Expresso de protenas heterlogas

Objetivos: clonagem de genes e manipulao da expresso de protenas sob o controle de um dado promotor, cuja expresso pode ser indutvel ou contnua.

- a expresso de protenas clonadas tornou-se uma abordagem poderosssima que

vem revolucionando os estudos de estrutura, funo, purificao e identificao de novas protenas.

-expresso heterloga, espera-se que a protena de interesse seja estvel, no txica para o hospedeiro, solvel, produzida em grande quantidade e possa ser facilmente purificada.

- Super-expresso/super-produo/produo de ptns em grande quant.

Clonagem em vetor de expresso

Estratgia geral: - gene clonado num vetor capaz de promover a transcrio do inserto em clulas vivas. Hospedeiro e DNA recomninante precisam ser compatveis. necessrio respeitar o sinal de traduo de genes procariticos (sinal de Shine-Dalgarno), em outras palavras, o DNA deve ser clonado de maneira que sua fase de leitura correta fique em fase com o ATG iniciador Organismos hospedeiros e seus principais vetores: - E. coli = plasmdeos - Leveduras (Saccharomyces cerevisiae) - vetores plasmdeo 2 (derivados) - clulas de insetos - vetores = baculovrus - clulas de mamferos - vetores derivados de adenovrus, retrovrus, herpes - plantas vetores derivados de plasmdeo Ti (de Agrobacterium tumefaciens)

Vetores e clonagem em bactrias

tempo de crescimento reduzido que permite a obteno de grandes quantidades de bactrias em pouco tempo. Possibilidade de fazer protenas e exportar para o meio extracelular (sinais especficos) possibilidade de manter as bactrias em placa de cultura e fazer bibliotecas de expresso

Vetores e clonagem em leveduras

tempo de crescimento reduzido que permite a obteno de grandes quantidades de leveduras em pouco tempo. genoma de pequeno tamanho, cerca de 200 vezes menor que o genoma de mamferos, o que simplifica anlises moleculares e genticas. possibilidade de manter as leveduras como clulas haplides ou diplides, o que permite a obteno de mutaes recessivas em clulas haplides, bem como a realizao de experimentos de complementao gentica. As clulas de mamferos so diplides o que torna impossvel a deteco de mutaes recessivas.

Vetores em leveduras
Vetores de integrao: tais vetores contm origem de replicao de bactrias e genes marcadores para seleo em bactria e levedura. Plasmdeo no capaz de replicar de modo autnomo na levedura. capaz de expressar o marcador de seleo atravs da integrao em um dos cromossomos de levedura. Vetores que replicam em levedura: - origem de replicao de bactria e genes marcadores para seleo em bactria e levedura. - origem de replicao do plasmdeo de 2 m, que de ocorrncia natural em levedura. - origens de replicao isoladas de DNA cromossomal denominadas ARS (Autonomously Replicating Sequence, sequncias de replicao autnoma). - sequncia tipo centromrica, denominada CEN, que garante replicao estvel, ocorrendo uma nica vez por ciclo celular e que eles sejam segregados de modo preciso durante a mitose e meiose. Vetores contendo sequncias tipo CEN so mantidos em cpia nica na levedura - YACs: (Yeast Artificial Chromosome, cromossomo artificial de levedura): variao de um vetor de cpia nica, que contm sequncias centromricas (CEN) e sequncias telomricas, que permite que sejam replicados como molculas lineares, com comportamento semelhante ao do DNA cromossomal. So uma ferramenta valiosa na caracterizao de grandes segmentos genmicos na medida em que possvel clonar em um YAC fragmentos que vo de 100 a 2000 kb

Leveduras Ex. YACs

Vetores de expresso de leveduras

Clonagem em leveduras e marcas de seleo

Marcadores de seleo: maioria genes marcadores utilizados biossntese de aminocidos e nucleotdeos.Ex. GENE ENZIMA SELEO
HIS3 LEU2b Imidazol glicerolfosfato desidratase Isopropilmalato desidrogenase histidina leucina

