Ligamiento y Recombinación

Ligamiento y mapas genticos
Dr. Antonio Barbadilla
Tema 5: Ligamiento y mapas genticos
Objetivos tema 5: Ligamiento y cartografa gentica (mapas)

Debern quedar bien claros los siguientes puntos
Los conceptos de ligamiento, recombinacin y entrecruzamiento Cmo calcular las frecuencias de recombinacin en loci ligados Construccin de mapas genticos a partir de cruzamientos pruebas de 2 y 3 factores (puntos) Interferencia y coeficiente de coincidencia Demostracin citolgica del entrecruzamiento Anlisis de ttradas en hongos ascomicetos Recombinacin mittica Cartografa gentica en humanos
Ligamiento y recombinacin en bacterias y virus

2
Ligamiento: Asociacin de genes en el mismo cromosoma formando grupos de ligamientos

Ligamiento total A A a a B B b b a a A A B
B
b
Genotipo F1
AB / ab
b Gametos (100% gametos parentales) 50 % AB 50 % ab Tema 5: Ligamiento y mapas genticos 3
Segregacin independiente (no ligamiento, 2a ley de Mendel) gametos

Genotipos F1 A B -- -a b
A A a a B B b b
AB
A A
B B b b
Ab
A A
aB
a a
50% recombinanB tes B
ab
a a
b b
Proporcin 1:1:1:1
Mensaje: La frecuencia de gametos recombinantes (FR) debe estar entre el ligamiento total (0%) y la segregacin independiente (50%) 0% FR 50%
Ligamiento:
Descubrimiento del ligamiento (Morgan con mutantes de Drosophila melanogater)
Mutantes de Drosophila melanogater

Estudio del ligamiento con mutantes
+: salvaje Cy: Curly sd: scalloped
+: salvaje
ap: aptera vg: vestigial dp: dumpy
w: white
sepia
Bar
D: Dichaete
7
c: curved
Ligamiento:
Simbolismo del ligamiento Configuracin en acoplamiento o cis -> AB/ab Configuracin en repulsin o trans -> Ab/aB Prueba de ligamiento: desviacin de la proporcin 1:1:1:1 en un cruzamiento prueba de un dihbrido
Grupos de ligamiento en Drosophila
Ligamiento a nivel del DNA

Haplotipo
10
10
Cruzamiento prueba:
Genotipos P AA BB AB Aa Bb Gametos AB aa bb ab X ab Aa Bb A- Baa bb Cruzamiento prueba
Gametos P
F1
Ab aB
ab
Aa bb aa Bb aa bb
A- bb aa Baa bb
11
Tema 5: Ligamiento y mapas genticos 11 Fenotipos Genotipos
Mensaje: El cruzamiento prueba permite inferir las proporciones de los gametos que se forman en el doble heterocigoto
12
12
Recombinacin: la generacin durante la meiosis de genotipos haploides distintos de los genotipos parentales
Gametos P AB ab
F1
Aa Bb
AB Gametos
ab Ab
aB
Gametos parentales Gametos recombinantes

Tema 5: Ligamiento y mapas genticos 13
13
Recombinacin:
Recombinacin intercromosmica: genes (loci) en diferentes cromosomas (leyes de Mendel)

