METODOS CROMATOGRAFICOS

UNIDAD III

Concepto y desarrollo histrico

La cromatografa comprende un grupo de mtodos de separacin variado e importante que permiten al cientfico separar, identificar y determinar compuestos afines en mezclas complejas que no podran separase de otra manera. En todos estos mtodos se emplea una fase estacionaria y una fase mvil. La cromatografa es una tcnica de separacin basada en la diferente velocidad con que se mueven los solutos a travs de un medio estacionario mediante el flujo de un disolvente llamado eluente.

 La cromatografa se origin aproximadamente en 1850 por F. F. Runge, qumico alemn especializado en colorantes, el cual describi el proceso de separacin que se conoce actualmente como cromatografa en papel. Corresponde al botnico ruso Mijail Tswett el haber establecido, entre 1908 y 1910, las ventajas de la cromatografa y la adopcin parcial de la terminologa. Utiliz la tcnica para separar diferentes pigmentos vegetales como las clorofilas y las xantofilas, pasando una solucin que contena estos compuestos a travs de una columna de vidrio empacada con carbonato de calcio finamente dividido. Las especies separadas aparecan como bandas coloreadas sobre la columna, lo que explica el nombre de este procedimiento (1903).

 Cromatografa proviene de dos races griegas chroma = color y graphos = escritura, ya que se observan zonas de color. En la actualidad se sabe que est tcnica sirve para sustancias coloridas e incoloras. Las nicas sustancias que no pueden ser examinadas por cromatografa son las insolubles y aquellas que se descomponen con el solvente o con la fase estacionaria.

 Fase estacionaria. La ideal es aquella que proporciona la mejor resolucin de los componentes de la muestra en el menor tiempo. Debe de aceptar la cantidad de muestra requerida, ser de fcil empacado, econmica y producir una cada de presin lenta. En algunas aplicaciones, la fase estacionaria es un slido finamente dividido sostenido en un estrecho tubo de vidrio o de metal, tambin puede ser una tira de papel poroso o un slido finamente dividido que se aplica sobre una capa de vidrio. Fase mvil. Es una de las variables que influyen ntimamente con la separacin. La naturaleza del disolvente empleado como fase mvil puede ser tanto orgnica como acuosa.

Caractersticas con que debe contar una buena fase mvil son : No alterar la columna y su naturaleza. Ser compatible con el detector. Disolver la muestra (los componentes que se desean separar deben ser solubles en la fase mvil). Ser de baja viscosidad. Que permita recobrar la muestra en su forma simple. Ser pura ( cuando no se trate de mezclas). De adquisicin econmica.

CLASIFICACIN DE LOS MTODOS CROMATOGRAFICOS.

RESUMEN DE LOS TIPOS DE CROMATOGRAFA

FASE ESTACIONARIA FASE MVIL

SOLIDO

LIQUIDO

LQUIDO

GAS

LQUIDO

GAS

EJEMPLOS

Intercambio inico En columna

CGS

De particin En papel En capa fina En gel

CGL

Dos conceptos importantes en cromatografia son: Rf = referencia frontal Rx = relacin con un estndar El comportamiento migratorio de una sustancia se describe en funcin de la relacin de frente, es decir, el cociente de la distancia recorrida por el soluto y la distancia recorrida por el eluente.

Rf = distancia recorrida por la sustancia distancia recorrida por ele eluente

Si se considera la distancia recorrida por un estndar x, los valores se denominan Rx. Este valor se emplea sobre todo, cuando el frente del disolvente sale de la fase estacionaria. Rx = distancia recorrida por la sustancia distancia recorrida por la sustancia estndar x La distancia de migracin del soluto se mide desde el punto de origen o aplicacin hasta algn punto de la mancha, tomndose dicho punto constante.

Cromatografia en papel
La separacin se lleva a cabo sobre tiras de papel. Los tipos de papel ms comunes son Whatman (w) n 1 y n 3, los dos estn formados por un conjunto de fibras de celulosa parcialmente orientadas distinguindose zonas amorfas y cristalinas, estos papeles contienen suficiente agua absorbida, de modo que la cromatografa en papel se puede clasificar como cromatografa lquido-lquido. Sin embargo es posible hacer que otros lquidos desplacen el agua proporcionando un tipo diferente de fase estacionaria. El agua y los compuestos hidrfilos se absorben en las zonas amorfas. Las muestras siempre se aplican en solucin. La eleccin del disolvente depender de las sustancias a separar.

La aplicacin de las muestras sobre el papel se puede hacer en un punto o forma de una franja por medio de capilares o empleando un hilo de platino.

