Anda di halaman 1dari 26

VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR (VEGF) DALAM PENYEMBUHAN ULKUS DIABETIKUS

Oleh : Made Septyana Parama Adi Pembimbing : dr. Ketut Putu Yasa, Sp. BT

PENDAHULUAN
Bermacam-macam proses seperti pembentukan embryo, dan penyembuhan jaringan berhubungan dengan pembuluh darah Pada diabetes melitus terjadi ketidakseimbangan antara pembentukan pembuluh darah Diabetes mengganggu berbagai macam komponen pada penyembuhan ulkus, menyangkut hemostasis dan inflamasi, deposisi matrix, dan angiogenesis Lingkungan mikro yang tinggi proteolitik menyebabkan penurunan aktivitas VEGF VEGF dipertimbangkan sebagai pengobatan yang sangat berguna sebagai terapi proangiogenik dan prolimphangiogenik yang dapat berperan dalam penyembuhan ulkus diabetik

VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR (VEGF) DALAM PENYEMBUHAN ULKUS DIABETIKUS

Penyembuhan Luka Pada Diabetes


Penyembuhan luka normal dapat dibagi menjadi empat fase yaitu: hemostasis, inflamasi, proliferasi, dan remodelling Abnormalitas pada diabetes menyangkut pembentukan sumbatan fibrin perikapiler, gangguan ekspresi dari matrix ekstrasellular (ECM), gangguan infiltrasi sel, insufisiensi aktivasi makrofag, gangguan re-epitelisasi, dan gangguan angiogenesis.

Skema gangguan penyembuhan luka pada diabetes (Tellechea A, dkk; The Open Circulation and Vascular Journal 2010; 3, 46)

Faktor Pertumbuhan Yang Berperan Pada Ulkus Diabetikus


Beberapa faktor pertumbuhan: fibroblast growth factor, vascular endothelial growth factor (VEGF), granulocyte colony-stimulating factor, dan hepatocyte growth factor VEGF yang merupakan keluarga dari faktor pertumbuhan ini merupakan kunci regulasi secara fisiologis dan patologis dari vaskulogenesis, angiogenesis, limphangiogenesis, dan permeabilitas vaskular

Jenis VEGF A Angiogenesis

Fungsi

migrasi dari sel endotel mitosis dari sel endotel aktivitas methane monooxygenase aktivitas v3 Pembentukan lumen pembuluh darah Membentuk fenestrasi Kemotaktik granulosit Vasodilatasi (secara tidak langsung untuk macrofag dan

melalui pelepasan NO) VEGF B VEGF C VEGF D Angiogenesis pada embrio Limphangiogenesis Diperlukan untuk perkembangan vaskuler

limphatik disekelilinh bronkiolus paru PIGF Penting untuk Vasculogenesis, juga diperlukan untuk angiogenesis

VEGF Mempercepat Penyembuhan Ulkus Diabetik Melalui Peningkatan Angiogenesis, Memobilisasi dan Perekrutan Bone Marrow Derived Cel
Galiano dkk, mengadakan penelitian tentang VEGF dengan menggunakan tikus betina berumur 10-12 minggu yang memiliki level glukosa darah >350 g/dl. Untuk percobaan tranplantasi sumsum tulang, digunakan tikus dengan strain FVB/NJ bersama dengan tikus donor jenis tie2/lacZ transgenic yang memiliki latar belakang genetik yang sama Sepasang ulkus dibuat dibagian dorsal kulit tikus dengan kondisi steril dan berbentuk sirkular dengan ukuran 6 mm, setelah itu difiksasi dengan splint

Ulkus diklasifikasikan menjadi tiga kelompok:


Kelompok pertama diberikan topikal recombinant human VEGF165 protein dan diberikan di kedua ulkus dengan dosis 20 g. Kelompok kedua merupakan ulkus kontralateral yang diberikan PBS (Phosphate Buffered Saline) dengan dosis 20 g, pada kelompok ini terdapat 2 terapi yang berbeda, yaitu VEGF dan PBS. Kelompok ketiga hanya diberikan PBS saja dan tidak mendapat VEGF. Kelompok ini berperan sebagai kontrol.

