Anda di halaman 1dari 114

Enzimas

Son catalizadores: Reducen la energia de activacion de una reaccion mediante la creacion de un mecanismo alterno. Muchas enzimas son proteinas (otras no: eg. Ribonucleoproteinas) Estas macromoleculas se unen temporalmente a uno o mas sustratos de la reaccion que catalizan.

Importancia
Convierte Substratos en Productos
Aumentan velocidad de la reaccin hasta en 106 Son especficos incluso hasta

estereoespecficos
Pueden cambiar substratos aquirales a

productos quirales

Factores que afectan la accion enzimatica


pH
Temperatura Concentracion de enzima Concentracion de sustrato Inhibidores & activadores Fuerza inica del medio

ai f i Ci
concentration
Activity coefficient

ActivitiesFuerza inica y actividad termodinamica

0.51z 2 I log f z 1 I
Ionic strength
Charge on the ion

1 2

2 C z ii

Activacin de Zimgeno
Las enzimas que son sintetizadas en una forma inactiva se llaman proenzima o zimgeno.

Preproinsulin

Para activarse el zimgeno necesita de un cambio bioqumico en su estructura que le lleve a conformar un centro activo, mediante protelisis en un lugar especfico. El fragmento eliminado es llama pptido de activacin Esto regula la actividad de la enzima, al mantenerla en forma no-funcional hasta que se la necesite.

Algunos zimgenos conocidos: Tripsingeno. Quimotripsingeno. Pepsingeno. Protenas del sistema de coagulacin. Proelastasa. Prolipasa. Procarboxipolipeptidasas.

La actividad enzimatica es afectada dramaticamente por cambios en pH y Temperatura. Cada enzima trabaja mejor a cierta temperatura y pH

Su actividad disminuye fuera de cierto rango (de pH & Temp). Esto se debe a una alteracion en la estructura terciaria y a un cambio en las fuerzas nocovalentes (puentes-H, interacciones ionicas, etc.) Por ejemplo: La pepsina (proteasa del estomago) trabaja efectivamente a pH of 1-2 La Tripsina (proteasa del intestino delgado) no tiene actividad a pH bajo, pero es activa a pH = 8.

Cambios en pH afectan la ionizacion de aminoacidos (e.g., Asp, Lys) que pueden estar jugando un rol crucial en las uniones con sustratos. Por ejemplo, el pH afecta la ionizacion de los grupos aminos y carboxilicos de los aminoacidos Por otro lado, los puentes de hidrogeno son facilmente rotos (no son enlaces covalentes!) al aumentar la temperatura. Al reducirse el numero de estas interacciones, la conformacion de la enzima cambia y por lo tanto cesa su actividad.

Coenzimas y Cofactores y Grupos Prostticos


Son especies no protenicas asociadas a enzimas

Ayudan o son imprescindibles para la reaccin


Ciertas enzimas solo contienen aminoacidos y son

activas. Otras enzimas requieren de una especie


quimica para tener actividad.

- Si la especie es inorganica (ion: Fe2+, Mn2+, Mg2+, etc.) generalmente se lo llama cofactor.
Cofactores se unen a enzimas mediante interacciones ion-dipolo (forman complejos acido-base Lewis), o mediante dipolo-dipolo.

- Si la especie es organica generalmente se la llama coenzima. Estas son moleculas o iones ayudantes que facilitan una transformacion quimica.
Es decir, son agentes que llevan informacion quimica (eg: grupos) entre enzimas, y por lo tanto se unen debilmente a las enzimas.

Una enzima sin cofactor es llamada apoenzima, mientras que la enzima con su cofactor se la conoce como Holoenzima:

Apoenzima

cofactor Holoenzima

Grupos Prostticos
Cuando el cofactor o coenzima est fuertemente y permanentemente ligado a la enzima, se lo llama grupo prostetico

Centro Activo
Es una cavidad tridimensional, usualmente inaccesible al solvente. Contiene un centro catalitico y uno de union Esta formado por residuos (aas) responsables por la especificidad de la enzima, y residuos responsables por la accin catalitica. Los residuos cataliticos son donadores/aceptores de H+, o se unen a un cofactor.

