Manipulasi Ekspresi Gen

TUJUAN KLONING GEN

Memperoleh produk gen target (protein)Slide 5 DNA sisipan translasi replikasi, transkripsi, PROTEIN

Kloning ke dalam VEKTOR EKSPRESI VEKTOR Slide 3

Slide 6

Vektor Kloning

KLONING GEN

Slide 4

KLONING GEN (lanjutan)

Slide 2

Slide 2

Keberhasilan ekspresi gen ?

Kebutuhan komersial ?

Dipengaruhi oleh bbrp faktor Slide 2

Diperlukan manipulasi ekspresi gen
Slide 7

ORGANISASI GEN PROKARIOT

5
3 PROMOTOR
RBS CODING SEQUENCE KODON STOP

3 5

INISISASI KODON TRANSKRIPSI START

TERMINATOR

KOMPONEN: TRANSKRIPSI : promotor, terminator, situs inisiasi transkripsi TRANSLASI : RBS, kodon start, kodon stop
Slide 11

VEKTOR
Secara garis besar, vektor terbagi atas: Vektor kloning Vektor ekspresi : komponen vektor kloning + promotor + RBS Vektor shuttle : vektor yang bisa tumbuh di dua jenis sel inang, memp.dua ori yang dikenali sel inangnya, cth : bakteri & ragi
Slide 9

Vektor Ekspresi

Vektor kloning

Vektor ekspresi
Slide 10

KOMPONEN LAIN VEKTOR EKSPRESI

MULTIPLE CLONING SITE (MCS) MARKA SELEKSI

URUTAN NUKLEOTIDA PENGKODE UNTUK MEMPERMUDAH PEMURNIAN PROTEIN REKOMBINANSlide 23

Slide 2

KOMPONEN REGULASI
Promotor Terminator RBS Untuk tujuan ekspresi : promotor, RBS, Terminator KUAT
Slide 12

HARUS DIKENALI OLEH SEL INANG

PROMOTOR, TERMINATOR & RBS

Kekuatan promotor : efisiensi inisiasi transkripsi Promotor kuat Terminator kuat Kekuatan RBS RBS kuat : frekuensi transkripsi tinggi : transkripsi segera berhenti ketika mencapai terminator : efisiensi translasi : efisiensi translasi tinggi Kekuatan terminator : efisiensi terminasi transkripsi

Slide 13

ORF HARUS TETAP DIPERTAHANKAN

MalE--- ATC GAG GGA AGG TTT TTA GTT GCT GAT C--Ile Glu Gly Arg Phe Leu Val Ala Asp

MalE--- ATC GAG GGA AGG TTT TAG TTG CTG ATC ---

Ile

Glu Gly Arg

Phe Stop

Slide 14

Slide 15

REGULASI DNA SISIPAN

Penggunaan promotor kuat

Protein rekombinan yang dihasilkan dapat toksik terhadap sel Ekspresi gen perlu diregulasi Penggunaan promotor yang diregulasi Slide 17

Slide 29

CONTOH PROMOTOR YANG DIGUNAKAN PADA VEKTOR EKSPRESI

Slide 18

REPRESOR & INDUCER

Slide 16

VEKTOR EKSPRESI
Senyawa penginduksi :

IPTG (analog laktosa)

Slide 19

Slide 23

Regulasi operon lac pada plasmid pET

Slide 20

Slide 33

Lac Operon (Negative Regulation)

Catabolic Enzyme

Repressor

Operon
Inducer

PEMILIHAN SISTEM EKSPRESI

Sifat protein
Tujuan penggunaan protein

Slide 22

SIFAT VEKTOR EKSPRESI

MARKA SELEKSI PROMOTOR KEUNGGULAN AMPR, TETR Trp-lac; t7; nirB Tingkat ekspresi Manipulasi mudah murah NEOR, Dihidrofolat reduktase -aktin; CMV IE; SV40 early Tingkat ekspresi Modifikasi; sekresi folding; aktivitas Lambat mahal EUKARIOT
Slide 10

KETERBATASAN

Masalah sekresi Modifikasi sangat terbatas

PROKARIOT

TUJUAN PROTEIN FUSI

Mempermudah proses pemurnian Direkayasa pada tingkat DNA Slide 24 OVERPRODUKSI Hasil transkripsi dan translasi adalah protein fusi yang dapat dimurnikan dengan kromatografi afinitas Slide 26

PROTEIN FUSI
Pada plasmid pET 16b :
N C

HisHisHisHisHisHis
(His-Tag)

Ssisi restriksi Faktor Xa

Protein target

His-Tag

: untuk pemurnian dengan kolom afinitas Ni2+

Sisi restriksi Faktor Xa : sisi pemotongan yang dikenali oleh Faktor Xa yang akan memotong setelah arginin dari Gly-Arg dengan tujuan untuk mendapatkan protein target murni tanpa His-Tag

Protein target : hasil ekspresi dari gen yang diklon ke dalam vektor ekspresi yang digunakan Slide 18

OVERPRODUKSI
STARTER 1% 370C, 150 rpm

OD600nm = 0,6-0,7
NI I Glukosa 0,2% NI

370C,150rpm on

Panen sel 7000rpm,10,40C Resuspensi dlm PBS, 7000rpm, 10, 40C pelet SDS PAGE 10000rpm, 15 Ekstrak protein Hasil sonikasi Slide 23 pelet

PEMURNIAN MENGGUNAKAN KOLOM AFINITAS KOLOM Ni2+

Slide 27

RECOVERY FUSION PROTEIN

Slide 28

Optimasi Overproduksi Menggunakan Variasi Konsentrasi IPTG

Keterangan : 1. 2. 3. 4. 5. 6. Marker protein Non induksi Induksi 0,3 mM Induksi 0,5 mM Induksi 0,8 mM Induksi 1,0 mM

Hasil : optimal pada induksi 0,5 mM IPTG

Slide 19

MASALAH PRODUKSI PROTEIN REKOMBINAN PADA E.coli

Problem yang berasal dari urutan gen asing Slide 30 Problem yang disebabkan oleh E. coli Slide 32

Slide 21

PROBLEM YANG BERASAL DARI URUTAN GEN ASING

Gen asing tersebut kemungkinan mangandung intron
Gen asing tersebut kemungkinan mampunyai urutan yang dikenali sebagai signal terminasi bagi E.coli Codon usage gen asing tersebut mungkin saja tidak sama dengan transalasi pada E. coli

Slide 31

Slide 29

PROBLEM YANG DISEBABKAN OLEH E.coli E.Coli mungkin saja tidak memproses protein rekombinan dengan benar

Folding protein rekombinan pada E.coli mungkin saja tidak benar

E. Coli dapat mendegradasi protein rekombinan

Slide 21