UNIVERZITET U SARAJEVU PRIRODNO-MATEMATIKI FAKULTET ODSJEK ZA BIOLOGIJU

ANALITIKA LIPOSOLUBILNIH VITAMINA

Seminarski rad iz predmeta Biohemijska analitika

Predmetni nastavnik: prof. dr. Edhem Haskovi Studenti: ogi Selma Karahodi Arnela Sarajevo, 2012. godine

VITAMINI
Vitamini su organski spojevi razliite hemijske strukture

potrebni organizmu u malim koliinama (od g do mg vrijednosti po danu), a nuni su za odravanje zdravlja, rasta i reprodukciju. ovjeji organizam ne moe sam sintetizirati vitamine, nego mora njih ili njihove prekursore unositi hranom. Uobiajena mijeana hrana redovno sadri dovoljne koliine vitamina. Meutim, neodgovarajua prehrana moe uzrokovati manjak nekog vitamina, to dovodi do hipovitaminoze ili ak avitaminoze.

 Mnoge su avitaminoze praene poremeajem u razvoju i

rastu, a este su i promjene na koi. Hipervitaminoze (viak vitamina) vrlo su rijetke i nikad ih ne uzrokuje prehrana. Do hipervitaminoze moe doi uglavnom samo ako se predozira vitaminska terapija. Prema topljivosti vitamini se dijele na vitamine topljive u mastima (liposolubilne) i vitamine topljive u vodi (hidrosolubilne). U mastima su topljivi vitamini A, D, E, F i K. Koncentracija vitamina relativno se rijetko odreuje u klinike svrhe, iako bi to trebalo ee initi, kako za utvrivanje hipovitaminoza, kad obino jo izostaju kliniki simptomi koji se pojavljuju tek kod avitaminoza, tako i u praenju vitaminske terapije da ne bi dolo do hipervitaminoze.

VITAMIN A (RETINOL)
Vitamin A se susree u tkivima ivotinja i ovjeka, dok ga biljke

ne sadre. Meutim, u biljkama se nalaze karotinoidi koji su izvor ovog vitamina, odakle se obrazuje pod uticajem odgovarajueg enzima (karotinaze). Nalazi se u jetri morskih i slatkovodnih riba, u mrkvi, puteru, ribljem ulju. Dnevna potreba za vitaminom A u ovjeka iznosi 2-3 mg. Iz digestivnog trakta i karotin i vitamin A odlaze u jetru gdje se karotin prevodi u vitamin A, a vitamin A putem krvi biva transportovan do tkiva gdje utie na tok metabolizma. U krvnoj plazmi zdravih ljudi vitamin A je vezan za albumine i gamaglobuline (oko 50 mg na 100 ml plazme). Kad se unosi malo vitamina A nastaje hipovitaminoza A, a ako se uopte ne unosi nastaje avitaminoza koja se lijei konzumiranjem ribljeg ulja.

 Hipovitaminoza A - niktalopija (nona sljepoa) - kseroftalmija (suho oko)

Hipervitaminoza A gubitak kose, glavobolja, pospanost, abdominalne tegobe, jako znojenje, pucanje noktiju. Hipervitaminoza se obino pojavljuje pri konzumiranju vie od 30 mg retinola na dan. Manje doze (oko 10 mg) mogu takoer uzrokovati hipervitaminozu A ako se uzimaju due vrijeme (vie od 6 mjeseci).

 Akutna trovanja sa smrtnim ishodom u ovjeka su zapaena

pri konzumiranju jetre polarnog medvjeda, koja sadri vie od 12 mg retinola po 1 g jetre. Oralna kontraceptivna sredstva poveavaju koncentraciju vitamina A u serumu. Koncentracija karotena poveana je u djece s hipotireozom, jer jetra ne moe pretvarati karotene u vitamin A. Isto je i kod prehrane s mnogo karotena (mrkva, paradajz) i hiperlipoproteinemije u eernoj bolesti.

METODE ODREIVANJA VITAMINA A

Starije hemijske metode za odreivanje vitamina A se koriste

samo ako HPLC nije dostupna. Hemijske metode ukljuuju Carr-Price spektrofotometrijsku metodu koja se koristi antimon-trihloridom u hloroformu kao reagensom i Neeld-Pearson metodom pri kojoj se koristi trifluorooctena kiselina kao reagens. Trifluorooctena kiselina reaguje s elektronima u konjugiranim dvostrukim vezama vitamina A (i karotenoida) i stvara plavo obojeni spoj. Obje se metode koriste reagensima koji su korozivni i nespecifini, dugotrajne su i ne mogu se automatizirati, te trebaju veliki volumen uzorka za analizu.

 S HPLC-om su znatno poboljane specifinost, tanost i

reproducibilnost odreivanja vitamina A te je smanjena granica detekcije (manje od 0,07 mol/L). Referentni interval za vitamin A u serumu izmjeren HPLCom iznosi 1,05-2,80 mol/L, za -karoten 0,19-1,58 mol/L.