VEGF protein dan PBS diberi secara steril di ulkus pada hari ke 0, 2, 4, 6, dan 8. Setelah pemberian VEGF dan PBS, ulkus ditutupi dengan dressing oklusif dan foto diambil setiap 2 hari. Waktu penutupan luka didefinisikan sebagai luka yang telah ditutupi secara komplit dengan jaringan baru, dan ditentukan oleh blind observer. Untuk pemeriksaan histologi dan analisis ulkus, pada interval waktu antara 5-21 hari setelah pembuatan ulkus, ulkus dieksisi dengan ketebalan 2 mm dan diletakkan di larutan Bouins selama semalam atau cairan nitrogen Untuk pemeriksaan proliferasi, tikus diinjeksi dengan 100 mg bromodeoxyuridine (BrdU) secara intaperitonial 3 jam sebelum dikorbankan dan pemanenan ulkus Pemeriksaan RT-PCR (Real Time Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dilakukan pada ulkus yang dipanen pada hari ke 12 dan pada kontrol. Pemeriksaan CD31 immunohistokimia, dan quantitative wound CD31 assay juga dilakukan.

Pemeriksaan sumsum tulang dilakukan dengan mengumpulkan sel sumsum tulang dari tibia dan femur tikus transgenic yang mengekspresikan lacZ dibawah kontrol dari endotel spesifik tie2 (tie2/lacZ) yang kemudian ditransplantasikan ke tikus dengan jenis FVB/NJ yang telah diradiasi Untuk analisis statistik menggunakan program Sigma Stat. Two-tailed unpaired Students t-test atau analisis varian juga digunakan untuk menganalisa perbedaan dalam kelompok. Semua data dipresentasikan sebagai mean SEM. Nilai P kurang dari 0,005 dipertimbangkan sebagai signifikan

Hasil dari penelitian


a) VEGF mempercepat penyembuhan ulkus pada tikus diabetik

Pada percobaan tersebut, tikus yang tidak mendapat pengobatan memerlukan waktu 25 hari untuk penutupan ulkus yang komplit (garis hijau) Pemberian rhVEGF165 secara serial dengan dosis 20 g memiliki efek yang dramatis pada penyembuhan ulkus, dengan penutupan yang terjadi pada hari ke 12 (garis hitam

Secara kasar, ulkus yang diobati dengan VEGF menjadi hiperemis pada hari ke 3, dan pada hari ke 5 jaringan granulasi berwarna merah banyak muncul

Ulkus yang diobati dengan VEGF secara visual terlihat menutup pada hari ke 7-8, dengan penutupan komplit terjadi pada hari ke 12-13

Secara histologis, epitelisasi yang lebih cepat terlihat pada ulkus yang diobati dengan VEGF, dengan re-epitelisasi penuh pada ulkus dengan terapi VEGF terlihat pada hari ke 9 (dibandingkan dengan hari ke 17 pada ulkus yang tidak diobati) Deposisi jaringan granulasi terlihat lebih banyak pada ulkus yang memperoleh topikal VEGF. Area jaringan granulasi pada ulkus yang diobati dengan VEGF mengalami peningkatan 225% lebih banyak daripada ulkus kontrol yang diobati dengan PBS pada hari ke 12 dan meningkat 20 % pada hari ke 21 (P<0,05)

b) Proliferasi pada ulkus yang diterapi dengan VEGF menetap sampai ulkus tertutup

Terapi VEGF dikarakteristikan dengan index proliferasi yang lebih besar secara signifikan selama terapi VEGF Pada hari ke 7, terjadi proliferasi sel yang 4 kali lebih besar pada ulkus yang diterapi dengan VEGF dibandingkan dengan kontralateral PBS (41 3 BrdU-positive cells/hpf banding 11 2 BrdU-positive cells/hpf, P<0,01). Setelah penutupan ulkus, sejumlah proliferasi sel secara cepat menurun, dan pada hari ke 14 dan ke 21 jumlah proliferasi sel pada ulkus yang diterapi dengan PBS (masih terdapat penyembuhan) melebihi jumlah proliferasi sel pada ulkus yang sudah sembuh yang diterapi dengan VEGF (33 4 BrdU-positive cells/hpf banding 18 3 BrdU-positive cells/hpf, P<0,05, ulkus hari ke 21)

b. ulkus pada hari ke 12 yang diterapi dengan PBS c. ulkus pada hari ke 12 yang diterapi dengan VEGF

