Bibliotecas Genmicas

Domnguez Hernndez Mariana Garza Jess Erick Alejandro Romero Cruz Vctor Adolfo Rojas Estrada Anah

Introduccin
Hay diferentes tipos de bibliotecas de Fragmentos en los cuales hay :
Biblioteca de clonos Biblioteca de complementario DNA

Biblioteca Restringida

Biblioteca Genmica

Bibliotecas Genmicas
Coleccin de fragmentos de DNA que representan tanto todas las secuencias de un genoma los cuales son clonados en un vector que puede ser usado o mantenido establemente.

Aplicaciones Para una Biblioteca Genmica

Secuenciar un gen entero o una regin de un cromosoma Secuenciacin de genomas Identificar promotores

http://www.qb.fcen.uba.ar/bm/2009%20%28ir%20a%20materias.qb.fcen.uba.ar%29/TE%D3RICO -PR%C1CTICO/Clase%204/Clase%20biblio%20genomica%202009.pdf

Construccin de Una biblioteca Genmica

Corte mecnico Endonucleasas o

DNA Genmico

Separacin por Tamao

Eleccin del vector

http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ingenieria/2001832/lecciones/bibliotecas.html

Genotecas de DNA

Genoma del Fago

cDNA preparado por transcripcin inversa de los mRNA

Aislar todo el mRNA Utilizacin de la transcriptasa inversa Sntesis de DNA apartir de RNA Metilacin del cDNA Clonacin Corte con enzimas de restriccin

Sondas de Oligonucletidos

Preparacin de sondas especificas con marca radioactiva.

Debe de tener longitud suficiente y tener especificidad.
Sondas degeneradas Sondas basadas en EST exclusivo.

Sondas degeneradas
Fig 7-19 Diseo de sondas de oligonucletidos sobre la base de la secuencia proteica.

Sondas basadas en EST exclusivo

Sonda basada en una secuencia parcial de aa determinada de una protena aislada. Identifica un nico oligonucletido. Secuencias parciales de cDNA de 200400 pb. En base a programas de computacin que aplican el cdigo gentico. PCR.

Identificacin, anlisis y determinacin de la secuencia de DNA clonado

Aislacin de una protena

Aislar el gen que la codifica

Biblioteca Genmica completa hasta un milln de clones Biblioteca cDNA debe contener clones suficientes de mRNA

Hibridacin con sondas de DNA o RNA marcadas radioactivamente Identificar la secuencia

Separacion Escision del vector recombinante con misma E..R

Prueba de Hibridacin con mb para la deteccin de cidos nucleicos

Si vuelve a neutralidad se forman de nuevo los enlaces Union de sonda a cada complementaria

Calentamiento en sol salina o por elevacin de pH a 11 Si se lleva a cabo la reaccin en un soporte la reaccin es irreversible

Identificacin de un clon especifico de una biblioteca de fago por hibridacin con membrana con una sonda radiactiva

Placa maestra de placas de fago sobre un cultivo de E. coli

Los viriones recombinantes presentes en un cultivo de E. coli se transfieren a una membrana de nitrocelulosa.

Placas individuales de fago

Filtro de nitrocelulosa

Replica de la caja de Petri sobre la superficie de la membrana de nitrocelulosa

Se reproduce sobre la superficie de la membrana una replica de la placa Petri que contiene gran cantidad de clones
La placa madre se refrigera para almacenar el conjunto de clones

La membrana se incuba en una solucin alcalina que deteriora los viriones y libera y desnaturaliza el DNA encapsulado.

Se lisan los fagos y desnaturaliza el DNA

DNA

La membrana se seca y a su superficie se fija el DNA recombinante. Por ultimo la membrana se incuba con una sonda con marca radiactiva en condiciones de hibridacin.
DNA monocatenario de fago fijado al filtro Sonda con marca radiactiva

La sonda no hibridada se elimina por lavado

El filtro se somete a autorradografia. La aparicin de una mancha indica la presencia de un clon recombinante que contiene DNA complementario de la sonda.

Las partculas de fago de una regin identificada de la placa maestra se aslan y se resiembra, entonces se pueden obtener aislamientos puros del clon que contiene el DNA de interes.

GRACIAS