VITAMIN D (KALCIFEROL)
Vitamin D se zbog historijskih razloga svrstava meu

vitamine, iako je po veini obiljeja rije o hormonu (steroidna struktura, mehanizam djelovanja). Postoje dva tipa vitamina D, ivotinjski kalciferol ili kolekalciferol ili vitamin D, i biljni ergokalciferol ili vitamin D. Odrasle, zdrave osobe dnevne potrebe organizma za vitaminom D nadoknauju izlaganjem suncu ili ga dobivaju hranom. Dnevna preporuena koliina vitamina D potrebna za odravanje normalnog zdravlja iznosi 5- 10 g.

 Ima ga u ulju iz jetre tune i drugih riba, mesu tune, maslacu i

malo u mlijeku. U plazmi se nalaze razni hidroksi-derivati vitamina D. Odreivanje koncentracije vitamina D primjenjuje se u diferencijalnoj dijagnostici hipokalcijemija i hiperkalcijemija te kotanih bolesti. Pravu, kliniku sliku daje odreivanje koncentracije 25(OH)D i 1,25(OH)D u krvi.

 Smanjena koncentracija 25(OH)D nalazi se pri nedovoljnoj

izloenosti sunevom svjetlu, nedovoljnom unosu vitamina D hranom, malapsorpciji vitamina D, poveanom gubitku (nefrotiki sindrom), a poveane koncentracije 25(OH)D se nalaze kod intoksikacije s 25(OH)D. Smanjena koncentracija 1,25(OH)D postoji pri oteenju bubrega, hiperfosfatemiji, hipomagnezijemiji, hipoparatireoidizmu i hiperkalcijemiji, a poveana koncentracija 1,25(OH)D kod primarnog hiperparatireodizma, limfoma i intoksikacije s 1,25(O H)D.

METODE ODREIVANJA VITAMINA D

Za odreivanje koncentracije 25(OH)D i 1,25(OH)D,

razvijene su specifine i osjetljive metode koje veinom ukljuuju 3 glavna stepena. To su: a) deproteinizacija zbog oslobaanja vitamina ili njegovih metabolita od DBP-a, najee uz acetonitril; b) hromatografija na koloni zbog odjeljivanja raznih oblika vitamina D, lipida i interferirajuih spojeva te c) kvantifikacija metodama koje ovise o obliku vitamina D koji se odreuje.

 Za mjerenje koncentracije 25(OH)D, primjenjuje se metoda

kompetitivnog vezanja proteina s DBP-om (CPBA) i HPLC. Za mjerenje koncentracije 1,25(OH)D, kojeg u serumu ima hiljadu puta manje nego 25(OH)D, primjenjuje se RIA nakon razdvajanja s HPLC-om i RIA nakon ekstrakcije. Referentni interval za koncentraciju 25(OH)D u serumu ili plazmi izmjeren s CPBA-om, ovisno o godinjem dobu, iznosi 50-300 nmol/L (ljeto) i 25-125 nmol/L (zima). Referentni interval za koncentraciju 1,25(OH)D u serumu odreen s RIA nakon ekstrakcije iznosi 75-200 mol/L. Koncentracija vitamina D vea je tokom trudnoe, u djece i u fazi intenzivnog rasta.

VITAMIN E (TOKOFEROL)
Vitamin E je sastavljen od osam slinih hemijskih spojeva

(optikih izomera), tokoferola, koji svi imaju izraeno antioksidativno djelovanje koje se temelji na uklanjanju slobodnih radikala i molekularnog kisika, a takoer imaju ulogu u procesu elijskog disanja. Tokoferola ima u peninim i kukuruznim klicama, maslinovom ulju, bademima, kikirikiju, jajima i u nekim mlijenim proizvodima (mlijeko, margarin). Dnevna potreba u ovjeka je oko 15 mg.

 Tokoferoli

djeluju kao antioksidansi u prevenciji lipidne peroksidacije polinezasienih masnih kiselina u elijskim membranama, gdje tite membranske fosfolipide od oteenja oksidacijom polinezasienih kiselina vodikovim peroksidom, no njihova puna biokemijska funkcija nije jo poznata. Vitamini E i C djeluju sinergistiki u smanjivanju lipidne peroksidacije. Manjak vitamina E moe se dovesti u vezu s miinom distrofijom. Simptomi manjka vitamina E jesu iritabilnost, edemi i hemolitika anemija do koje dolazi zbog kraeg vijeka eritrocita, odnosno kao rezultat oteenja njihovih membrana.

 Manjak vitamina E moe se pojaviti u prematurusa

i novoroenadi koji se raaju s malom tjelesnom masom, jer vitamin slabo prolazi posteljicu. U serumu je tokoferol oko 80% slobodan, a 20% u obliku acetata. U serumu se nalazi najprije u lipoproteinima niske gustoe (LDL). Razni preparati koji sadre vitamin E preporuuju se za prevenciju sranih bolesti, smanjenje LDL-holesterola, podizanje imunosti te sprjeavanje zloudnih bolesti.

