Universidade do Estado do Amazonas

Produo de flagellin nativo de Salmonella typhimurium em um biorreator e purificao por ultrafiltrao tangencial
Apresentao de Artigos Cientficos Engenharia Bioqumica
Aluna: Nayara Aires de Souza
Prof: Nora Garcia

OBJETIVOS

Estudar o processo de purificada flagellin Flic nativo de Salmonella typhimurium ; Descrever as condies que permitem a produo de Salmonella FliCi flagellin em biorreatores com purificao subsequente em altos rendimentos por ultrafiltrafiltrao

INTRODUO

Qual a diferena entre flagelo bacteriano e a flagelina?

Flagelo bacteriano composto por: Corpo Basal, o gancho e o filamento. Salmonella typhimurium, a flic flagelina mostra quatro domnios estruturais: os domnios D0 D1, e os domnios D2 e D3.

Fig.2 Flagelo

A flagelina de Salmonella, tanto a protena nativa ou recombinante , tem sido intensivamente estudada como um adjuvante, em diferentes formulaes de vacinas pelas vias parentrica ou na mucosa, quer em mistura ou geneticamente fundido com o antgeno de protena alvo.
Flagelina de Salmonella foi testado com sucesso, como um protetor celular, tanto in vitro como in vivo, contra os efeitos txicos de procedimentos qumicos e radiolgicos comummente utilizadas no tratamento de cncer.

Apenas alguns estudos anteriores relataram a purificao de Salmonella flagellin em condies experimentais bem definidas e nenhuma delas focada no estabelecimento de procedimentos, e so estes os procedimentos relatados: Cultivo do microrganismo em frascos de agitao ou biorreatores e purificao de flagelina com base no corte mecnico de flagelos, a centrifugao diferencial, a despolimerizao e repolimerizao de flagelos por alteraes do pH, seguido por precipitao com sulfato de amnio e de precipitao de acetona ou de dilise.

1.

Porm o grupo tem aplicado com sucesso a ultrafiltrao tangencial.

MATERIAIS E MTODOS
Tenso

Atenuada Salmonella entrica sv Typhimurium LDV tenso 322, derivado do aro Uma cepa SL3261.

Meio de Cultura

Dois meios complexos foram utilizados: 1) LB: triptona (BD) 2) Peptona de soja - Soytone (BD)

MATERIAIS E MTODOS
Crescimento

das Culturas em Shakers

Os experimentos foram realizados em um agitador New Brunswick (Shaker srie 25) com diferentes mdia.

Crescimento das Culturas em biorreatores Os experimentos foram realizados em 3000 biorreator Bioflo (New Brunswick Scientific) em 2 L de meio de extracto de Soytone-levedura, pH 7,0 ajustado com a adio de NaOH 5 N, a 35 C e pO2 controlada em 30% da saturao do ar

Purificao da Flagelina

Dois procedimentos foram testados de acordo com a cultura das clulas: 1. Para culturas preparadas em frascos de agitao.

II.Produo Flagelina tambm foi determinada por precipitao com 4 volumes de acetona, a incubao a -20 C durante 1 hora e centrifugao.

O sobrenadante resultante foi guardado e nomeado caldo sobrenadante mdio. Esta etapa resultou em duas fraes: concentrado de 750 kDa e 750 kDa ultrafiltrado.

SDS-PAGE uma anlise em electroforese em gel de poliacrilamidasulfato de dodecilo de sdio (SDS-PAGE) onde foi realizada com um aparelho de gel de mini-placas (Bio Rad) de acordo com o mtodo de Laemmli. O teor de protena foi determinado pelo mtodo de Lowry e as concentraes de flagelina (mg / L) foram determinados aps multiplicao da percentagem de protena.

Western Blotting As protenas foram transferidas para membrana de nitrocelulose.

RESULTADOS E DISCUSSO A fim de aumentar as foras de corte necessrias para

separar flagelina a partir da clula bacteriana sem promover a lise celular significativa, foram testados dois homogeneizadores do tipo misturador: o modelo X-520 homogeneizador e o Omni Mixer (Sorvall) com o eixo helicoidal montada dentro de um reservatrio hermtico (Figura 4)

processo de isolamento da flagelina foi realizada utilizando ambos os homogeneizadores de acordo com o fluxograma .Os rendimentos da recuperao de flagelina obtidos aps extrao com ambas homogeneizadores foram semelhantes.
efeito, a flagelina foi detectada em geles de poliacrilamida de Comassie blue-stained mesmo sem concentrao de flagelina por precipitao de acetona.

Com

Em uma segunda etapa verificou-se a produo de Flagellin pelo Typhimirium cepa de S.LDV322 sem componentes animal. crescimento das clulas foi maior no meio de Soytone (DO600nm de 6,0) quando comparada com culturas de clulas preparadas com meio LB (DO600nm de 2,5). Do mesmo modo, a expresso de flagelina tambm foi maior em clulas cultivadas em meio Soytone quando comparadas com as clulas cultivadas sob as mesmas condies experimentais, em meio LB.

O prximo passo na melhoria do processo de purificao de flagelina foi a substituio dos frascos agitadores gaseificadas por culturas preparadas num biorreator e obteve-se: A Figura 6 mostra o perfil de crescimento das clulas com uma taxa especfica de crescimento mximo de 0,7 h-1, e uma biomassa de 8,5 g / L obtido no final da cultura no biorreator.

A pureza relativa das flagelina no que diz respeito s protenas contaminantes (PRprot) e o fator de purificao correspondente (PF) so indicadas.

CONCLUSO
Melhoria

significativa sobre os outros mtodos;

Fez

com que o passo de purificao ficasse mais simples, mais rpido e seguro para manuseamento das clulas bacterianas;
a aplicao de passos de purificao adicionais, tais como cromatografia de permuta inica, para conseguir padres da OMS para produtos

Permitiu

BIBLIOGRAFIA

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