Desenvolvimento de Mtodos Bionalticos Aplicao em HPLC

Farmacologia Clnica

Universidade Mogi das Cruzes Maro 2004

Princpios Gerais
Em uma anlise quantitativa de frmacos em

matriz biolgica deve-se tomar cuidado em todas as

etapas, para evitar erros. A amostra a ser analisada deve ser representativa do total; no deve haver perdas e nem contaminaes durante seu preparo. A etapa de separao dos componentes da amostra no cromatgrafo tambm pose ser fonte de erros como:

Adsoro irreversvel de parte da amostra na fase

estacionria

Resposta do detector afetada por alteraes de temperatura e vazo

Quantidade de amostra injetada for da faixa linear

do detector e etc.

Aps a obteno do cromatograma, faz a integrao dos sinais, que tem por finalidade transformar a intensidade do sinal emitido pelo detector em uma medida relacionada com a quantidade da substncia analisada na amostra. A integrao dos sinais pode ser feita usando os seguintes mtodos:

Altura do pico: Este mtodo no muito usado

porque sofre influncia de variaes

instrumentais. Trata-se de uma perpendicular

linha de base passando pela inflexo mxima do

pico; a medida desde a linha de base at este

ponto de inflexo mxima deste pico;

corresponde a altura do pico.

rea do pico: Pode-se calcular a rea do pico

traando -se tangentes nos dois lados do pico; a interseco destas duas tangentes com a linha

de base fornece um tringulo cuja rea pode ser

calculada pela frmula:

A=axw
2

Onde: A = rea do pico

a = altura do pico

w = largura do pico na linha de base

A rea tambm pode ser calculada utilizandose a largura na meia meia altura, isto , formando

um tringulo na metade superior do pico. Neste

caso, a area calculada:

A = a x wH
onde: W H = largura do pico na meia altura

a
2

WH

w
Mtodos para a integrao dos sinais fornecidos pelo registrador: 1. altura pelo pico 2. rea do pico 3. rea na meia altura

Com base nas medidas obtidas na integrao, estas podero ser relacionadas com a

concentrao de uma dada substncia na amostra, atravs dos seguintes mtodos:

Normalizao: Este mtodo requer que todas as

substncias presentes na amostra sejam eludas, e que a resposta do detector seja idntica para todas. Consiste em comparar a rea obtida no cromatograma com a porcentagem da

composio da mistura.

% A = rea A x 100 rea total

Fator de resposta: Se o detector no responde de

maneira similar para todas as substncias

presentes na amostra, necessrio corrigir esta equao usando o chamado fator de resposta que determinado como a porcentagem conhecida e observada exemplo: para cada composto. Assim por

fA = % A conhecida
% A observada

Para calcular a porcentagem da substncia

presente na amostra, basta multiplicar a rea obtida pelo fator de resposta e dividir pela

somatria de todas as reas multiplicadas pelos

respectivos fatores de resposta.

Calibrao externa: Este mtodo compara a rea da

substncia a ser quantificada na amostra com as reas obtidas desta mesma substncia em

solues padro de concentraes conhecidas. Dessa relacionando forma as obtm-se reas um grfico, com as

obtidas

concentraes estabelecidas.

Utilizando este grfico, pode-se calcular a

concentrao desta substncia com a amostra. Este mtodo sensvel a erros de injeo das

solues padro e das amostras, bem como a

erros relacionados com a preparao dos

padres.

Calibration curve
1500

rea

1000

500

0 0 250 500 750 1000 1250

C (ng/mL)
Slope Y -intercept X-intercept 1/slope 95% Conf idence Intervals Slope Goodness of Fit r 0.9644 0.03746 -5.000 5.185 1.037 0.8727 to 1.056 0.9910

Padronizao interna: Consiste em adicionar uma

quantidade conhecida de uma sunstncia padro na amostra a ser analisada, e relacionar ad duas reas

resultantes.