Modelos
a) Lock & Key b) Induced fit.

Lock & Key.- Asume que el centro activo tiene la forma exacta de un sustrato especifico. Una vez que el sustrato se une a la enzima, no hay mas modificaciones (reordenamiento interno) Induced fit.- Asume que el centro activo es flexible y los residuos (aas) buscan el sustrato correcto. Cuando el sustrato se une al centro activo, nuevos cambios conformacionales ocurren.

Los sustratos se unen al centro activo a travs de puentes-H, interacciones hidrofobicas, enlaces covalente temporales, o una combinacion de todos estos, dando lugar al complejo enzima-sustrato. Una vez que la reaccion ha ocurrido en el centro activo, los productos son eliminados debido a interacciones no-covalentes no favorables o debido a efectos estericos.

Enzimas Alostericas
Enzima cuya actividad est regulada mediante un centro alostrico, que es un sitio, distinto del centro activo, al que se une un regulador (llamado regulador alostrico) de manera reversible. La unin de este regulador modifica la estructura tridimensional de la enzima y llega a afectar la configuracin del centro activo. Cuando el regulador incrementa la actividad de la proteina, se lo llama activador alosterico, mientras que si disminuye la actividad se lo llama inhibidor alosterico.

Regulacin alostrica

Efectos Alostricos: Efectos Homotrpicos: cuando los sitios son idnticos Efectos Heterotrpicos: cuando la unin de un ligando afecta la unin de otro sitio diferente: El efecto de BPG (Bifosfoglicerato) en la afinidad de la Hb por el O2

Isoenzimas (Isozimas)
Son enzimas que difieren en la secuencia de los aminoacidos, pero catalizan la misma reaccion quimica.

Se las identifica por diferentes parametros (e.g. KM) o diferentes propiedades reguladoras. Difieren en la sensibilidad al substrato, la velocidad de la reaccin o los sitios donde se utilizan

Clasificacion Internacional de Enzimas


En general se identifican 6 tipos de enzimas de acuerdo a su funcion (catalizan las siguientes reacciones): 1) Oxidacion-reduccion 2) Reacciones de transferencia de grupos 3) hidrolisis 4) Lisis no-hidrolitica y no-oxidativa 5) Isomerizacion 6) Reacciones de asociacion Es decir, estas son respectivamente:

1) Oxidoreductasas (deshidrogenasas) Catalizan las reacciones redox: L-lactato piruvato


L-2-hidroxipropanoato + NAD+ propanoato-2-ona

Una oxidacion requiere de un incremento en los atomos de oxigeno, o una disminucion en los atomos de hidrogeno. Una reduccion involucra un incremento en los hidrogenos o disminucion en los oxigenos. Oxidacion de alcanos: CH3CH3 (etano) CH3CH2OH (etanol) CH3COH (acetaldehide) CH3COOH (a. acetico)

Oxidoreductases

Histidine

2) Transferasas Catalizan las reacciones donde se produce la transferencia de un grupo funcional:

3) Liasas Catalizan en general la lisis de un sustrato y producen un doble enlace:

4) Hidrolasas Catalizan reacciones de hidrolisis:

5) Isomerasas Catalizan reacciones de isomerizacion:

6) Ligasas (sintetasas) Catalizan reacciones de sintesis (union de dos sustratos) y generalmente requieren de ATP:

Cinetica Enzimatica
Cuando una enzima cataliza una reaccion, el mecanismo involucra la formacion de un compuesto intermedio llamado complejo enzima-sustrato, ES

En una reaccion de un solo sustrato, la siguiente secuencia se observa ( representa un equilibrio)

E + S ES E + P

El primer paso es un equilibrio rapido. El segundo paso es la formacion de producto del complejo enzima-sustrato La enzima queda lista para volver a realizar otra reaccion.

Por que la Eact es reducida por la enzima?


Porque el estado de transicion (complejo ES) es mas estable (menos E) debido a efectos electrostaticos y/o dipolo-dipolo.