Genotipos F1 A B -- -a b
A A a a B B b
AB Ab aB
A A
A A a a a a
B
B
b
b B B b b
50% recombinantes
ab
Recombinacin intracromosmica: genes situados en el mismo cromosoma ---> Tema 5: Ligamiento y mapas genticos Entrecruzamiento
14
Proporcin 1:1:1:1
14
Entrecruzamiento (Crossover): El
intercambio de cromtidas no hermanas entre cromosomas homlogos durante la meiosis por un proceso de rotura y reunin del DNA
Cromosomas en la meiosis
Meiosis sin entrecru zamiento entre los genes Meiosis con entrecru zamiento entre los Dr. Antonio Barbadilla genes
15
Productos meiticos
A A a a B B b b
A A a a
B B b b
A A a a
B B b b
A A a a
B b B b
Recombinantes
15
Meiosis y entrecruzamiento
16
16
Entrecruzamiento visto mediante microscopa electrnica
17
17
Entrecruzamiento visto mediante microscopa electrnica
18
18
Entrecruzamiento en el nivel del DNA
19
19
Migracin ramal
20
20
Cartografa gentica:
La cartografa gentica asigna el lugar cromosmico de un gen (o locus) y su relacin de distancia con otros genes (o loci) en un cromosoma dado
A. Sturtevant (1913). La distribucin y el orden lineal de los genes se pueden establecer experimentalmente mediante el anlisis gentico
21
21
Supuesto: las frecuencias de entrecruzamiento, y por tanto la frecuencia de recombinacin, depende de la distancia entre genes
A B C
Unidad de distancia: La unidad de mapa (u.m.) o el centimorgan (cM) --> La distancia entre genes (loci) en los Tema 5: Ligamiento y mapas genticos 22 que la frecuencia de recombinacin es del 1% 22
Meiosis 1
23
23
Mayor distancia entre loci --> Mayor nmero de entrecruzamientos Ms Entrecruzamientos ---> Ms Recombinacin A mayor frecuencia de recombinacin mayor la distancia entre loci
El nmero de etrecruzamientos por meiosis y por cromosoma se puede representar por una distribucin aleatoria de Poisson, con media
e f (i ) i!
24
1 FR (1 e ) 2 ln(1 2 FR)
24
Mapa a partir de cruzamientos prueba de dos puntos (dos loci en el mismo cromosomas)
Se determina la distancia 2 a 2 entre loci y stas se suman para estimar la distancia gentica total de un cromosoma A B
25
25
Experimento de Morgan pr = Ojos Prpura vg = Alas vestigiales Ambos alelos son recesivos respecto al salvaje P F1 pr+ pr+ vg+ vg+ X pr pr vg vg pr+ pr vg+ vg X Fenotipos F 2 pr+ vg+ pr vg pr+ vg pr vg+
Ejemplo:
pr pr vg vg
26
1339 1195 151 154 ____ 2839
26
Metodologa
Normalmente heterocigoto X homocigoto recesivo (cruzamiento prueba) -> AB/ab X ab/ab No se observa en la F2 la proporcin fenotpica 1:1:1:1, y la proporcin no es predecible a priori porque depende de la distancia entre los genes estudiados Las dos clases mayoritarias corresponden a los gametos no recombinantes (parentales), y las minoritarias a los recombinantes (no parentales) La frecuencia de recombinacin (recombinantes/total X 100) refleja la distancia gentica entre los dos genes. Una unidad de mapa o centimorgan (1cM) = 1% de recombinantes Se ordernan tres genes cuyas distancias se han medido dos a dos
27
Fenotipos F 2 pr+ vg+ pr vg pr+ vg pr vg+ 1339 1195 151 305 154 ____ 2839
Proporcin no 1:1:1:1. Un test de 2 es muy significativo FR = 305/2839 = 0,107 = 10,7 cM pr

vg
28
10,7 cM Tema 5: Ligamiento y mapas genticos
28
Orden de los genes

Se han estudias tres pares de genes y estas son las distancias entre ellos: distancia A-B = 12; distancia B-C = 7; y distancia A-C = 5
Cul es el orden de los genes? Las distancias deben ser aditivas y consistentes entre s
Supongamos las tres ordenaciones posibles
29
29
Orden de los genes

Ordenaciones posibles Caso 1: Marcador A est en el medio: B B 7
12
A A C
Caso 2: Marcador B est en el medio: A B B 12 A C 5 Caso 3: Marcador C est en el medio: A A

12 C
B 7 Aditividad
30
30
Las distancias de mapa no son completamente aditivas

A B C
FR = x A
FR = y C
FR < x + y
25,4 La mejor estima distancia, suma (b-pr) + (pr-c)
b 5,9 pr
19,5
31
Tema 5: Ligamiento y mapas genticos 31 23,7 Distancia experimento dos puntos b-c
Relacin entre frecuencia de recombinacin y entrecruzamiento (o distancia real de mapa)

Las distancias de mapa no son completamente aditivas porque los dobles recombinantes entre dos marcadores A y C no se detectan en un cruce de dos puntos, subestimndose la distancia A y C
A A a a
B b B b
C C c c
La relacin entre la distancia real de mapa (nmero de entrecruzamientos) y la frecuencia de recombinacin entre dos marcadores o loci no es lineal. Cuanto ms lejos estn los marcadores peor es la estima La frecuencia de recombinacin (FR) entre dos marcadores no puede superar el 50% Dr. Antonio Barbadilla FR 0,5
32
Funcin de mapa
Es una funcin que permite estimar la distancia de mapa mejor que empleando solamente la frecuencia de recombinacin, pues corrige los intercambios (entrecruzamientos) no detectados
50
FR observada (%)
40
30
20 10
1 FR (1 e ) 2
=1 =2 =3 =4
Nmero medio de entrecruzamientos por meiosis

