INTRODUCCIN A LOS BIOPROCESOS

Parte II

Ingeniera Bioqumica I

. Evolucin y caractersticas de los bioprocesos . Introduccin a las operaciones de un proceso biotecnolgico . Seleccin de un proceso

Alejandra Bosch

SELECCIN DE UN PROCESO BIOTECNOLGICO

ASPECTOS QUE INTERVIEN EN LA SELECCIN DE UN PROCESO
A) ECONMICO

Relacionados con el mercado y especificaciones del producto Evaluar el potencial econmico del producto
B) TCNICO Relacionados con el diseo del proceso Desarrollar y evaluar varios esquemas de operacin para obtener el Diseo ptimo

DESARROLLAR UN DISEO COMPLETO DEL BIOPROCESO

Secuencia de operaciones de separacin El equipamiento requerido

Cules podran ser los productos de inters?

Productos

insulina, antibiticos, hormonas, enzimas

Procesos y servicios que emplean microorganismos

cervezas, vinos, vacunas, organismos para biorremediacin

Material biolgico de partida

Clulas animales

Clulas vegetales bacterias

Protenas Son las macromolculas biolgicas ms abundantes Se encuentran en todas las clulas y en todas partes dentro de las clulas Existen miles de diferentes tipos y tamaos de protenas Exhiben una gran cantidad diversidad de funciones de

Funcin biolgica de las protenas en bacterias

Funcin
Enzimas

Ejemplo
Hexoquinasas, isomerasas, hidrolasas

Transporte
Contrctiles Toxinas Estructurales

Ingreso de nutrientes en las bacterias

pilina (cilias y flagelos) Venenos, diftrica Recubrimiento viral, pared celular,

SELECCIN DE UN PROCESO BIOTECNOLGICO

ASPECTOS QUE INTERVIEN EN LA SELECCIN DE UN PROCESO
A) ECONMICO

Relacionados con el mercado y especificaciones del producto Evaluar el potencial econmico del producto
B) TCNICO Relacionados con el diseo del proceso Desarrollar y evaluar varios esquemas de operacin para obtener el Diseo ptimo

DESARROLLAR UN DISEO COMPLETO DEL BIOPROCESO

Secuencia de operaciones de separacin El equipamiento requerido

Especificaciones del material de partida y producto

1) ESPECIFIACIN DEL PRODUCTO: DEFINIR EL OBJETIVO FINAL (Start at the end) Definir el producto y su utilizacin: - producto final (cual es?, Cmo se usa?) - pureza requerida - rangos de concentracin de impurezas permitidas - alguna impureza que deba ser eliminada -Tioxicidad, estabilidad,

2) CARACTERSTICAS DEL MATERIAL DE PARTIDA -fuente: bacteria (E. coli) fermentacin cultivo de clulas (presencia albmina, suero , restos de membranaslevaduras (producto intracelular o extracelular?) -Caractersticas fisicoqumicas del material de partida ( viscosidad, tamao de partculas) y del producto final (pI, PM, estabilidad,)

SELECCIN DE UN PROCESO BIOTECNOLGICO

ASPECTOS QUE INTERVIEN EN LA SELECCIN DE UN PROCESO
A) ECONMICO

Relacionados con el mercado y especificaciones del producto Evaluar el potencial econmico del producto
B) TCNICO Relacionados con el diseo del proceso Desarrollar y evaluar varios esquemas de operacin para obtener el Diseo ptimo

DESARROLLAR UN DISEO COMPLETO DEL BIOPROCESO

Secuencia de operaciones de separacin El equipamiento requerido

A) ASPECTOS ECONOMICOS

Una vez definido El producto La pureza deseada La concentracin deseada

DEFINIR EL PROCESO

B) ASPECTOS TCNICOS

Definir las operaciones y secuencia de separacin Etapas o tiempo por operacin Escala Costo

PRODUCTO

PROCESO DE SNTESIS Y OPTIMIZACIN

Definir las operaciones y secuencia de separacin

Objetivo de este paso es explotar al mximo las propiedades fisicoqumicas que diferencian al producto deseado del resto de los productos contaminantes de la manera ms econmica

i) elegir entre OPERACIONES alternativas ii) diseo de una SECUENCIA PTIMA para obtener mximo rendimiento con el menor nmero de pasos
- Existen muchas alternativas y en diferente orden (es un problema de combinatoria)

Cules son las OPERACIONES alternativas?