En general, la asociacion y disociacion del equilibrio son rapidas debido a que solo intervienen interacciones no-covalentes. El segundo paso involucra ruptura y formacion de enlaces, por lo tanto es el paso determinante.

Notese que no consideramos la reaccion inversa k-2 porque este tratamiento considera velocidades iniciales, donde [P] <<< [S]

Velocidad de una Reaccion Catalizada


Concentracion de Sustrato: La velocidad aumenta con el incremento de substrato (hiperbola) Llega a una vel. mxima (Vmax), a partir de la cual velrxn [S]0 El que la velocidad no pueda seguirse incrementando, refleja la saturacin del centro activo con el substrato.

Cuando [S] >> [E], cada molecula de enzima se une a un sustrato y se dice que la enzima est saturada de sustrato.

En esta condicion, la velocidad de reaccion depende solamente de [E].

Por lo tanto, en una reaccion enzimatica, la concentracion de enzima [E] tambien afecta la velocidad.

Cuando la enzima esta saturada, el incremento en [E] incrementara proporcionalmente la velocidad de reaccion.
Grafico indica que al duplicarse [E] bajo saturacion de S, la pendiente es mayor; por lo tanto v0 es mayor (v0 = vel inicial)

Grafico indica que al duplicarse [E] bajo saturacion de S, la pendiente es mayor; por lo tanto la vel inicial, v0, es mayor.

Inicialmente, [S] >> [E], por lo tanto el incremento hiperbolico se observa.


Sin embargo, ya que el mecanismo varia a lo largo de la hiperbola consideramos solo v0 , donde la Rxn es pseudo 1er orden en E. Por que? Porque la rxn esta inundada de S, por lo tanto la velocidad depende solo de E Es decir, v0 [E]

La velocidad de la reaccion total esta limitada por el paso ES E + P, ya que el equilibrio inicial es rapido.

La ley de la velocidad para este paso es:

vel = k2[ES]

Por cuanto [ES] es un intermedio, la ley de velocidad no puede expresarse en funcion de [ES], sino en funcion de [E] y/o [S].

Se asume que el sistema esta en un estado estacionario respecto al complejo ES, es decir, [ES]<<[E]<<[S]. Por lo tanto, la velocidad de desaparicion de ES expresada como cambio infinitesimal se aproxima a cero:

Es decir,

Agrupando terminos tenemos:

Y despejando [ES],

Ahora sustituimos [ES] en vel = k2[ES]

Igualmente,

Notese que en

Todas las constantes estan agrupadas. Aqui se define la constante de Michaelis-Menden, KM, como:

Que corresponde a

Anteriormente definimos,

Sustituyendo KM,

Cuantificando la cantidad total de enzima: [E0] = [E] + [ES] Donde [E0] = conc. Einicial = conc. Etotal [E] = conc. Elibre [ES] = conc. de complejo ES Por lo tanto la conc de Elibre es igual a [E] = [E0] - [ES]

Sustituyendo,

Ahora, reordenando esta ecuacion en varios pasos:

A continuacion, se elimina el denominador al multiplicar ambos lados por KM

Agrupando terminos y despejando [ES]

Ya que la ley de la velocidad fue definida como,

vel = k2[ES]
Sustituyendo [ES] queda,

PERO La velocidad maxima se observa cuando [S]>>[E], y se puede asumir que todo la enzima se encuentra como [ES]

Es decir, [E0] = [ES]


(la concentracion total de enzima es igual a la concentracion de complejo ES)

Reemplazando esta suposicion en la ley la velocidad:


vel = k2[ES] = velmax= k2[E0] Entonces, el termino, Vmax = k2[E0]

Ahora, reemplazando Vmax = k2[E0] dentro de

Resulta en

que es la ecuacion de Michaelis-Menten Y!?

Que sucede cuando la velocidad de la reaccion es justamente la mitad de la velocidad maxima?

