CROMATOGRAFIA

Principio Bsico
Separacin de mezclas por interaccin diferencial de sus componentes entre una FASE ESTACIONARIA (lquido o slido) y una FASE MVIL (lquido o gs).

Modalidades y Clasificacin

CROMATOGRAFIA

FM = Lquido

Cromatografa Lquida
Cromatografa Gaseosa (CG)

FM = Gs

Slida
En CG la FE puede ser:

Cromatografa Gs-Slido (CGS)

Lquida

Cromatografa Gs-Lquido (CGL)

CROMATOGRAFA GASEOSA
Aplicabilidad
Qu mezclas pueden ser separadas por CG ?

(para cualquier mezcla de sustancias que pueda ser arrastrada por un flujo de gas en el que se pueda disolver - por lo menos parcialmente)

Mezclas cuyos constituyentes sean

VOLTILES (evaporables)

DE FORMA GENERAL: CG es aplicable para la separacin y anlisis de mezclas cuyos constituyentes tengan PUNTOS DE EBULLICIN de hasta 300oC y que sean trmicamente estables.

O Cromatgrafo a Gs
1 2 6

5 3
1 - Baln de Gs y Controles de Presin. 2 - Inyector (Vaporizador) de la muestra. 3 - Columna Cromatogrfica y Horno de la Columna. 4 - Detector. 5 - Electrnica de Tratamiento (Amplificacin) de Seal. 6 - Registro de la Seal (Integrador o Computador). Observacin: en rojo: temperatura controlada

INSTRUMENTACIN
Gas de Arraste
Fase Mvil en CG: NO interacciona con la muestra - apenas la transporta a travs de la columna. Usualmente nos referimos a ella como GAS DE ARRASTE

Requisitos:
INERTE No debe reaccionar con la muestra, la fase estacionaria u otras superfcies del instrumento. PURO Debe ser libre de impurezas que puedan degradar la fase estacionaria.
Impurezas tpicas en gases y sus efectos:

H2O, O2 hidrocarburos

oxida / hidroliza algunas FE incompatibles con ECD ruido a la seal de FID

INSTRUMENTACIN
Inyector Convencional
2 1

3
5 4
1 - Septa; 2 - Entrada de gas de arrastre; 3 - Liner (mezclador); 4 - Columna 5 - Purga del gas de arrastre; 6 - Vlvula de control de purga.

Los dispositivos de inyeccin (INYECTORES o VAPORIZADORES) deben proveer medios de introduccin INSTANTNEA de la muestra en la columna cromatogrfica

Microjeringas para Injeccin

LQUIDOS Capacidades tpicas: 1 L, 5 L e 10 L
Microjeringa de 10 L:
mbolo aguja (inox 316)

INSTRUMENTAO

cuerpo (pirex)

Microjeringa de 1 L (seccin ampliada):

cuerpo aguja

guia mbolo

INSTRUMENTACIN
Parmetros de Inyeccin
TEMPERATURA DEL INYECTOR Debe ser lo suficientemente elevada para que la muestra se vaporize inmediatamente, sin descomposicin Regla General : Tinj = 50oC por encima de la temperatura de ebulio del componente menos voltil VOLUMEN INYECTADO Depende del tipo de columna y del estado fsico de la muestra
COLUMNA
empacada = 3,2 mm (1/4) capilar = 0,25 mm

Muestras Lquidas
0,2 L ... 20 L 0,01 L ... 3 L

Muestras Gaseosas
0,1 ml ... 50 mL

0,001 ml ... 0,1 mL

Slidos: convencionalmente se disuelven en un solvente adecuado y se inyectan en soluo

Columnas: Definiciones Bsicas

INSTRUMENTACIN

EMPACADA = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m

CAPILAR = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m

Rellena con un slido pul- Paredes internas recubierverizado (FE slida o FE tas con una pelcula fina lquida depositada sobre (en m) de FE lquida o las partculas del relleno) slida

COLUMNAS CAPILARES
Definiciones Bsicas
Tubo fino de material inerte con FE lquida o slida depositada sobre las paredes internas.
MATERIAL DEL TUBO
slica fundida vidro pirex Acero inox. Nylon Silcosteel

