75: 50-61. Nathwani A.C. et al. (2011). Adenovirus-Associated Virus VectorMediated Gene Transfer in Hemophilia B. The New England Journal of Medicine 365 (25): 2357-2365. Ortolano S., Spuch C. & Navarro C. (2012). Present and future of adeno associated vrus based gene therapy approaches. Recent patents on endocrine, metabolic & immune drug discovery 6: 47-66. Qiu Y., Yang B., Lan X., Li X., Yin X. & Liu J. (2012). Advances in studies on recombinant adeno-associated virus vector. Asian journal of animal and veterinary advances 7: 1255-1260.