Entonces,

Y dividiendo ambos lados para Vmax

Ambos Vmax desaparecen

Que es igual a

Finalmente,

Entonces, cuanto la velocidad de la reaccion es la mitad del maximo,

De aqui, el grafico

Pero que significa fisicamente? KM es un indicador de la afinidad de una enzima por cierto sustrato.

Por lo tanto, KM, es un parametro que define la tendencia de ES de asociarse y/o disociarse En KM, 50 % de los centros activos contienen sustrato: Cuando [S] = KM , [S]/(KM + [S]) = 0.5 Mientras mas elevado es el KM la enzima requiere mas sustrato.

Observacion importante:
La interpretacion cuantitativa del grafico hiperbolico (Michaelis Plot) es dificil: Vmax nunca se alcanza y por lo tanto KM solo se puede determinar aprox. Una mejor interpretacion y cuantificacion Vmax & KM se lo hace transformando la ecuacion de MichaelisMenden en una ecuacion lineal: Lineweaver-Burk plot (double reciprocal plot)

El Lineweaver-Burk plot se deriva de la ecuacion reciproca de la Michaelis-Menden; es decir, si

La reciproca es

Que se reordena en

Que es una ecuacion de una linea recta: y = mx+b

El plot - Lineweaver-Burk produce:

1/Vmax cruza al eje-y cuando x = 0 porque cuando la concentracin del sustrato es infinita, 1/ = 0
Es fcil encontrar KM ya que solo hay que determinar la interseccion con el eje-x

Limitaciones
- La regresion Lineweaver-Burk es muy sensible a errores y es adecuada solo en el rango de bajas concentraciones. porque

- Las transformaciones reciprocas distorcionan el error experimental; por lo tanto el grafico no es equivalente a una regresion lineal.

- Es decir, la regresion L-B no genera informacin exacta sobre Vmax & KM

- La

cinetica Michaelis-Menten (M-M) es una teora basada en la ley de accin de masa, que asume difusin libre y colisiones aleatoreas

Ojo: - Muchos procesos bioquimicos se desvan de la cinetica M-M).


Por ejemplo, el citoplasma no es un liquido, sino mas bien tiene una conducta de gel. En reacciones enzimaticas heterogeneas (membranas), la mobilidad del sustrato y enzima estan muy restringidas

En reacciones enzimaticas homogeneas, la mobilidad de la enzima tambien puede ser muy limitada (eg. Polimerasa del DNA se mueve a lo largo de la cadena del sustrato, en 2-D)

Las limitaciones en la mobilidad de las moleculas (y otras condiciones no-ideales) requieren de modificaciones a la cinetica de MM: cinetica fractal & enzimologia fractal.

kcat (turnover number)

La constante de velocidad del paso determinante es tambien llamada kcat ya que de esta define el nmero de moleculas de [S] transformadas a [P] por unidad de tiempo (turnover number)

Se calcula a partir de la velocidad mxima

Inhibicion Enzimatica
Inhibidores enzimaticos son moleculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad. Muchisimos farmacos (y pesticidas) son inhibidores enzimaticos La interaccion con un inhibidor puede evitar que un sustrato entre al centro activo detener la reaccion de catalisis

La interaccin con el inhibidor puede ser reversible o irreversible.

En general, la inhibicion irreversible ocurre cuando cierto agente reacciona con la enzima y produce cambios qumicos o estructurales
En general, la inhibicion reversible ocurre mediante interacciones no-covalentes.

La enzima ALDH-2 (aldehdo deshidrogenasa-2) es conocida por su capacidad para reducir el nivel de acetaldehdo, una molcula que se acumula con el consumo de alcohol y que es responsable de los sntomas causados por las resacas.

Un grupo de investigadores de EEUU ha demostrado ahora que un inhibidor de ALDH-2 hace que las ratas consuman menos cocana. El inhibidor acta indirectamente reduciendo la produccin y liberacin de dopamina (= euforia). (Nature Medicine, 24-08-2010)

Un inhibidor enzimatico es evaluado por su especificidad y su potencia (Kdis, que indica la concentracion necesaria para inhibir la enzima).