= 0,1 mm a 0,5 mm L=5m a 100 m

Las columnas de slica son revestidas externamente con una capa de polimero (poliimida) para aumentar su resistencia mecnica y qumica

Columnas Capilares x Empacadas:

CAPILARES L = N Columnas mas eficientes FC = 1 ... 10 mL.min-1 Control ms difcil Vi Dispositivos especiales de inyeccin

Famlias de Colunas Capilares :

WCOT (Wall coated open tube) FE liquida deposida (ligada //

entrecruzada) sobre las paredes internas.

PLOT (Porous layer open tube) Camada de FE slida presa s

paredes internas

SCOT (Support coated open tube) Predes internas revestidas

com material de recheio similar ao das colunas empacotadas

COLUMNAS CAPILARES
Columnas Capilares: Inyeccin
Baja capacidad de procesamiento de muestra (submicrolitros)

Inyeccin directa con microjeringa muy difcil !!!

Inyectores con divisin (splitters) Sistema

neumtico que elimina una fraccin de la muestra inyectada 1

2 3 4 5
1 - Septa; 2 - Entrada de gas de arraste; 3 - Liner (mezclador) 4 - Columna Capilar 5 - Purga de gas de arraste; 6 - Vlvula de control de purga.

6
- Menor sensibilidad (gran parte de la muestra es eliminada) - Divisin de la muestra raramente es uniforme (fraccin purgada de los constituyentes menos voltiles es siempre menor) - Ajuste de la razn de divisin es ms una fuente de error

INSTRUMENTACCIN
Horno De la Columna
Caractersticas Deseables de un Horno: AMPLIO RANGO DE TEMPERATURA DE USO Por lo menos de Tambiente hasta 400oC. Sistemas criognicos (T < Tambiente) pueden ser necesarios en casos especiales.

TEMPERATURA INDEPENDIENTE DE LOS DEMAS MDULOS No debe ser afectado por la temperatura del inyector y detector.
TEMPERATURA UNIFORME EN SU INTERIOR Sistemas de ventilacin interna muy eficientes para mantener la temperatura homognea en todo el horno.

INSTRUMENTACIN
Horno de la Columna
Caractersticas Deseables de un Horno: FCIL ACCESO A LA COLUMNA La operacin de cambiar de coluna puede ser frecuente. CALENTAMIENTO Y ENFRIAMIENTO RPIDO Importante tanto en los anlisis de rutina y durante el desarrollo de metodologias analticas nuevas.

TEMPERATURA ESTABLE Y REPRODUCIBLE La temperatura

debe mantenerse con exactitud y precisin de 0,1C. En los cromatgrafos modernos (despus de 1980), el control de la temperatura del horno es totalmente controlado por microprocesadores.

Programacin Lineal de Temperatura

Mezclas complejas (constituyentes con volatilidades muy diferentes) separados ISOTRMICAMENTE: TCOL BAJA:
- Componentes mas voltiles son separados

INSTRUMENTACIN

- Componentes menos voltiles demoran en eluir, saliendo como picos mal definidos

TCOL ALTA:
- Componentes mas voltiles no son separados - Componentes menos voltiles eluyen mas rpidamente

FASES ESTACIONARIAS
Conceptos Generales
LQUIDOS Depositados sobre la superficie de: slidos porosos inertes (columnas empacadas) o de tubos finos de materiales inertes (columnas capilares)
FE lquida SOPORTE Slido inerte poroso Tubo capilar de material inerte

Para minimizar la perdida de FE lquida por volatilizacin, normalmente es:

Entrecruzada: las cadenas polimricas son qumicamente unidas entre si

Qumicamente ligadas: las cadenas polimricas son fijadas presas al soporte por uniones qumicas

SLIDOS Columnas rellenas con material finamente

granulado (empacadas) o depositado sobre la superficie interna del tubo (capilar)

FASES ESTACIONARIAS
Caractersticas de una FE ideal
SELECTIVA Debe interactuar diferencialmente
con los componentes de la muestra.