Aplicacin de la muestra

Desarrollo ascendente. El eluente (fase mvil) es colocada en el fondo de la cmara y el papel puede ser suspendido de la parte superior con un alambre o con una varilla de vidrio, o bien se coloca el papel formando un cilindro que se sujeta por medio de pinzas. La superficie del disolvente debe estar debajo de la lnea de aplicacin de la muestra. Ventaja: la distancia recorrida por el disolvente es fija y todos los compuestos permanecen sobre el papel, se obtienen mejores resultados con disolventes muy voltiles.

Desarrollo descendente. El papel se fija mediante unas varillas de vidrio o alambres, dentro de la cmara, en una cubeta, la cual contiene el eluente. La cubeta est colocada en la parte superior de la cmara. El papel se suspende hacia abajo quedando la lnea de aplicacin de la muestra en la parte superior. A continuacin se pasa sobre la otra varilla, que se encuentra a mayor altura que el nivel del lquido. Para asegurar que la atmsfera del interior de la cmara est saturada de vapor del eluente se coloca en el fondo una pequea cantidad de ste y se cierra hermticamente.

VARILLA DE VIDRIO PARA DETENER EL PAPEL

PAPEL SUSPENDIDO

CAMARA

RECIPIENTE PARA LA FASE MOVIL

Una vez desarrollado el cromatograma, se marca el frente del eluente y se deja secar. Si los compuestos son incoloros se procede a revelarlos, ya sea por medios fsicos o qumicos. Mtodos fsicos : a) Absorcin UV. Los compuestos con electrones pueden ser detectados con luz UV, y es caracteristica la longitud de onda para cada compuesto.

b) Radiactividad. La posicin de las sustancias marcadas con trazas radiactivas se pueden localizar por medio de una pelcula fotogrfica apropiada, o bien separando el papel con un contador Geiger o un registrador mecnico.
Mtodos qumicos:

Son aquellos que emplean sustancias qumicas llamadas agentes de revelado, que pueden ser gases, lquidos o slidos en solucin. Para aplicar estos reveladores se usan dos mtodos: De baado. El papel se sumerge en un recipiente, el cual contiene la solucin reveladora. De atomizacin. Consiste en separar uniformemente el revelador sobre la superficie del cromatograma por medio de un atomizador especial para cromatografa. Esta tcnica se usa cuando algn compuesto es soluble en el revelador.

Cromatografa en capa fina

Se emplean dos tipos de placa: compacta y suelta. El desarrollo es ms rpido que en papel debido a que el tamao de la partcula es superior, esto da lugar a una mayor resolucin y manchas ms compactas. Para capa compacta se limpia la placa con una solucin concentrada de carbonato de sodio y se lava con agua antes de usarla. Para aplicar la fase estacionaria se utiliza un aplicador mecnico que permite un espesor uniforme de la capa, o manualmente, empleando una varilla para extender la fase estacionaria suspendida en agua que despus se elimina por evaporacin. Normalmente las suspenciones se hacen con agua en ocasiones acidulada o tratada con una base o solucin amortiguadora. El espesor de la placa es por lo general de 0.25 mm.

Para cromatografa de adsorcin en placa ya preparada se activa por calentamiento entre 100 y 150 C, y para la de reparto se deja a la interperie, para que la humedad del aire la desactive.
La de capa suelta exige un manejo mucho ms cuidadoso. Las fases estacionarias son: celulosa microgranular, gel de silice y almina. La seleccin de la fase mvil depende de la fase estacionaria y de los solutos. Si un eluente puro no separa bien la muestra se emplean mezclas. Para sustancias polares se usa celulosa o gel de slice. Para sustancias no polares se usa gel de slice o almina activada. La aplicacin de las muestras es como en papel. El desarrollo de la placa suele ser ascendente se realiza en cmaras recubiertas con papel filtro impregnado en el eluente para saturar la atmosfera. El revelado de la placa se efecta por atomizacin. Para determinacin cuantitativa, las manchas se separan con cuidado de la placa y se elige un mtodo adecuado para su cuanteo.

Cromatografia en columna
La separacin puede realizarse por adsorcin, reparto, intercambio inico y filtracin de geles. Una forma clsica, consiste en una columna de vidrio con una llave en la parte inferior (puede ser una bureta) en la cual se coloca un pequeo filtro que puede ser de porcelana, papel o fibra de vidrio, en posicin vertical y se empaca con la fase estacionaria adecuada. Para que el empacado sea uniforme la columna se golpea con un tubo de goma o se vibra. La muestra se introduce en el eluente, el cual fluye a travs de la columna por efecto de la gravedad producindose una dbil presin por el volumen de la fase mvil que se agrega a la columna, lo que da lugar a la separacin de los componentes de la muestra en zonas que son coloridas o incoloras.

Gotero

Varilla de vidrio

Eluente