Zona de linealidad 33
50 100 150 200 Tema 5: reales Ligamiento y mapas genticos Unidades de mapa
33
Por qu la frecuencia de recombinacin (FR) entre dos marcadores no puede superar el 50%?
Demostracin 1: Muchos entrecruzamientos entre a y b
Es igual de probable cualquier combinacin, ++, ab, a+, +b, es como si segregaran independientemente ambos loci. Luego, la FR mxima es 50% Tema 5: Ligamiento y mapas genticos 34
34
Por qu la frecuencia de recombinacin (FR) entre dos marcadores no puede superar el 50%?
Demostracin 2: caso completo para 1 2 entrecruzamientos
FR promedio de un doble entrecruzamiento = 8/16 = 50%

35
Mapa a partir de cruzamientos prueba de tres puntos (tres loci en el mismo cromosomas)
Metodologa
Triple heterocigoto X homocigoto recesivo (cruzamiento prueba) -> ABC/abc X abc/abc Si hay ligamiento, no se observa en la F2 la proporcin fenotpica 1/8 para cada tipo de gameto Se agrupan las clases recprocas (aquellas que tienen un fenotipo mutante en el par recproco, como el par de fenotipos fenotipos ABC-abc Abc-aBC. Las clases recprocas deben ser de frecuencia parecida Orden de los genes: Los fenotipos no recombinantes (parentales) son los ms frecuentes Los fenotipos menos frecuentes resultan de un doble entrecruzamiento Al comparar los fenotipos no recombinantes con los doble entrecruzados, el gen del medio es el que est cambiado Dr. Antonio Barbadilla Distancias de mapa: a la distancia entre genes consecutivos debe Tema 5: Ligamiento y mapas genticos 36 sumarse las frecuencias de los dobles entrecruzamientos 36
Tres mutantes marcadores b = Cuerpo negro; pr = Ojos Prpura; c = curved, alas curvadas Los tres alelos son recesivos respecto al salvaje P F1 b+ b+ pr+ pr+ c+ c+ X bb prpr cc b+b pr+ pr c+ c X bb pr pr vg vg
Si no estn ligados 1/8 bb prpr cc 1/8 bb prpr c+c F2 1/8 bb pr+pr cc 1/8 bb pr+pr c+c 1/8 b+b prpr cc 1/8 b+b prpr c+c Dr. Antonio Barbadilla 1/8 b+b pr+pr cc + + + 37 1/8 b b pr pr c c Si estn ligados 1/2 bb prpr cc 1/2 b+b pr+pr c+c
Ejemplo:
37
Resultados del cruzamiento prueba, F2

Fenotipo Genotipo Nmero Nmero de recombinantes entre b-pr pr-c b-c
Salvaje Black, purp, cur Purp,curved Black Curved Black,purp Purp Black,curved
b+b pr+pr c+c bb prpr cc b+b prpr cc bb pr+pr c+c b+b pr+pr cc bb prpr c+c b+b prpr c+c bb pr+pr cc
5701 5617 388 367 1412 1383 60 72
388 367 60 72
1412 1383 60 72 2927

19,5%
388 367 1412 1383
Total
Porcentaje
15 000
887
5,9%
3550
23,7%
38
El gen pr est en el medio

38
Tetrada meitica
Entrecruzamiento entre b y pr
Gametos
b b b+ b+
pr pr pr+ pr+
c c c+ c+
b b b+ b+
pr pr+ pr pr+
c c+ c c+
Doble entrecruzamiento en la regin b-pr-c
b b b+ b+
pr pr pr+ pr+
c c c+ c+
b b b+ b+
pr pr+ pr pr+
c c c+ c+
39
39
Mapa gentico de los marcadores
La mejor estima distancia entre los extremos es la 25,4 suma (b-pr) + (pr-c)
b 5,9 pr
19,5
23,7
Distancia b-csin considerar los dobles recombinantes
40
40
Coeficiente de coincidencia: mide si los entrecruzamientos son independientes entre s Si los mltiples entrecruzamientos suceden independiemente los unos de los otros, la frecuencia de los dobles entrecruzamientos ser al producto de la frecuencia de los intercambios sencillos Coeficiente coincidencia (CC) = (nmero de dobles entrecruzamientos observados)/(nmero de dobles entrecruzamientos esperados) Si CC < 1, dobles disminuidos Si CC > 1, dobles incrementados Interferencia: 1 - CC
41
41
Mapa de ligamiento parcial de los 4 cromosomas de Drosophila melanogaster
42
42
Mapas genticos (de recombinacin) versus mapas fsicos
43
43
Importancia mapas de recombinacin
Describir Ias tasas de recombinacin a lo largo del genoma Predecir la transmisin gentica de un gameto Localizacin de genes que influyen el fenotipo (QTLs) Marco de referencia para cartografa fsica Marco de referencia para la cartografa de genes asociados a enfermedades Tema 5: Ligamiento y mapas genticos 44
44
Mapas genticos versus mapas fsicos

