La manipulacin deliberada de la informacin gentica, con miras al anlisis gentico o al mejoramiento de una especie
Historia
1919: Karl Ereky, ingeniero hngaro, utiliza por primera vez la palabra biotecnologa. 1953 James Watson y Francis Crick describen la estructura doble hlice de la molcula de ADN. 1965: El bilogo norteamericano R. W. Holley ley por primera vez la informacin total de un gen de la levadura compuesta por 77 bases, lo que le vali el Premio Nobel. 1970: el cientfico estadounidense Har Gobind Khorana consigui reconstruir en el laboratorio todo un gen. 1973: Se desarrolla la tecnologa de recombinacin del ADN por Stanley Cohen, de la Universidad de Stanford, y Herbert W. Boyer, de la Universidad de California, San Francisco.
Historia
1976: Har Gobind Khorana sintetiza una molcula de cido nucleico compuesta por 206 bases. 1976: Robert Swanson y Dr. Herbert Boyer crean Genentech, la primera compaa de biotecnologa. 1982: Se produce insulina para humanos, la primera droga derivada de la biotecnologa. 1983: Se aprueban los alimentos transgnicos producidos por Calgene. Es la primera vez que se autorizan alimentos transgnicos en Estados Unidos. 2003 Cincuenta aos despus del descubrimiento de la estructura del ADN, se completa la secuencia del genoma humano. 2004: La ONU y el Gobierno de Chile organizan el Primer Foro Global de Biotecnologa, en la Ciudad de Concepcin, Chile (2 al 5 de marzo)
Ingeniera Gentica
Es la tecnologa de la manipulacin y transferencia del ADN de unos organismos a otros, que posibilita la creacin de nuevas especies, la correccin de defectos genticos y la fabricacin de numerosos compuestos.
Genes
Controlan todos los aspectos de la vida de cada organismo:
-Metabolismo -Forma -Desarrollo -Reproduccin -Constituyen el enlace esencial entre generaciones
ya existe toda base cientfica necesaria, pero no tendremos hasta dentro de 10 o 5 aos la eficiencia y seguridad para llevar a transferencias genticas de forma tica
Otro factor limitante: el banco de genes no tienen depositados a la espere de clientes todos los complejos conjuntos de genes que determinan la inteligencia, el buen comportamiento, higiene mental perfecta. Lo ideal de recurrir a la ingeniera gentica es que se utilice para prevenir o corregir enfermedades serias y no para tener un hijo mas inteligente, o para que sea alto y de ojos celestes. La ciencia sigue progresando a velocidad de un tren bala, llegando a menudo a una estacin determinada mucho antes de que haya podido analizarse y comprenderse a fondo todas las consecuencias derivadas de sus adelantos.
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Ingeniera Gentica
En 1973 los investigadores Stanley Cohen y Herbert Boyer producen el primer organismo recombinando partes de su ADN en lo que se considera el comienzo de la ingeniera gentica.
Ingeniera Gentica
La Ingeniera Gentica se basa en la clonacin molecular. Un fragmento de DNA se recombina con un vector y se introduce en un hospedador adecuado. Los vectores de clonacin mas utilizados son los plasmidos y los bacterifagos.
- 1971 Kathleen Dannna y Daniel Nathans, marcaron el inicio de la era del DNA recombinante, con el aislamiento de una enzima de una bacteria y la
DNA recombinante
Creacin de nuevas combinaciones de segmentos o de molculas de DNA que no se encuentran juntas de manera natural
cantidades ilimitadas de un
NUCLEASAS
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nucleasas
exonucleasas degradan los cidos nucleicos desde un extremo de la molcula. Algunas actan en la
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Las Endonucleasas o enzimas de restriccin son enzimas que hidrolizan los cidos nucleicos rompiendo enlaces internucletidos. -Son producidas por las bacterias, como un mecanismo de defensa contra las infecciones vridicas, donde actan como un mecanismo de defensa, para degradar material gentico extrao que entre en la clula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extrao y el DNA propio. Las enzimas de restriccin no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial. - Se han identificado mas de 200 -Todas se unen a DNA - reconocen una secuencia especfica de nucleotidos denominada secuencia de reconocimiento. - tienen un patrn de corte especfico
- Las endonucleasas de restriccin cortan el DNA generando, bien extremos 3 o 5 de unos cuatro nucletidos de longitud, denominados extremos cohesivos, o bien
extremos romos.
