TECNICAS ENZIMATICAS

Dr. Ronald Navarro Oviedo Departamento Acadmico de Biologa Ctedra de Enzimologa U.N.S.A.

TECNICAS ENZIMATICAS
La propiedad mas caracterstica de una enzima es

su poder para catalizar una reaccin qumica definida La presencia de una enzima se detecta por las reacciones que ellas catalizan La cantidad de una enzima se estima a partir de la velocidad de reaccin

MEDICION DE LA VELOCIDAD
Las curvas de progreso de las reacciones enzimticas,

muestran que la velocidad decae con el tiempo (velocidad vs. tiempo) Las causas de esta cada son: A) Los productos de la reaccin pueden inhibir a la enzima. B) El grado de saturacin de la enzima por el S puede disminuir a causa de la caida de la [S] conforme procede la reaccin C) La reaccin inversa puede hacerse mas importante a medida que aumenta la [ ] de los productos. D) La enzima puede inactivarse por la temperatura o el pH de la reaccin

UNA TPICA CURVA DE PROGRESO

CURVA DE PROGRESO NO TIPICA

No es fcil decidir si la velocidad inicial, la Vmax o la inclinacin de la curva en otro punto dan una medida exacta de la actividad de la enzima.

Hay que determinar la causa, para luego modificar el procedimiento para eliminar esto de modo que se pueda usar la velocidad en la forma normal

Ejemplo
A) La D-aminocido

oxidasa requiere una coenzima flavnica que se combina lentamente con la enzima; por lo tanto, la cantidad de enzima activa aumenta tiempo, despus de mezclar los reactivos, produciendo una aceleracin.
Esto se puede eliminar incubando primero la enzima

con la coenzima y el S se aade al final para iniciar la reaccin.

 B) Una enzima en una

solucin stock concentrada puede estar en la forma de un agregado parcialmente activo, que se disocia a la forma totalmente activa durante la dilucin de la mezcla de reaccin. Esto se trata aadiendo primero la E y luego el S para iniciar la reaccin

 C) La enzima en la solucin stock se halla formando un

complejo revresible con un in metlico inhibidor (impureza) que se disocia por dilucin. Este caso se trata igual que a y b

 Por lo tanto, no es fcil decidir si

la velocidad inicial, la Vmax o la pendiente de la curva en otro punto dan una medida exacta de la actividad de la enzima

MEDICIN DE LA VELOCIDAD
Por esta razn solo se trabaja en velocidad inicial (vi)

de reaccin enzimtica. Es decir: a) en el punto inicial, b) cuando las causas anteriores no tienen tiempo para operar, c) donde las condiciones son correctamente conocidas. Para obtener la velocidad inicial, solo es necesario determinar la primera parte de la curva de progreso y luego se traza una tangente al origen. Las curvas casi son lneas rectas cuando el cambio no excede de 20% del total (P. ej. 20% de consumo de sustrato). Mejor no mas del 5% del S.

Importancia de tomar las velocidades iniciales. (a) Curvas de progreso con tres cantidades diferentes de enzima, (b) velocidad aparente, derivada a partir de los puntos de (a) a tres tiempos diferentes, ploteada frente a la cantidad de enzima

CLASES DE METODOS
Para seguir las reacciones enzimticas existen dos

tipos de mtodos: Mtodos por muestreo: Las observaciones no se realizan en la misma mezcla de reaccin sino sobre muestras retiradas a varios tiempos (puntos separados, curvas discontinuas) Mtodos continuos: Las observaciones se hacen en la misma mezcla de reaccin. Muchas lecturas o por registro automtico, curvas continuas.