1.-

2.-

3.-

5.-

1.- Remocin celular: Centrifugacin - filtracin 2. DISRUPCIN CELULAR Y SEPARACIN DE RESTOS CELULARES La tcnica ms recomendada para alta escala son los homogeinizadores (Gaulin homogenizer) - Homogeinizacin: - suspensiones celulares 15-20% (peso seco) - concentracin celular no afecta la eficiencia - es necesario refrigerar (4-5C) - Modelos ms grandes 6,000 L/h (levaduras y bacterias) -Molinos de perlas pequeas perlas de vidrio (0.3-0.4mm ) - diferentes diseos de agitadores - concentracin de clulas afecta la eficiencia concentracin ptima 30-60% peso hmedo modelos mas grandes 2000 L/h

-Ruptura qumica o enzimtica

limitado a baja escala (Lysozyme, Triton, otras)

-Separacin de restos celulares

-centrifugacin (no adecuada)

-ultrafiltracin (300,000 500,000 o mayor) -Microfiltracin (0.1 m.) -particin en dos fases acuosas (clulas rotas y restos quedan en la fase inferior) -CDR (cell Debris Remover: Whatman) 3. CONCENTRACIN

Los productos deben concentrarse hasta 10-50 veces.

Tcnica preferida : Ultrafiltracin - particin lquido-lquido. Extraccin con solventes - Precipitacin (sulfato de NH4) -Evaporacin - Destilacin

4.- PRETRATAMIETNO O EXTRACCIN DEL PRODUCTO

-Adsorcin
-Intercambio inico -Cromoatografa de intercambio hidrofbico

5.- PURIFICACIN DE ALTA RESOLUCIN

- Cromatografa de interaccin hidrofbica (HIC) -Cromatografa de intercambio inico de alta resolucin - Cromatografa de afinidad - Cromatografa metal quelante (IMAC) . Otras cromatografas: dye-ligand chromatography (triazine-colorante) 6. ACABADO esterilizacin y estabilizacin del producto deshidratacin, liofilizado, estabilizacin (sales)

PROCESO DE SNTESIS Y OPTIMIZACIN

i) elegir entre OPERACIONES alternativas

ii) diseo de una SECUENCIA PTIMA para obtener mximo rendimiento con el menor nmero de pasos
- Existen muchas alternativas y en diferente orden (es un probelma de combinatoria)

Cmo elegimos las operaciones y secuencias?

1. Solucin rigurosa o solucin algortmica Resuelve qu operaciones son apropiadas pero NO SECUENCIA 2. Utilizacin de las reglas de oro de la purificacin - Mtodo Heurstico.

Resuelve las OPERACIONES y la SECUENCIA

3. Uso de TECNICAS DE INTELIGENCIA ARTIFICIAL: SISTEMAS EXPERTOS (SE) utilizan el conocimiento emprico - escanean toda la informacin acerca de las propiedades de la muestra y las operaciones - toma en cuenta las reglas de oro de la purificacin - utilizan correlaciones matemticas y bases de datos Encuentran una solucin ptima al problema del proceso de purificacin y la secuencia

1.- Solucin rigurosa o solucin algortmica Utilizacin de mtodos numricos clsicos, ecuaciones de diseo. Resuelve el punto de OPERACIONES permitiendo elegir entre operaciones alternativas. Emplea tcnicas de programacin matemtica. Crean un diagrama de flujo que contiene todas las posibles alternativas de diseo

2. Utilizacin de las reglas de oro de la purificacin Mtodo Heurstico.

Resuelve OPERECIONES Y SECUENCIAS

Emplea reglas desarrolladas a travs Diseos previos y experiencia exitosas de otros procesos Antecedentes del mismo proceso Sentido comn

2. Utilizacin de las reglas de oro de la purificacin

REGLA 1 Elegir procesos de separacin basados en diferentes propiedades fsicas, qumicas o bioqumicas
REGLA 2 Separar las impurezas ms abundantes primero

Es importante eliminar el agua en las primeras etapas del proceso. Tratar de reducir el material de trabajo hasta un 90% del volumen inicial

REGLA 3 Seleccionar un procesos que permita aprovechar al mximo las diferencia entre las propiedades fisicoqumicas del producto y los contaminantes. - Se deben conocer las propiedades del producto y de las principales impurezas REGLA 4 Realizar las separaciones ms caras y difciles al final KEEP IT SIMPLE!