5- ATCGTTGCCTACAATTGAATTCCCAATAACCCTT -3 3- TAGCAACGGATGTTAACTTAAGGGTTATTGGGAA -5
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Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extradas, su nombre est dado segn el gnero y la especie de la bacteria de donde se aisl por primera vez esta enzima. La primera letra representa el gnero de la bacteria, las prximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un nmero al final indica la cantidad de
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- No permiten ejercer ningn control estricto sobre la posicin del corte respecto de la secuencia especifica de la molcula de DNA reconocida por la enzima. - Tienen actividad de restriccin (cortan) y modificacin (metilan). - Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea ro arriba o ro abajo. Las Tipo III cortan de 5-8 bases
2.
Tipo II:
- Slo tienen actividad de restriccin. - Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen. - generan una serie reproducible de fragmentos cuyas secuencias son predecibles si se
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EcoRI fue una de las primeras enzimas de restriccin aisladas . Los fragmentos de DNA producidos por digestin por esta enzima, tienen
5- ATCGTTGCCTACAATTG 3- TAGCAACGGATGTTAACTTAA
AATTCCCAATAACCCTT -3 GGGTTATTGGGAA -5
Lo que permite la soldadura de fragmentos de DNA rotos por la misma endonucleasa de restriccin
0.2 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.2 = 0.000324 O lo que es lo mismo, aproximadamente una cada 3086 nucletidos
1.
2.
Southern Blot. 3. Generacin de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en Southerny Northern blotting. 4. Generacin de fragmentos para ser subclonados en los vectores
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Factores que son crticos al trabajar con enzimas de restriccin y que pueden afectar la actividad de las mismas: 1. Pureza del DNA la reaccin de enzimas es muy dependiente de la pureza,
contaminantes como protenas, fenol, cloroformo, etanol, altas concentraciones de sal, etc. inhiben la endonucleasa. 2. Temperatura y pH las enzimas son muy sensitivas a temperatura y pH en DNAsas Las DNAsas degradan el DNA en presencia de Mg+. Contaminantes con carga (-). DNA contaminado con otro DNA. Grados de metilacin algunas endonucleasas son inhibidas por metilacin. Tipo de molcula de DNA si el DNA no tiene la secuencia que es reconocida
por la enzima accesible, esta no puede cortar el material gentico (ej. si el DNA est superenrrollado el lugar de restriccin no va a estar accesible para la enzima).
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Ligasas: unen molculas de DNA, sintetizando enlaces fosfodiester entre nucletidos ubicados en los extremos de dos molculas diferentes o en los dos extremos de una misma molcula.
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Una enzima que sintetiza DNA se denomina DNA polimerasa y una que copia una molcula existente de DNA o de RNA se denomina DNA polimerasa dependiente del molde
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DNA polimerasa I
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Fragmento Klenow
Fragmento Klenow
Debido a que la actividad exonucleasa 5' 3' de la DNA polimerasa I de E. coli la hace ineficaz para muchas aplicaciones, el fragmento Klenow, el cual carece de esta
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DNA polimerasa T4
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Transcriptasa inversa, transcriptasa reversa o retrotranscriptasa es una enzima de tipo ADN-polimerasa, que tiene como funcin sintetizar ADN de doble cadena utilizando como molde ARN monocatenario. Enzima presente en los retrovirus.
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Desoxinucleotidil transferasa terminal: es una DNA pol que realiza la sntesis de ADN utilizando slo una sola cadena de ADN - La mayora de las ADN polimerasas requieren de doble cadena de ADN como sustrato, en donde se utiliza el 5 ' 3' como un primer captulo y la cadena complementaria 3 ' 5' se utiliza como una plantilla.
Cataliza la adicin de nucletidos al extremo 3 'de una molcula de ADN. A diferencia de la mayora de las polimerasas de ADN no
La enzima desoxinucleotidil transferasa terminal se utiliza para crear extremos de cadena sencilla mediante la adicin de colas de nucletidos. Si a uno de los DNA se le aade una cola de poli-dA, y al otro DNA se le aade una cola de poli-dT, se forman colas complementarias, y los fragmentos pueden unirse mediante puentes de hidrgeno. Entonces, por ligacin, pueden formarse
molculas recombinantes.
Las molculas de DNA recombinante pueden formarse a partir DNA cortado con enzimas que dejan extremos romos. En este mtodo se utiliza la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal para crear colas complementarias mediante la adicin de fragmentos de poli-dA y de poli-dT. Estas colas sirven para unir el DNA de diferentes fuentes y para crear molculas de DNA recombinante, que son unidas covalentemente por tratamiento con la DNA ligasa.
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Tras el tratamiento con una endonucleasa, Como se pueden examinar los fragmentos de DNA resultantes?
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