ODREIVANJE KONCENTRACIJE VITAMINA E

Za mjerenje koncentracije vitamina E u serumu prije

su se primjenjivale direktne spektrofotometrijske ili fluorometrijske metode u kojima se tokoferol oksidira s ferihloridom u tokoferilkinon, a nastalo dvovalentno eljezo odredi se ,'-dipiridilom, tripiridilom ili batofenantrolinom, pri emu nastaje crveno obojenje.

interferira karoten, a interferirajui spojevi mogu se ukloniti hromatografijom. Za kvantifikaciju tokoferola, HPLC je metoda izbora zbog svoje tanosti i reproducibilnosti (referentni interval za djecu od 1 do 14 god iznosi 13,3-38,6 mmol/L, a za odrasle osobe 21,8-50,4 mmol/L).
U tim metodama

VITAMIN K
Vitamin K ini skupina od nekoliko vitamina (K1 - K5). U terapijske svrhe koriste se uglavnom K1 (fitomenadion) koji se

sintetizira u zelenim dijelovima biljaka, K2 (menakinon) koji sintetiziraju mikroorganizmi i K3 (menadion) koji se sintetiki dobiva iz a 1,4-naftokinona. K1 i K2 su topljivi u mastima, a K3 je topljiv u vodi. U prirodi dolaze dva vitamina: K1 i K2.

 Vitamina K ima u zelenom liu pinata, zelju, rajici, soji i dr. Manjak vitamina K uzrokuje sklonost krvarenju i poremeaje u

koagulaciji krvi, jer se ne stvara dovoljno protrombina. Preporuuje se dnevni unos hranom od 50 do 80 mg. U krvi se prenosi vezan na -lipoproteine.

 Bioloka mu je uloga u koagulaciji krvi, potreban je za sintezu

koagulacijskih faktora protrombina (faktor II), prokonvertina (faktor VII), tromboplastinske komponente plazme (faktor IX) i Stuartovog faktora (faktor X). Vitamin K je koenzim karboksilaze ovisne o vitaminu K, koja katalizira posttranslacijsku g-karboksilaciju glutaminskih ostataka vie proteina plazme, ukljuujui faktore zgruavanja II, VII, IX i X. Svi se ti proteini sintetiziraju u jetri. U odsutnosti vitamina K faktori zgruavanja ovisni o vitaminu K inaktivni su proteini. Faktori zgruavanja sintetizirani uz vitamin K sadravaju 10 gkarboksiglutaminskih ostataka u molekuli, koji imaju jaku sklonost za vezanje kalcijevih iona.

 U procesu g-karboksilacije vitamin K-hidrokinon prelazi u

vitamin K-epoksid koji se uz reduktazu i NADH ponovno reducira u vitamin K-hidrokinon. Antikoagulansi tipa kumarina djeluju na zgruavanje tako to koe spomenutu redukciju pa se primjenjuju u terapiji tromboza. Dugotrajna terapija sulfonamidima ili antibioticima unitava crijevnu floru, pa moe doi do znakova manjka vitamina K. Faktori koji mogu dovesti do smanjene apsorpcije jesu bilijarna opstrukcija, oteenje jetre ili slaba apsorpcija masti u crijevima. Simptomi manjka vitamina K jesu pojava krvarenja i produenje vremena zgruavanja krvi.

METODE ODREIVANJA VITAMINA K

Budui da je vitamin K prisutan u plazmi u relativno malim

koncentracijama (50 puta manjim nego vitamin D), dugo se status vitamina K procjenjivao funkcionalnim metodama. Jedna od njih jest njegov uinak na protrombinsko vrijeme (PV) koje je u sluaju manjka vitamina K produeno na oko 30 sekundi (normalno PV: 10-14 sekundi). Oko hiljadu puta osjetljiviji pokazatelj statusa vitamina K jest koncentracija des-g-karboksiprotrombina ili nekarboksiliranog protrombina koja se moe odrediti imunohemijskim metodama.

 Za izravno odreivanje

vitamina

K postoje razne

spektrofotometrijske metode. S natrijevim etilatom vitamin K stvara crveni kompleks, a s dietil-ditiokarbamatom u alkoholnoj luini daje plavu boju. Ako se naftokinonski prsten kataliki reducira u hidrokinon, moe se mjeriti smanjenje boje 2,6-dihlorfenol-indofenola. Metoda izbora za odreivanje koncentracije vitamina K u plazmi je HPLC s elektrohemijskom ili fluorometrijskom detekcijom. Referentni interval iznosi 0,29-2,64 nmol/l.

LITERATURA
traus, B. (2009). Medicinska biokemija, tree izdanje.

Medicinska naklada, Zagreb. traus, B. (1992). Medicinska biokemija, drugo; obnovljeno i dopunjeno izdanje. Medicinska naklada, Zagreb.