Normalmente,

uma

substncia

empregada como padro interno deve possuir caractersticas:

 mesma similaridade substncia em anlise ter

concentrao e tempo de reteno a substncia em exame

inerte no fazer parte da amostra analtica ter

um perfil cromatogrfico caracterstico e diferente das demais substncias presentes na amostra

Aps a anlise dessas substncias constri-se

um grfico, relacionando a razo de reas (Ax/Api) com a concentrao desta substncia. Atravs da

razo de reas obtidas no cromatograma tem-se a

concentrao da substncia na amostra, utilizando o grfico da calibrao externa.

Este mtodo menos sensvel a erros de

injeo, variaes instrumentais, etc. o melhor

mtodo para anlise quantitativa.

Calibration curve
1500

Ratio (Ax / API)

1000

500

0 0 250 500 750 1000 1250

C (ng/mL)
Slope Y-intercept X-intercept 1/slope 95% Confidence Intervals Slope Goodness of Fit r 0.9644 0.03746 -5.000 5.185 1.037 0.8727 to 1.056 0.9910

General Procedure of Liquid/Liquid

Extraction

Applied Bioequivalence Studies

Step 1

Step 2

Step 3

Sample

Sample + Internal standard

Vortex mixing

Step 4

Step 5

Step 6

Adittion Organic Solvent

sample extraction vortex mixing

Centrifugation

Step 7

Step 8

Step 9 N2

Separation phases

Collection organic phase

Dried organic phase

Step 10

Step 11

Step 12

Injection sample

Reconstituted sample

Brief mixing

Phase Solid Extraction

Quantitative Determination of Drugs in Serum by HPLC

Applied Bioequivalence Studies

Determination of diclofenac in Human Plasma by HPLC

Method:

System Chromatography: consisted of a LKB-Bromma 2150 HPLC, pump coupled to a VWM 2141 dual wavelenght UV detector (Pharmacia-LKB,Uppsala, Sweden). The output sinal was registered in a Nryans 28000 chart recorder ( Bryan Souththern Instruments, Kent, Great Britain)

Mobile Phase: acetonitrile;water (40:60, v/v) and 0.1 mol/L

acetic acid solution; the pH was ajusted to 5.6 with 3 mol?L

sodium hidroxide.

Flow rate: 2.3 mL/min

Column Chromatography: Spherisorb ODS-25mm, 4.6 mm x

250mm Sigma Aldrich (ST. Louis,MO,USA

Detection: 276nm (U.V absorbance)

Extraction Procedure
500 L calibretion point or serum sample + 580 ng Indometacina (I.S) + 200 L of 5% phosphoric acid Brief vortex mixing 4 mL Dicloromethane Vortex mixing 1 min Centrifuged 2000 rpm 10 min Phase organic washed with 200 L amonium acetate 1:20 in water Centrifuged 2000 rpm 2 min

Organic Phase 45 C under nitrogen stream

The residue 100 L of acetonitrile

Analytical Sample 20 L

Determination of Terbinafine in Human Plasma by LC/MS-MS

Method:

System Chromatography: consisted of a Hewlett Packard HPLC, binary pump, autosampler injector, degasser, thermostat column, variable-wavelenght UV, coupled a The Quatro II (Micromass, Altringham, Cheshire UK equipped with a

electrospray source.

Mobile Phase: Acetonitrile:water (80:20) containing 10 mmol/L

formic acid

Flow rate: 0.50 mL/min

Column Chromatography: Genius C18 4um analytical column (150 mm x 4.6 mm i.d) 40C Detection: The Quatro II equipped with a electrospray source using a crossflow counter electrode in mode (ES+)

and mutiple reaction mode (MRM), monitoring 292.2>140.7

and. 288.2>116.9 for terbinafine and naftifine, repectively. The cone voltage and collission energy were 35V and 15 eV for terbinafine and 12 eV for naftifine.