FE Selectiva: separacin adecuada de los constituyentes de la muestra

FE poco Selectiva: mala resolucin

Regla general: la FE debe tener caractersticas similares a la de los solutos a ser separados (polar, apolar, aromtico ...)

FASES ESTACIONARIAS
Caractersticas de una FE ideal
AMPLIA RANGO DE TEMPERATURAS DE USO Mayor flexibilidad en la optimizacin
de la separacin.

BUENA ESTABILIDAD QUMICA Y TRMICA Mayor durabilidad de la

columna, no reaccione con los componentes de la muestra

POCO VISCOSA Columnas mas

eficientes (menor resistencia a la transferencia del analito entre las fases)

DISPONIBLE EN ELEVADO GRADO DE PUREZA Columnas reproducibles;

ausencia de picos fantasmas en los cromatogramas.

FASES ESTACIONARIAS
Familias de FE Lquidas
SILICONAS (polisiloxanos) Es la FE ms
empleada en CG. Cubre amplio rango de polaridades y propiedades qumicas diversas.
CH3 H3C Si CH3 R1 O Si R2 CH3 O Si CH3 n CH3

R1, R2 = qualquier radical orgnico

- La Unin Si-O es extremadamente estable = elevada estabilidad trmica y qumica de las FE.

- Las Siliconas son fabricadas en gran escala para diversas aplicaciones = minimizacin del costo del producto + tecnologa de produccin y purificacin ampliamente estudiada y conocida. - Practicamente cualquier radical orgnico o inorgnico puede ser unido a la cadena polimrica = FE ajustables a separaciones especficas + facilidad de inmobilizacin por entrecruzamiento y unin qumica a el soporte

FASES ESTACIONARIAS
Familias de FE Lquidas
Separacin de pesticidas - FE = 100 % PDMS
1 - TCNB 2 - Dichloram 3 - Lindano 4 - PCNB 5 - Pentacloroanilina 6 - Ronilano 7 - Antor 8 - pp-DDE 9 - Rovral 10 - Cypermetrin 11 - Decametrin

17 min

Columna: CP-Sil 5 (25 m x 0,32 mm x 0,12 m) TCOL:195oC (6,5 min) / 195oC a 275oC (10oC.min-1) Gas de Arraste: He @ 35 cm.min-1 Detector: FID Muestra: 2L de solucin de los pesticidas.

FASES ESTACIONARIAS
Familias de FE Lquidas
Separacin de piridinas-FE = 100 % CNpropilsilicone
1 - piridina 2 - 2-metilpiridina 3 - 2,6-dimetilpiridina 4 - 2-etilpiridina 5 - 3-metilpiridina 6 - 4-metilpiridina

Columna: CP-Sil 43CB (10 m x 0,10 mm x 0,2 m) TCOL:110oC (isoterma) Gas de Arraste: N2 @ 16 cm.min-1 Detector: FID

3 min

Muestra: 0,1L de solucin 1-2% de las piridinas en 3-metilpiridina

INSTRUMENTACIN
Detectores
Dispositivos que examinan continuamente el material eluido, generando una seal cuando se da el paso de una sustancia que no es el gas de arrastre

Grfico Seal x Tiempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada sustancia separada aparece como un PICO en el cromatograma.

DETECTORES
Classificao

UNIVERSALES:
Generan seal para cualquier sustancia eluida.

SELECTIVOS:
Detectan slo sustancias con determinada propriedad fsico-qumica.

ESPECFICOS:
Detectan sustancias que tengan determinado elemento o grupo funcional en sus estructuras

DETECTORES
Definiciones Generales
Dispositivos que generan una seal elctrica proporcional a la cantidad eluida de un analito ~ 60 detectores ya usados em CG

~ 15 equipan a cromatgrafos comerciales

4 responden a la mayor parte de las aplicaciones

TCD
Detector de Condutividad Trmica

FID
Detector por Ionizacin de Llama

ECD
Detector por Captura de Eletrones

MS
Detector Espectromtrico de Masas

INSTRUMENTACI
Detectores
Ms Importantes:
DETECTOR DE CONDUTIVIDAD TRMICA
(TCD) Variacin de la condutividad trmica

del gas de arrastre.