ASPECTOS PRACTICOS: Para obtener linearidad

Se deben mantener constantes las condiciones de la

mezcla de reaccin La reaccin debe ser realizada en un termostato Todos los reactivos deben ser llevados a la temperatura correcta antes de iniciar la reaccin Usar un buffer adecuado para evitar cambios en el pH Escoger condiciones de pH y temperatura adecuados apara la enzima

ASPECTOS PRCTICOS: Debido a la alta actividad cataltica de las enzimas

Evitar las trazas de enzimas en las puntas de pipetas o los polvos enzimticos (trazas de saliva: usar

tapones de algodn en los topes de las pipetas cuando se trabaje con amilasas)

ASPECTOS PRACTICOS: Para hacer lecturas correctas

Ajustar la velocidad de reaccin por dilucin adecuada de la enzima
Mezcla rpida y completa

ASPECTOS PRACTICOS: Cmo guardar las enzimas

Las enzimas deben ser guardadas en soluciones stock altamente concentradas:

A. Precipitacin con sulfato de amonio B. Concentracin con cromatografa C. Concentracin con membranas diaflo (AMICON)
Para iniciar la reaccin: realizar mezcla rpida y completa por agitacin (manual o con vortex)

MANEJO GENERAL DE ENZIMAS

Evitar inactivacin

Eliminar condiciones en las que la enzima es inestable: altas temperaturas, soluciones cidas o alcalinas (evitar pH <5 o >9), alcohol Durante la purificacin usar cuarto frio, o bao refrigerado que contiene alcohol diluido (usar vasos de acero)
La mayora de enzimas se inactivan a pH pH <5 o >9. Agregar cido por las paredes del vaso y con agitacin

MANEJO GENERAL DE ENZIMAS

Evitar formacin de espuma, pues las enzimas se desnaturalizan en las superficies: El vaciado de un

vaso a otro se debe realizar por las paredes (inclinando); hojas de agitador sumergidas profundamente y el vstago debe girar a plomo Las sales: agregar poco a poco para evitar burbujas. Usar soluciones saturadas de sal. Usar solventes fros para el fraccionamiento (acetona, alcohol) Los detergentes pueden afectar a la enzima y son difciles de eliminarlos

MANEJO GENERAL DE ENZIMAS

Los precipitados deben ser separados por centrifugacin; solo en algunos casos por filtracin (papel, celita, hyflo, supergel, etc.) Realizar la purificacin sin prdida de tiempo para evitar prdida de actividad (en 2 3 das) a menos que la enzima sea bastante estable. Guardar las enzimas en fro (congelacin)

El secado de las enzimas debe hacerse al vacio y a baja temperatura (liofilizacin)

La contaminacin bacteriana, solo es un problema si las

soluciones se dejan en reposo por largos tiempos

EL ESTUDIO DE UNA ENZIMA

Propiedades proteicas
Homogeneidad Nmero de isoenzimas

Peso molecular
Forma de la molcula Curva de titulacin

Punto isoelctrico
Movilidad electrofortica Grado de hidratacin Estabilidad frente al pH, calor, oxidacin y radiaciones Disociacin en pequeas subunidades Espectro de absorcin, etc.

Estructura
Composicin de aminocidos Nmero de cadenas peptdicas Secuencia de aminocidos Plegamiento de las cadenas Presencia de grupos prostticos Nmero de grupos SH Efecto de reactivos qumicos Dispersin rotatoria ptica Dicroismo circular

Resonancia magntica nuclear

Resonancia del spin electrnico

Propiedades de la enzima
Naturaleza de la reaccin Implicacin de coenzima Especificidad por el sustrato Reversibilidad de la reaccin Especificidad hacia inhibidores

Centro activo
Nmero por molcula Estructura qumica Efecto de la combinacin con el sustrato Mecanismo de reaccin Modo de accin del grupo prosttico

Cintica
Actividad especfica Actividad molecular Actividades absolutas por centro activo Medida de las constantes de velocidad Efecto de activadores Efecto de iones a diferente pH Efectos alostricos Secuencia de las etapas de reaccin