Una alta especificidad y potencia son indicadores de que el inhibidor (e.g. farmaco) tendra pocos efectos secundarios y/o toxicidad.
Algunos inhibidores enzimaticos tienen su origen en el organismo para regular el metabolismo,

Otros inhibidores naturales (metabolitos de hongos y bacterias) son venenos.

Inhibicion Reversible
Estas sustancias se unen a la enzima en forma nocovalente (puentes-H, atraccion electrostatica y fuerzas de London)
No sostienen cambios qumicos

Se remueven facilmente por dilucin o dialisis

Inhibicion Competitiva
El sustrato [S] y el inhibidor [I] compiten por el centro activo al poseer estructuras semejantes. La union de cada uno es estadistica y depende de la concentracion. Un exceso de [S] favorece la reaccion hacia los productos.

Usando el L-B plot, la inhibicion competitiva produce:

Inhibicion No-competitiva
El inhibidor se une con igual afinidad a la enzima y al complejo enzima-sustrato. Tambin se le llama inhibicion mixta.

The effect of noncompetitive inhibitor cannot be overcome with high substrate concentration. A noncompetitive inhibitor reduces the reaction rate at all substrate concentrations.
The Michaelis-Menten equation for noncompetitive inhibition is:

And the L-B plot has the form:

Usando el L-B plot, la inhibicion no-competitiva produce:

Inhibicion Anticompetitiva
Es poco comun. En estos casos [I] se une al complejo [ES] en forma reversible.

Observacin: 1) Cuando una enzima tiene multiples sustratos,


los inhibidores presentan diferentes tipos de inhibicion dependiendo que sustrato se considera:
Para multiples sustratos, la enzima puede poseer varios centros activos o varios centros cataliticos dentro del centro activo uno para cada sustrato.

2) Los graficos de Lineweaver-Burk son tiles para estimar KM y Vmax para la inhibicion enzimatica reversible.
Sin embargo las constantes de disociacion Ki (Keq para la formacion de [EI] y/o [ESI]), solo se pueden determinar con exactitud usando metodos de regresion no-lineales.

3) El diseo de frmacos usa de base molculas con estructura similar al estado de transicion del paso de catlisis.

Agonista: Se une a un receptor y tiene la misma funcin (imita) que el ligando natural. Por lo tanto tiene un efecto biolgico similar.
Antagonista: Compiten con el ligando natural y actuan como inhibidores reversibles competitivos, no-competitivos, e irreversibles.

Ritonavir, a protease inhibitor containing three peptide bonds. As this drug resembles the protein that is the substrate of the HIV protease, it competes with this substrate in the enzyme's active site.

Casos Especiales
En ciertas enzimas, se observa inhibicion por sustrato o inhibicion por producto; y esta inhibicion depende de la concentracion de [S] o [P] (feedback enzyme regulation).

(ii) En ciertos casos, un inhibidor reversible se convierte en irreversible (aun sin interaccion covalente!). Esto sucede en, Slow-tight inhibition cuando el complejo [EI] se isomeriza a un complejo ms estable (mayor fuerza en los enlaces) [EI*].

En estos casos, la cinetica tradicional de M-M da valores erroneos.

Inhibicion Irreversible
El agente a menudo contienen grupos funcionales electrofilicos reactivos: contienen el grupo carbonilo, C=O, que reacciona con grupos nucleofilicos, como el extremo amino, hidroxi o sulfidrilo de aas.

La inhibicion irreversible es diferente de la inactivacion irreversible. La primera es especfica y no es general para todas las enzimas; la segunda ocurre cuando hay destruccion de la estructura cuaternaria y generalmente es general para todas las enzimas (pH, calor, etc.)

Industrial Application of Enzymes


4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 1960 1970 1980 1990 2000 2006 Year Value of industrial enzymes

Value (million US$ )

Enzyme Immobilization
Advantages: increased stability to temperature and pH not effected by products or other pollutants not flushed away

Disadvantages Distorting enzyme within constrained conformation Partitioning of the enzyme within the support If substrates or products are insoluble.