Frecuencia de recombinacin por unidad de DNA
Especies Tamao haploide Unidades de mapa del genoma
Tamao de la unidad mapa
Distancia media entrecruzamientos consecutivos 1.0 x 104 pb 1.2 x 105 pb 2.5 x 105 pb 1.3 x 106 pb 1.2 x 107 pb 2.5 x 107 pb 9.0 x 107 pb 6.0 x 107 pb 3.5 x 107 pb
Fago T4 1.6 x 105 pb E. coli 4.2 x 106 pb Levadura 2.0 x 107 pb Hongo 2.7 x 107 pb Nemtodo 8.0 x 107 pb Mosca de la fruta 1.4 x 108 pb Ratn 3.0 x 109 pb Humanos Varn 3.3 x 109 pb Mujer 3.3 x 109 pb
800 1750 4200 1000 320 280 1700 2809 4782
200 pb 2400 pb 5000 pb 27000 pb 250000 pb 500000 pb 1800000 pb 1200000 pb 700000 pb
45
45
Anlisis de ttradas
Los hongos ascomicetos retienen los cuatro productos haploides de cada meiosis en un saco denominado asca
46
46
Hongos ascomicetos
Estos organismos son nicos porque se puede analizar meiosis individuales, permitiendo estudiar aspectos bsicos de la gentica de la meiosis (un proceso central de la biologa de los eucariotas) Cartografiar los centrmeros como si fuesen loci Investigar la posibilidad de interferencia de cromtida Examinar los mecanismos de entrecruzamiento
Ustigalo hordei Neurospora Aspergillus Coprinus (basidio nidulans crassa Lagopus Ascobolus miceto) (basidiomiceto) immersus Saccharomyces cerevisiae
Ttradas
Octadas
Ttradas Octadas
No ordenadas
Patrones distintos de ascosporas y ascas en Lineales Neurospora Tema 5: Ligamiento y mapas genticos 47
47
Meiosis y mitosis postmeitica en la ttrada lineal de Neurospora
48
48
Distancia de un locus al centrmero en Neurospora

No recombinacin entre el locus y el centrmero
4:4
49
49
Recombinacin entre el locus y el centrmero
2:2:2:2
50
50
Distancia de un locus al centrmero: estmese el porcentaje de
ttradas que muestran patrones de segregacin en la segunda divisin para ese locus y divdase por 2
Patrones MII = 9 + 11 + 10 + 12 = 42 o sea 14% Puesto que slo la mitad de los cromosomas que sufren entrecruzamiento son Dr. Antonio Barbadilla recombinantes, la distancia de mapa (medida como frecuencia de Tema Ligamiento y mapas genticos 51 recombinacin) ser 14/2 = 7 unidades de mapa 5:cM
51
Demostracin citolgica del entrecruzamiento
Tcnica de cromosomas arlequinados

Demuestra el intercambio de cromtidas Coincidencia entre quiasma y lugar de intercambio La existencia de recombinacin mittica
52
52
Retinoblastoma hereditario por entrecruzamiento mittico
53
53
Retinoblastoma hereditario por entrecruzamiento mittico

R R
r
r R r R r
Mitosis
R R
Clula normal R/R
r r
Clula retinoblastoma r/r

54
Cartografa en humanos
Mapas genticos (de recombinacin)
Herencia ligada al cromosoma X Marcadores polimrficos asignados a colecciones de familias (CEPH). alozimas DNA (RFLPs, microsatlites, RAPDs,...) La caza de genes asociados a enfermedades
Mapas fsicos
Mtodos especiales de cultivo celular: hibridacin de clulas somticas Hibridacin in situ de sondas de DNA en cromosomas metafsicos Secuenciacin del DNA
55
55
Cartografa gentica en humanos

Estudios familias Herencia ligada al cromosoma X marcadores clsicos Autosmicos marcadores clsicos
Cartografa marcador-enfermedad
La caza de genes asociados a enfermedades
Cartografa marcador-marcador
Estudios marcadores polimrficos asignados a colecciones de familias (CEPH). DNA (Microsatlites, RFLPs, RAPDs,...)
56
56
Mapa gentico de alta resolucin del Cromosoma 1 Homo sapiens.