Ecuacin de velocidad

Termodinmica
Reversibilidad y Keq de la reaccin Coeficiente de temperatura Energas libres y entropas Afinidad de la enzima por el sustrato (Km) Efecto del pH sobre Km Afinidad por un inhibidor (Ki)

Propiedades biolgicas
Significado de las enzimas en el metabolismo
Acoplamiento con otras enzimas Ocurrencia y distribucin en especies y tejidos

Localizacin intracelular
Formacin a partir de precursores Formacin adaptativa Gentica de la enzima Efecto de las mutaciones gnicas

Propiedades biolgicas
Existencia de isoenzimas Efectos de la deficiencia de enzimas Efectos del envenenamiento especfico Comportamiento inmunolgico Antienzimas

LAS ACTIVIDADES ESPECIFICA Y MOLECULAR

Se debe definir un parmetro que exprese la

velocidad de reaccin que puede ser alcanzada por una determinada cantidad de enzima En otros campos se usa: cantidad / unidad de peso con el adjetivo Especfico Cantidad / molcula con el adjetivo molecular

Actividad especfica
Ha sido expresada de diferentes maneras: A) Unidades / mg de enzima; la unidad es arbitraria (p.ej. P.Z. para peroxidasas) B) Constante de velocidad / mg de enzima; Kat. F. para catalasa; coeficiente proteoltico, para peptidasas C) mMoles de S que reaccionan / min / mg de enzima D) mMoles de S que reaccionan / min / 100,000 g de enzima

Actividad molecular
Molculas de S que reaccionan / min / molcula de enzima ( = actividad molecular) Molculas de S que reaccionan / min / centro activo ( = actividad de centro cataltico)

Nota: Nmero de recambio: se us para las dos, pero ha creado confusin. Por acuerdo internacional, para la segunda se usa actividad de centro cataltico

Segn la I.U.B. (E.C.)

Una unidad U: cantidad de enzima que transforma

1 mMol de S / min Actividad especfica: Unidades de enzima / mg de protena Actividad molecular: Unidades / mMol de enzima ( = N de molculas de S transformadas / min / molcula de enzima Actividad absoluta por centro activo, o actividad de centro cataltico: N de molculas de S transformadas / min / centro cataltico

Katal (kat)
Cantidad de enzima que transforma 1 mol de S / seg Microkatales (mkat); nanokatales (nkat) o

picokatales (pkat) 1 kat = 6 x 107 UI 1 UI = 0.01667 mkat = 16.67 nkat

AFINIDADES ENZIMATICAS
Constantes de disociacin E S Km: E + S ==== ES Ki: Ka

E + I ==== EI E + A ==== EA

METODOS PARA SEGUIR CUANTITATIVAMENTE LAS REACCIONES ENZIMATICAS

Mtodos espectrofotomticos
Mtodos de fluorescencia Mtodos manomtricos

Mtodos de electrodo
Mtodos polarimtricos Mtodos por muestreo

La absorbancia molar es la absorbancia de una solucin 1 M de la sustancia en una cubeta de 1 cm; as, la molaridad real de una solucin se obtiene dividiendo la absorbancia observada por la absorbancia molar. Para referencias ver (12). Las longitudes de onda dadas corresponden a las bandas de mxima absorcin, excepto para el azul de metileno, fenazina metosulfato reducida, ferri- y ferrocianuro a 314 nm y citocromo oxidado. Se debe notar que algunas de estas sustancias, especialmente las formas reducidas de las flavinas y colorantes, reaccionan rpidamente con el oxgeno, el cual debe ser rigurosamente excluido. Los artificios para la espectrofotometra anaerbica han sido discutidos por DIXON (11).

Espectrofotmetro Beckman

Beckman DU-650 UV-Vis spectrophotometer with sipper and sampler

ESPECTROFOTMETRO DE FLUORESCENCIA

pH-STAT Titrator, Biburette motor positions without Burette stand (Radiometer Analytical)

Polarmetro de Disco