DETECTOR DE IONIZACIN DE LLAMA (FID)

Variacin del voltaje por los iones generados durante la combustin de los eluidos en una llama de H2 + ar.
DETECTOR DE CAPTURA DE ELECTRONES
(ECD) Supresin de corriente causada por

la absorcin de electrones por los eluidos altamente eletroflicos. ANALGICO REGISTRO DE SEAL
Registradores XY

DIGITAL
Integradores Computadores

DETECTORES
Detector de Conductividad Trmica
PRINCIPIO Variacinde la conductividad trmica de
un gas cuando ocurre la elucin de un analito.
La razn de transferencia de calor entre un cuerpo caliente y un cuerpo frio depende de la conductividad trmica del gas en el espacio que separa los cuerpos

Si la conductividad trmica de un gas disminuye, la cantidad de calor transferido tambin disminuye

i
5

Celda de Deteccin del TCD:

1 Bloque metlico
2 Entrada de gas de arraste

3 4

3 Salida del gas de arraste 4 Filamento metlico 5 Alimentacin de corriente

elctrica

DETECTORES
TCD: Aplicaciones
1 Separacin y cuantificacin de compuestos que no
generan seal en otros detectores (gases nobles, gases comunes)

Separacin de Gases Comunes y Hidrocarbonos:

Columna: CP Sil 5CB (50 m x 0.32 mm x 5 m) Gs de Arraste: He @ 3 ml.min-1

TCOL: 40C Detector: TCD

1 N2
3 CO2 5 NH3 7 i-C4

2 CH4
4 n-C2 6 n-C3 8 n-C4

2 Por ser un detector no-destructivo, puede ser usado en

CG preparativa o deteccin secuencial con dos detectores en tandem

DETECTORES
Detector por Ionizacin de Llama (FID)
PRINCIPIO Formacin de iones cuando un
compuesto es quemado en una Llama de hidrogeno y oxigeno

El efluente de la columna es mezclado con H2 y O2, y es quemado. Como en una Llama de H2 + O2 no existen iones, ella no conduce la corriente elctrica.

Cuando un compuesto orgnico eluye, tambim es quemado. Con una suave combustin se forman iones, la Llama pasa a conducir la corriente elctrica

DETECTORES
Detector por Ionizacon de Llama
COLETOR

AR
FLAME TIP

H2
BLOCO

COLUNA
El aire y el H2 se difunden para el interior del colector, donde se mezclan con el efluente de la columna y se combustionan: Una diferencia de potencial elctrico se aplica entre el tip de la llama y el coletor - cuando se forman iones en la Llama, fluye una corriente elctrica:

DETECTORES
Caractersticas Operacionales del FID
SELEcTIVIDAD Selectivo para sustancias que contienen enlaces C-H en su estructura qumica.
(como virtualmente todas las sustancias analizables por CG son orgnicas, la prctica del FID es UNIVERSAL)

Compuestos que NO producen respuesta al FID:

Gases nobles H2, O2, N2 CO, CO2, CS2 CCl4, peralogenados NH3, NxOy SiX4 (X = halogenos) H2O HCOOH, HCHO *

DIC

CH4 CO2 O2

DCT

N2

SENSIBILIDAD / LINEALIDAD QMD tpicas = 10 pg a 100 pg con linealidad entre 107 e 108 (pg a mg)

DETECTORES
Detector de Captura de Electrones - ECD
PRINCIPIO Supresin de um flujo de electrones
causado por su absorcin por especies electroflicas Un flujo contnuo de electrones lentos es estabelecido entre un nodo (fuente radiactiva b -emisora) y un catodo.

Al paso de una sustancia electroflica algunos electrones son absorvidos, resultando en una supresin de corriente elctrica.