The Cooperative Human Linkage Center
http://lpg.nci.nih.gov/CHLC/
57
57
Cartografa a travs de la herencia ligada al cromosoma X (359 loci se han asignado al X)
Xg Protena grupo sanguneo Ictiosis (un efermedad de la piel) Albinismo ocular Angioqueratoma (crecto celular) Centrmero Fosfoglicerato-quinasa Alfa-galactosidasa Xm Deutan (ceguera color rojo-verde) G6PD Protano (ceguera color rojo-verde) Hemofila A
58
58
Ligamiento y recombinacin en bacterias y virus
Procesos sexuales en bacterias y virus: Transformacin, conjugacin, transduccin y sexduccin en bacterias y recombinacin vrica Conjugacin Ciclo biolgico de fagos
59
59
Procesos sexuales en bacterias y virus

Transformacin
Proceso sexual: combinacin del material gentico de dos individuos distintos
Conjugacin
Recombinacin vrica Transduccin
Sexduccin
60
Incorporacin del material gentico por transformacin
Se requiere un doble entrecruzamiento para la transformacin Ejemplo del uso de la fecuencia de transformacin para estimar distancias genticas: Una cepa his+ met+ se transforma con his- met34 hist- met+ Distancia entre ambos genes = 28 hist+ met194 hist- met- (transformantes sencillos/total transformantes) = (34 + 28 )/(34 + 28 + 194) = 0,24
61
Conjugacin bacteriana
62
62
Cintica conjugacin bacteriana
63
63
Conjugacin, recombinacin y mapas
64
64
Mapa bacteriano por conjugacin.
Unidades en minutos
65
Virus bacterifagos: Fase ltica o infecciosa Fase lisognica (la bacteria o husped lisognico y el fago temperado)
66
66
Virus bacterifagos:
67
67
Transduccin:
Especializada o restringida Generalizada
Recombinacin bacteriana por transduccin

68

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Tema 5: Ligamiento y mapas genticos

Objetivos tema 5: Ligamiento y cartografa gentica (mapas)

Ligamiento y recombinacin en bacterias y virus

Tema 5: Ligamiento y mapas genticos

Ligamiento: Asociacin de genes en el mismo cromosoma formando grupos de ligamientos

b Gametos (100% gametos parentales) 50 % AB 50 % ab Tema 5: Ligamiento y mapas genticos 3

Segregacin independiente (no ligamiento, 2a ley de Mendel) gametos

50% recombinanB tes B

Tema 5: Ligamiento y mapas genticos

Tema 5: Ligamiento y mapas genticos

Descubrimiento del ligamiento (Morgan con mutantes de Drosophila melanogater)

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Mutantes de Drosophila melanogater

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Tema 5: Ligamiento y mapas genticos

Grupos de ligamiento en Drosophila

Dr. Antonio Barbadilla

Tema 5: Ligamiento y mapas genticos

Ligamiento a nivel del DNA

Dr. Antonio Barbadilla

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Tema 5: Ligamiento y mapas genticos 11 Fenotipos Genotipos

Tema 5: Ligamiento y mapas genticos

Gametos parentales Gametos recombinantes

Recombinacin intercromosmica: genes (loci) en diferentes cromosomas (leyes de Mendel)

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Entrecruzamiento visto mediante microscopa electrnica

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Entrecruzamiento visto mediante microscopa electrnica

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Entrecruzamiento en el nivel del DNA

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1339 1195 151 154 ____ 2839

Tema 5: Ligamiento y mapas genticos

Dr. Antonio Barbadilla

Proporcin no 1:1:1:1. Un test de 2 es muy significativo FR = 305/2839 = 0,107 = 10,7 cM pr

10,7 cM Tema 5: Ligamiento y mapas genticos

Orden de los genes

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Tema 5: Ligamiento y mapas genticos

Orden de los genes

Caso 2: Marcador B est en el medio: A B B 12 A C 5 Caso 3: Marcador C est en el medio: A A