Extraction Procedure
200 L calibretion point or serum sample + 20 L Naftifine ( 1 g/mL methanol: water 50:50) Brief vortex mixing 4 mLDiethyl Ether:Hexane (80:20) Vortex mixing 1 min Centrifuged 2000 rpm 10 min Organic Phase 37 C under nitrogen stream

The residue 200 L of acetonitrile: water (80:20) containing 10 mmol/L formic acid

Analytical Sample 50 L

Determination of Fluconazole in Human Plasma by LC/MS-MS

Method:

System Chromatography: consisted of a Hewlett Packard HPLC, binary pump, autosampler injector, degasser, thermostat column, variable-wavelenght UV, coupled a The Quatro II (Micromass, Altringham, Cheshire UK equipped with a electrospray source.

Mobile Phase: Acetonitrile:water (40:60) containing 5 mM

acetic acid pH= 3.7

Flow rate: 0.9 mL/min isocratic gradient

Column Chromatography: Genesis C18 4um analytical column (10 mm x 4.0 mm i.d) 40C Detection: The Quatro II equipped with a electrospray source using a crossflow counter electrode in mode (ES+)

and mutiple reaction mode (MRM), monitoring 171.8>127.7

and 306.9>219.8 for metronidazole and fluconazole,

repectively. The cone voltage and collission energy were 30V and 20eV, respectively.

Extraction Procedure
200 L calibretion point or serum sample + 200 L of carbonatebicarbonate buffer containing metronidazole (I.S) 1 g/mL Brief vortex mixing 3 mL Diethyl ether/dicloromethane (70:30) Vortex mixing 5 min Centrifuged 2000 rpm 10 min Organic Phase 37 C under nitrogen stream

The residue
Acetonitrile:water (40:60) containing 5 mM acetic acid

Analytical Sample 10 L

Propanolol in Serum
HPLC Method
Column: Symmetric Shield RP8 3.9 x 150 mm, 5 m Guard Column: Sentry guard column, 3.9 x 20 mm, 5 m Mobile Phase: 20mM phosphate potassium, pH 7/methanol 39:62

Flow rate: 1 mL/min

Injection volume: 20 L porcine serum Temperature: 30 C

Detection: 254 nm (U.V)

Components: Propanolol and Butyl Paraben (I.S)

Oasis HLB Extraction Method

Oasis HLB 1cc/ 30 mg Extraction Cartridge

Condition 1mL methanol/1ml water

Load 1mL spicked porcine serum

Wash 1mL 5% Methanol in water Eluent 1mL Methanol + 5g butyl paraben Evaporate and Constitute 40 C under nitrogen stream 200L Methanol

Tetracyclines in Serum
HPLC Method
Sample: 1 mL spicked porcine serum / 2% phosphoric acid

solution / demecycline as I.S

Column: Symmetric Shield RP8 3.9 x 150 mm, 5 m Guard Column: Sentry guard column, 3.9 x 20 mm, 5 m Mobile Phase: 0.1 % TFA in water Acetonitrile:methanol (91:7:2) Flow rate: 0.9mL/min Injection volume: 20 L porcine serum Temperature: 30 C Detection: 279 nm (U.V)

Oasis HLB Extraction Method

Oasis HLB 1cc/ 30 mg Extraction Cartridge

Prepare Sample Mix 20L (H2 PO4) to 1mL serum Condition 1mL methanol Rinse 1mL water Load 1mL sample

Wash 1mL 5% Methanol in water Elute 1mL Methanol Evaporate to 0.2 mL

Reconstitute with mobile phase

Sulfa Drugs in Serum

HPLC Method
Column: Symmetric Shield RP8 3.9 x 150 mm, 5 m Guard Column: Sentry guard column, 3.9 x 20 mm, 5 m Mobile Phase: 1% glacial acetic acid and 4% methanol in water Flow rate: 1 mL/min Injection volume: 10 L porcine serum Temperature: 25C Detection: 254 nm (U.V) Components: Sulfadiazine, Sulfathiazole (I.S) and Sulfamerazine

Oasis HLB Extraction Method

Oasis HLB 1cc/ 30 mg Extraction Cartridge

Condition 1mL methanol/1ml water Load 1mL spicked porcine serum with 10g/mL sulfathiazole (I.S), 20 L phosphoric acid

Wash 1mL 5% Methanol in water

Eluent 1mL Methanol

Evaporate and Constitute 40 C under nitrogen stream 1mL mobile phase