Enzyme non-covalently adsorbed to an insoluble particle


Ion exchangers; porous carbon; clays; hydrous metal oxides; polymeric aromatic resins

E
E

Insoluble particle E

Enzyme covalently attached to an insoluble particle


E
Sepharose (CNBr); chloroFormates; carbodiimides; glutaraldehydee

Enzyme non-covalently adsorbed to an insoluble particleIon exchangers; porous carbon;


E
clays; hydrous metal oxides; Polymeric aromatic resins

E
Insoluble particle

Enzyme covalently attached to an insoluble particle E


Sepharose (CNBr); chloroformates; carbodiimides; glutaraldehydee

Enzyme entrapped within an insoluble particle by a porous cross-linked polymer


Gels; fibres

Cross-linked polymer

E E

Enzyme confined within a semipermeable membrane.


E
Allow substrate in and product Out but impermeable to enzyme.

Semipermeable membrane

Enzyme entrapped within an insoluble particle by a Porous cross-linked polymer


Gels; fibres

Cross-linked polymer

E E

Enzyme confined within a semipermeable membrane.


Allow substrate in and product

out but impermeable to enzyme.

Semipermeable membrane

OH

OH

CNBr
Cyanogen bromide

O CN OH

Sepharose

O CNH OH

E NH2

O CN O

E
Immobilised enzyme on Sepharose

OH

OH

CNBr

O CN OH

O CNH OH

E NH2

O CN O

E
Immobilised enzyme on Sepharose

OH

OH

CNBr

O CN OH

O CNH OH

E NH2

O CN O

E
Immobilised enzyme on Sepharose

The maximum binding capacity of an enzyme

the electrostatic charge distribution

the hydrophobic-hydrophilic balance between immobilised support and enzyme

E
the number of potential coupling sites in the enzyme

surface density of binding sites on the immobilised medium

the surface area available for the enzyme

Entrapment of the enzyme in artificial liposomes or synthetic microspheres


Liposomes are polymeric nanoparticles with various targeting ligands attached to their surface allowing for their surface-attachment and accumulation in pathological areas for treatment of disease.

Cellulose/starch Bread Dairy industry

Biscuits
Flour

Food/drink Enzymes
High fructose, glucose and maltose syrups Fruit juice

Sucrose Brewing
Meat

Cheese

Anaerobic Digestion
Proteins

Complex organic matter

Carbohydrates

Lipids

Protease s

Glucosidase s

Lipase s

Hydrolysis

Soluble organic molecules

Amino acids

Monosaccharides

Fatty acids Glycerol Acidogenesis

Volatile fatty acids Acetogenesis

Biogas

CH3COOH

H2; CO2

Methanogenesis CH4; CO2

Aerobic Digestion
O2

Disadvantage: large amounts of biosolids containing volatiles, nutrients, pathogens, metals, toxic chemicals

Bioleaching
Role of enzymes in bioleaching associated with Au, Cu, Cd, etc.
Cu (II)
Outer Membrane

CopA

CopB

CopY CopZ

Periplasm

CopC Cu (II) CopD

ATPases
CopD Cu (I)

Inner Membrane

Cupric Reductas e

Cu (II)

NADH

NAD+

Tsivlovskii et al, J Biol Chem. 2002; 277(2); 976-983.

Enzyme/substrate function design

Theory Refine theory

Computational Modelling

Experimental validation

Hypothesis

Bioinformatics/Computational Biology
Use: Applied mathematics Statistics Computer science Chemistry/Biochemistry to solve biological problems at molecular level

Sequence & protein sequence alignment Genome assembly Protein structure alignment Gene expression

Enzymes as therapeutic agents


Enzyme Asparaginase Collagenase Glutaminase Hyaluronidase Lysozyme Rhodanase Ribonuclease Use Leukaemia Skin ulcers Leukaemia Heart attack Antibiotic Cyanide poisoning Antiviral

b-Lactamase Streptokinase Trypsin Uricase Urokinase

Penicillin allergy Blood clots Inflammation Gout Blood clots