Aplicaes da expresso heterloga

Aplicaes: - produo de antgenos (para futura induo de anticorpos) fidelidade estrutural no to necessria. Protenas hbridas/quimeras. - estudos bioqumicos ou de biologia celular estrutura (tridimensional) correta da ptn - estudos da estrutura da protena tem que ser preservada - modificao gentica OGMs - terapia gnica estrutura e funo precisam ser preservados

Problemas
Assim, dentre os problemas mais comuns que ocorrem com a produo de protenas heterlogas em E. coli, podemos citar: Protenas txicas: Alternativa: protenas que so secretadas. Para tanto basta clonar o DNA codificante em fuso com uma seqncia codificante para um peptdeo sinal de procarioto. Este peptdeo clivado pela peptidase sinal quando a protena secretada para o periplasma. em alguns casos: no caso de protenas txicas para a bactria; Um exemplo de sucesso a expresso do hormnio fator de crescimento epidermal humano (hEGF) sob o comando do promotor da fosfatase alcalina (phoA) e com a seqncia sinal desta. A induo obtida sob privao de fosfato do meio. Protenas instveis: isto pode ser resolvido reduzindo-se a temperatura de crescimento ou mudando-se para uma linhagem de bactria deficiente em uma ou mais proteases. Mesmo assim comum se obter algum nvel de fragmentao da protena expressa Baixos nveis de expresso: pode ocorrer pelas razes acima dentre outras, como, por exemplo, instabilidade do mRNA, trmino prematuro da mensagem, traduo ineficiente. Protenas insolveis: protenas de eucariotos produzidas em bactria so geralmente precipitadas na forma de corpos de incluso e requerem procedimentos adicionais de desnaturao para solubiliz-las e de renaturao para mant-las solveis e funcionais. Isto nem sempre um problema, pois a formao de corpos de incluso pode proteger a protena contra a degradao por proteases bacterianas e tambm facilitar a purificao, uma vez que so corpos densos, precipitados baixa velocidade de centrifugao, enquanto a maior parte das protenas bacterianas permanecem no sobrenadante. Mas algumas vezes no se consegue renaturao adequada da protena purificada. Neste caso deve-se tentar atenuar a formao de corpos de incluso alterando as condies de expresso, por exemplo, crescendo-se a cultura a temperatura mais baixa aps a induo ou utilizando um promotor mais fraco. Ausncia de glicosilao de protenas em bactrias: muitas vezes necessria para o funcionamento das protenas (atividade, direcionamento e proteo)

Clonagem com protenas carreadoras

gene clonado logo aps uma sequncia carreadora (ou inverso) promotor seq. carreadora gene de interesse protena de fuso ou hbrida quebra liberando a ptn de interesse inespecfica (qumica) especfica (por proteases) ajuda a aumentar nvel de expresso pode haver problema de solubilidade da ptn hbrida (o que pode ser vantagem: os agregados podem ser mais fceis de recuperar na purificao)

Estratgias

Vetores de expresso
Dentre os vetores utilizados com sucesso para a produo de protenas hbridas podemos citar: pGEX: apresenta a glutationa-S-transferase de Schistosoma japonicum (26 kDa) como protena de fuso, permitindo a purificao da protena de fuso em coluna de agarose-glutationa pMAL: apresenta a protena ligante de maltose (PLM) de bactria (42 kDa) como fuso, permitindo a purificao da protena de fuso em coluna com amilose acoplada pQE: apresenta um "tag" de 6 resduos de histidina como fuso e permite a purificao das protenas de fuso em colunas quelantes de Ni2+ pUR: cuja fuso um fragmento da b -galactosidase

Questes para o Estudo Dirigido entrega em 01/03/2013

1) O que necessrio para que um organismo transcreva um gene heterlogo? 2) Por que S. cerevisae no um organismo interessante para a expresso de protenas heterlogas? 3) Como pode ser realizada de maneira simples a anlise de clones de expresso de P. pastoris com diferente nmero de cpias do cassete de expresso da -amilase? 4) Que produtos biotecnolgicos j foram obtidos em leveduras? 5) Qual a importncia da diversidade do cerrado para a expresso heterloga e utilizao de patentes?