AMPLIFICACIN DE CIDOS NUCLICOS POR PCR

M.Sc. Guillermo A. Linares Lujn

PCR
Reaccin en Cadena de la Polimerasa
Kary Mullis, 1983 Amplificacin selectiva de secuencias de DNA realizada en un sistema in vitro libre de clulas Permite la obtencin de un elevado nmero de copias de una secuencia de DNA a partir de pequeas muestras y un posible mal estado de conservacin. Es una tcnica de anlisis rpida, sencilla y eficaz.

Aplicacin y Versatilidad de la PCR

La PCR ha revolucionado la biologia molecular y se ha convertido en una herramienta de trabajo imprescindible, no solo en el anlisis gentico si no tambin para el anlisis microbilogico, patlgico, bioqumico, etc.

Nmero de artculos publicados anualmente en los que se utiliza la tcnica de PCR

FECHAS IMPORTANTES EN LA HISTORIA DE LA PCR

1985: PRIMER ARTCULO SOBRE PCR 1987: PRIMER TERMOCICLADOR COMERCIAL (PerkinElmer Cetus) 1989: DNA Pol Y PCR MOLCULA DEL AO (SCIENCE) 1993: KARY MULLIS PREMIO NOBEL DE QUMICA

1994: PRIMER TERMOCICLADOR PARA PCR in situ 1995: PCR A TIEMPO REAL

EL CICLO DE LA PCR Etapa 1 Desnaturalizacin

Etapa 2 Hibridacin Etapa 3 Elongacin

Etapas de una reaccin de PCR

1.-Desnaturalitzacin

3.- Elongacin
2.- Hibridacin

Desarrollo de una PCR

DESNATURALITZACI 94-96C 4-5 minuts

CICLES (20-40) desnaturalitzaci: 94-96C 1 minut hibridaci: 50-65C 1 minut extensi: 72C 1 minut
EXTENSI 72C 5-10 minuts

CONSERVACI 4C a temps indefinit

Q = m (1 + E)n

Molcules de DNA en una PCR

N de cpies

DNA motlle
N de cicles

Componentes de la reaccin de PCR

Tampn de Reaccin (Tris-HCl) Sal (KCl), iones Mg2+ Mix de dNTPs. Cebadores o Primers DNA molde DNA Polimerasa (Taq)
TERMOCICLADOR

1.- DNA Molde

La cantidad habitual usada en una PCR convencional, depende de la complejidad del DNA molde

Humanos: Levaduras: Bacterias: Fago Lambda: Plsmidico:

10 ng 1 g 10 ng 1 ng 20 pg 1 2 pg

2.- DNA Polimerasas Termoestables

1983 Klenow
(poco eficaz e inespecfica; 37C)

1988 Taq polimerasa I

(Thermus aquaticus)

Enzim Taq Stoffel Tth Pfu Pwo

Vida mitj. 95C 40 min 80 min 20 min >2 h >2 h

Procesiv. 50-60 nt 5-10 nt 30-40 nt

Taxa dextensi 75 nt/s >50 nt/s >33 nt/s 60 nt/s

Activitat exonucl. Si No Si No No

Activitat correctora No No No Si Si

Taq DNA POLIMERASA

Mt Temp.ptima pH ptimo [Mg2+] ptima Vlocidad de Sntesis Procesividad Producto de PCR mas largo 94 KdA 72 80 C 7,0 7,5 1,5 4 mM 24 Kb / min. 30 60 bases 5 kb

Rango de Longitud de la PCR

Mezcla de enzimas:
Taq y otra polimerasa con correccin de prueba como la Pfu o la Pwo.

Cuando la Taq incorpora un nucletido errneo se disocia del molde de DNA y no puede continuar la extensin

Rango de Longitud de la PCR

La polimerasa con capacidad correctora puede corregir el error y continuar la sntesis.
Cuando se disocia del molde de DNA puede continuar la Taq con la extensin de la nueva molcula de DNA

3.- Cebadores o Primers

Los cebadores permiten definir los lmites (extremos 5 de cada uno de ellos) de la secuencia especfica del DNA molde a amplificar.

n
5 3

Diseo de Cebadores
Longitud
Entre 15-25 nt

Composicin de bases
Una proporcin similar de cada uno de los nucletidos Un contenido de G y C similar en la pareja de cebadores Evitar repeticiones. Evitar posibles formaciones de estructures secundarias

Extremo 3
Evitar complementariedad que afecten a el extremo 3 del mismo cebador o entre cebadores. Extremos 3 ricos con G y C pueden dar lugar a inespecificidades.

Temperatura de fusin
Ha de ser similar la Tm en la pareja de cebadores

Dmeros de cebadores (Primer dimers)

Temperatura de fusin (Tm)

(melting temperature)
La desnaturalizacin (separacin de las dos cadenas) es dna per blocs depenent del contingut amb GC de cada bloc

Temperatura de fusin y contenido en GC

Factores que determinan la Estabilidad y Especificidad de las Hibridaciones

Caractersticas de les molculas
Complementariedad (secuencia) [estabilidad y especificidad] Longitud de la molcula (nmero de pares de bases) [estabilidad y especificidad] Porcentaje de GC [estabilidad]

Caractersticas del ambiente

Temperatura [estabilidad] pH [estabilidad] Concentracin salina (cationes monovalentes como el Na+) [estabilidad] Agentes desnaturalitzantes (formamida, formaldehido, rea, otros) [estabilidad]

APLICACIONES DE LA PCR Deteccin de Secuencias

- Deteccin de Mutaciones: Puntuales / Delecciones / Inserciones -Diagnstico de Enfermedades Genticas Cuando se conoce el gen responsable de la patologa -Diagnstico de Microorganismos Patgenos Deteccin de secuencias especficas -Deteccin de Infecciones VIH : Secuencias especficas de del profago en clulas sanguineas

Amplificaciones de Grandes Cantidades de DNA

-DNA molde Procede de una muestra escasa, dificil de lograr o incluso irrepetible Por tanto fuente inagotable para el futuro

Produccin de Sondas
-Sondas Experiencias de Hibridacin El sustrato puede ser una mezcla de DNAs o un fragmento de DNA clonado.

Produccin de ssDNA por PCR Asimtrica

-Regularmente para Secuenciacin Mt. De didesoxinucletidos terminadores de cadena ssDNA

PCR Asimtrica Inicialmente se producen sdDNA, pero luego cebador limitante se agota pero el segundo continua sintetizando, dandolugar a ssDNA

- PCR Asimtrica
Ciclos Iniciales Cebadores / = 1 / 100

Ciclos Finales

Cebador

Reconstruccin de DNA
-DNA Procedente de muestras arqueolgicas, especies antiguas, incluso especies extinguidas (ancient DNA). DNA degradado, fragmentado. PCR : Capaz de regenerar DNA original de tamao mucho mas grande.

Sntesis de Genes
-Anlogo al anterior Genes Sintticos A partir de oligonucletidos sintticos y solapantes que se van aadiendo ordenadamente. Longitud de Cebadores: X = 50 nt Hasta 1000 pb (1 da de trabajo)

Modificaciones en Secuencias Amplificadas

-Adicion de dianas de Restriccin No hibrida con el DNA molde No afecta para cebar la polimerizacin Pdto de amplificacin + Enzima de restriccin Clonaje en vector que tenga extremos compatibles. -Adicin de elementos reguladores de la expresin. Ej: Promotores (Ej. T7, T3 o SP6) / RBS SIN NECESIDAD DE CLONAJE

- Modificaciones en la secuencia amplificada Mutagnesis Dirigida

Nested PCR