DETECTORES
Detector de Captura de Electrones - ECD
1

1 Ando (fonte radioativa b - emissora) 2 Sada de gases 4 Cavidade 3 Catodo 5 Coluna cromatogrfica

DETECTORES
ECD: Aplicaes
Contaminantes en aire atmosfrico - deteccin paralela FID + ECD

FID

ECD

1, 2, 3 - Hidrocarburos aromticos 4, 5, 6 - Hidrocarburos clorados

ANLISIS CUALITATIVO
Conceptos Generales
Identificacin individual de las especies contenidas en una muestra Determinacin de la identidad de la muestra adecuadamente hecha

Aplicaciones Cualitativas de la CG

Fuentes de Informaciones Cualitativas

RETENCIN Uso de datos de Tr de un analito para su
identificacin

DETECCIN Detectores que brindan informacion

estructural de las sustancias eludas

Para anlisis cualitativo confiable por CG es recomendable la combinacin de datos provenientes de por lo menos dos fuentes

ANLISIS CUALITATIVO
Tiempos de Retencin
Interacciones analito / FE Presin de vapor del analito
Condiciones operacionales (TCOL, FC ...)

tR = f

Fijas las condiciones operacionales, el tiempo de retencin de un analito es una constante

MUESTRA

PATRN

Comparao de cromatogramas da amostra e de uma soluo padro do analito suspeito

ANLISIS CUALITATIVO
Tiempos de Retencin
Comparacin del tR usando dopage (spiking) de la muestra con un analito sospchoso: aumento de la confiabilidad de la identificacin.

Muestra compleja: incertidumbre de los tr medidos pueden llevar a una identificacin errnea

La comparacin con un cromatograma de la muestra dopada permite una identificacin ms confiable del compuesto desconocido

ANLISIS CUALITATIVO
Mtodos de Deteccin Cualitativos
Mtodos de deteccin que brindan informacin cualitativa sobre los analitos eludos:

Cromatografia Gasosa com Deteo Espectromtrica de Massas (CG-EM)

Cromatografia Gasosa com Deteo Espectromtrica por Emisso Atmica (CG-EA)

Cromatografia Gasosa com Deteo Espectromtrica por Absoro no InfraVermelho (CG-EIV)

Identificao muito confivel quando combinados a tcnicas de identificao baseadas em reteno

ANLISE QUALITATIVA
Espectro de Massas

20

40

60

80

100

120

m/Z
- CO

m/Z = 80

m/Z = 118

- (CO + H)

m/Z = 79

m/Z = 90

ANLISE QUALITATIVA
Acoplamento CG - EM
Sistema de Controle e Aquisio de Dados:

MANDATRIO que sistemas CG-EM sejam totalmente controlados por microcomputador.

Sistema de Controle e Aquisio de Dados:

1 2 3

Gerencia e monitora o funcionamento dos mdulos de CG e EM. Coleta e arquiva espectros de massa em intervalos regulares de tempo e constroi o cromatograma. Aps a corrida, compara espectros coletados com bases de dados para identificao dos eluatos.

COMPUTADORES RPIDOS E COM GRANDE CAPACIDADE DE ESTOCAGEM DE DADOS

ANLISE QUALITATIVA
CG-EM: Gerao do Cromatograma
Espectros de massas completos coletados e arquivados em intervalos regulares de tempo
Gerao do cromatograma a partir dos espectros: CROMATOGRAMA DE ONS TOTAIS (TIC = Total Ion Chromatogram)
Para cada espectro o nmero total de ons detectados na faixa de massas varrida somado e plotado em funo do tempo, gerando o cromatograma.

MONITORAMENTO DO ON SELECIONADO (SIM = Single Ion Monitoring)

Seleciona-se um fragmento resultante da fragmentao da espcie de interesse. Gera-se o cromatograma plotando-se o nmero de ond detectados com a massa desse fragmento em funo do tempo.

TIC
Universal Similar a DIC

SIM
Seletivo Maior Sensibilidade

ANLISE QUALITATIVA
CG-EM: TIC x SIM
Aroma de polpa industrializada de caj aps extrao por SPME

TIC
Aparecem os picos correspondentes a todas substncias eludas

SIM (m/z = 149)

Cromatograma construido a partir dos mesmos dados acima, mas apenas usando fragementos com massa = 149 (ftalatos: plastificante)