Ejemplo REGLA 1
REGLA 1 Elegir procesos de separacin basados en diferentes propiedades fsicas, qumicas o bioqumicas

Propiedades de las protenas a tener en cuenta en los proceso de separacin y purificacin

Propiedades fsico - qumicas Punto isoelctrico Carga, curva de valoracin Tamao, PM Especificidad por ligandos Propiedades de superficie (hidrofobicidad) Estabilidad

100
90 80 70 60

Caractersticas fisicoqumicas de las principales protenas de E. Coli

Distribucin de PM
70

Number of Proteins

50 40

30
20 60 10

Distribucin de PIs

50
0

20

40

60

80

100

120 140
M. W. s

160
Number of Proteins (x103) 40

30

20 10

5 pI

1 0

Operaciones de Separacin y Purificacin de protenas en gran escala Mtodos de Recuperacin y purificacin y las correspondientes propiedades fsicoqumicas involucradas en la operacin [*]
Operation Centrifugation Physico-chemical property Sedimentation Velocity

Filtration
Microfiltration Homogeneization

Particle size
Particle size Intracellular nature (pressure gradient)

Bead milling Ultrafiltration

Two phase extraction Precipitation Adsorption Ion-exchange Hydrophobic interaction Affinity chromatography

Intracellular nature (liquid/solid shear) Mol ecular size

Partition coefficient Solubility (hydrophobic interaction) Van der Waals forces, H bonds, polarities, dipole moments Charge (titration curve) Surface hydrop hobicity Biological affinity

Gel filtration

Molecular size
Hydrophilic and hydrophobic interactions

Reversed phase liquid chromatography

[*] Prokopakis and Asenjo (1990)

SINTESIS DE UN PROCESO DE BIOSEPARACIN aproximacin Heurstica

remocin del componente ms abundante
PASOS 1. Desarrollar un diagrama de bloques con las principales etapas 2. Seleccionar para cada etapa las operaciones alternativas tratando de emplear las reglas
Es muy importante la eleccin del PASO INICIAL, ya que es el que debe eliminar la mayora de los contaminantes. Los pasos subsiguientes son empleados para eliminar los contaminantes de menor importancia 1. SEPARACIN CELULAR

Intracelular

2. DISRUPCIN CELULAR

REMOCIN DE RESTOS CELULARES Y DESECHOS

Extracelular
3. CONCENTRACIN

4. PRETRATAMIENTO

5. PURIFICACIN DE ALTA RESOLUCIN

6 ACABADO

3. Uso de TECNICAS DE INTELIGENCIA ARTIFICIAL: SISTEMAS EXPERTOS (SE) utilizan el conocimiento emprico - escanean toda la informacin acerca de las propiedades de la muestra y las operaciones - toma en cuenta las reglas de oro de la purificacin - utilizan correlaciones matemticas y bases de datos Encuentran una solucin ptima al problema del proceso de operaciones y la secuencia

Base de datos. Conocimiento requerido para solucionar el problema especfico. Reglas de purificacin. Conocimiento emprico.
Motor deductivo. Es el programa que utiliza el conocimiento para tomar decisiones.

Permite la comunicacin entre el conocimiento y el programa.

Secuencia de operaciones en un proceso downstream y la comparacin entre varios mtodos de separacin en trminos de costos y eficiencia

Muestra la implementacin de dos criterios para seleccionar la mejor secuencia de operaciones para la purificacin de una mezcla simple de protenas y otra compleja (sobrenadante de cultivo) selection separation coefficient (SSC criterion) final level of purity (Purity criterion)

????

The design of downstream processes for large-scale protein purification

ii)

Escala de operacin

Ver la compatibilidad entre la operacin y la escala en la cual se va a disear Analizar el lmite que poseen las operaciones elegidas

iii)

Nmero de etapas

Debe considerarse en el diseo si los procedimientos seleccionados requieren de alguna etapa de regeneracin, elusin del producto deseado, etc

iii)
Costos fijos

Costos

costos de operacin

Gastos de planta administracin (impuestos) Investigacin y desarrollo