c) Terapi VEGF menginduksi neovaskularisasi pada ulkus diabetik


Neovaskularisasi secara signifikan meningkat selama terapi VEGF topikal aktif (hari ke 3-7). Ketika dilakukan pemeriksaan histology, Vacuolar besar seperti pembuluh darah terlihat pada bantalan ulkus pada waktu ini. Ini berhubungan dengan pembentukan edema, dimana akan menetap sampai terapi VEGF dihentikan. Menariknya, banyak deposisi jaringan granulasi terjadi setelah pemberhentian terapi VEGF, yang memperlihatkan bahwa perbaikan jaringan distimulasi oleh VEGF eksogen yang menetap walaupun setelah pemberhentian VEGF Pada hari ke 7, ulkus yang mendapatkan terapi VEGF memilki 10 kali sel CD31 positif yang lebih besar dibandingkan dengan terapi kontralateral PBS (198 36 banding 26 12 CD31-positive cells per hpf, P<0,001).

Gambaran ulkus pada hari ke 21. Keratinosit diwarnai dengan green florescent antibody. a. ulkus yang diterapi dengan VEGF; b. ulkus kontralateral yang diterapi dengan PBS; c. ulkus yang diterapi dengan PBS pada tikus kontrol yang tidak memperoleh VEGF eksogen.

d) Pemberian VEGF meningkatkan regulasi PDGF dan FGF pada ulkus diabetik

PDGF-B dan FGF-2 memiliki efek yang paling kuat dalam meningkatkan regulasi pada level RNA pada ulkus yang diterapi dengan VEGF Ulkus yang diobati dengan VEGF memiliki FGF-2 2-3 kali lebih banyak dan memiliki PDGF-B 1,7 kali lebih banyak dibandingkan dengan ulkus yang diterapi dengan PBS pada hari ke 7

e) Terapi VEGF topikal memobilisasi sejumlah besar sel VEGFR2+ pada tikus diabetik
Ditemukan bahwa pemberian topikal VEGF menginduksi mobilisasi pada EPC Dengan menggunakan uji proliferasi in vitro didapatkan peningkatan 6 x pada Ulex+/AcLDL-uptaking cell pada tikus yang telah diobati dengan VEGF pada hari ke 14 (P<0,01) Flow cytometry dengan menggunakan marker CD11b untuk mengeksklusi myeloid/monocyte lineage cell memperlihatkan peningkatan yang serupa pada proporsi sel VEGFR2+/CD11b- di sirkulasi, dengan peningkatan 5,2 kali pada hari ke 7, dengan level yang tetap meningkat signifikan pada hari ke 21 Analisis FACS menggunakan VEGFR-2 dan CD31 co-staining memperlihatkan level yang sama dari sirkulasi sel VEGFR2+/CD31+ pada tikus yang diterapi dengan VEGF, dengan peningkatan 6 kali lebih banyak pada hari ke 7 dan menetap sampai hari ke 21

Gambar 5. Pemberian VEGF topikal memicu mobilisasi prekursor endotel pada tikus diabetik.; a. peningkatan EPCs setelah 4 hari in vitro culture assay; b. kultur sel dari monocyte layer pada tikus kontrol yang tidak memperoleh terapi VEGF; c. ulkus yang diterapi dengan VEGF yang memperlihatkan lebih banyak EPCs dibandingkan dengan gambar b; d. histogram yang memperlihatkan proporsi VEGFR-2+/CD11b- (EPCs) pada tikus diabetik yang diterapi dengan VEGF

f) Tie2-lacZ staining bone marrow derived cells direkrut ke ulkus yang diterapi dengan VEGF topikal
Ditemukan bahwa sel tie-2/lacZ positif direkrut ke ulkus yang diterapi dengan VEGF Pewarnaan in situ pada spesimen memperlihatkan lebih banyak lac Z pada ulkus dengan terapi VEGF pada hari ke 21 dan jumlah lacZ positif foci (secara signifikan lebih besar pada ulkus dengan terapi VEGF dibandingkan dengan ulkus kontralateral dengan terapi PBS (93 lacZ foci per field banding 50 lacZ foci per field, P<0,001) (gambar 6b).

KESIMPULAN
Penggunaan topikal VEGF dapat mempercepat perbaikan jaringan dengan cara memobilisasi dan merekrut progenitor vaskular VEGF juga diketahui dapat memobilisasi bone marrow derived cell (menyangkut EPC) dari sumsum tulang Terapi farmakologis VEGF pada diabetik dapat meningkatkan neovaskularisasi pada bagian jejas dengan efek klinis yang signifikan VEGF mampu meningkatkan angiogenesis lokal, dan memobilisasi endotelial progenitor sel ke sirkulasi

THANK YOU