El objetivo de este trabajo fue obtener un modelo fenomenolgico que describa el perfil de elusin, en cromatografa de interaccin hidrofbica de una

protena inyectada como pulso. Se adapt el modelo de platos, el que fue resuelto numricamente, obtenindose un buen ajuste a los datos experimentales. El modelo de platos permiti realizar simulaciones del proceso bajo distintas condiciones de operacin, como velocidad de flujo, gradiente de elucin y volumen de muestra inyectada. Se concluye que es posible aplicar la teora de platos para describir perfiles de elucin de protenas en cromatografa de interaccin hidrofbica. El modelo obtenido podra ser utilizado para optimizar la separacin de una mezcla de protenas.

Debido a la relevancia biotecnolgica de HIC, se han hecho esfuerzos para determinar de qu forma las caractersticas de las protenas y las condiciones de operacin del sistema afectan el perfil de elucin y el tiempo de retencin de las protenas.

Se ha logrado establecer que las principales variables de proceso son el tipo y la concentracin mxima de sal utilizada para formar el gradiente de elucin y el tipo de matriz cromatogrfica, mientras que de las propiedades de las protenas, la ms importante sera la hidrofobicidad.

Modelos basados en la hidrofobicidad de las protenas. Modelos basados en las condiciones de operacin del sistema. Modelo de platos tericos.

1) Cuantificacin de protenas mediante mtodo de Bradford. Se tomaron muestras de 1 mL a diferentes tiempos de incubacin: 30; 65; 95; 190 y 340 minutos.

Soluciones de lisozima (2, 1.6, 1.2, 0.8, 0.4, 0 mg/mL) + 1 mL de resina (Phenyl Sepharose 6 FF

Usando BSA como estndar.

Mtodo de Bradford

2) Cuantificacin por cromatografa lquida FPLC Se utiliz una columna de 1 mL para empacar la resina. Con un bucle de inyeccin de 100 L. Los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente (20 C) utilizando una velocidad de flujo igual a 0.75 mL/min y un gradiente decreciente de sal en 10 volmenes de columna. La solucin de salida fue monitoreada a 280 nm y se registr el volumen de retencin y la conductividad. Se inyect una solucin de lisozima 0.5 mg/mL. La fase mvil final fue buffer bis-tris 20 mM pH 7.0, y la fase mvil inicial fue el mismo buffer adicionado de 2 M sulfato de amonio.

El coeficiente de particin K fue determinado a partir de los datos de adsorcin discontinua (mtodo de Bradford), utilizando regresin lineal (r2 = 0.998). La isoterma de adsorcin se muestra en la ecuacin (8), donde K es igual a 336 mL solucin / mL resina. Las caractersticas del sistema cromatogrfico se muestran en las tablas 1 y 2.

La conc. mx. a la salida fueron parecidas (Np= 15 y Exp.) La conc. inyectada fue muy grande, es por eso la anchura de la seal. El parmetro Np se vio afectado por la velocidad de flujo y la difusividad crtica. Una menor desviacin estndar se relaciona con un pico ms angosto, y por lo tanto con un menor efecto de dispersin.

Se investig el efecto del volumen de muestra inyectada, velocidad de flujo y gradiente de elucin sobre el perfil de elucin de una protena. Los resultados se presentan en la figura.

Efecto de la velocidad de flujo [mL/min]

Muestra que la velocidad de flujo afecta el tiempo de retencin de manera inversamente proporcional: a menor flujo, mayor tiempo de retencin, manteniendo las dems condiciones de operacin constantes. Situacin que justifica el hecho que con un flujo igual a 0.75 mL/min Y/Yo sea levemente mayor que para flujos ms altos.

Gradiente de elucin [-M/mL]

Muestra que el gradiente de elucin afecta el tiempo de retencin, la mxima concentracin a la salida y el ancho del pico. Un mayor gradiente implica que el tiempo en el cual la protena se encuentra bajo condiciones de elucin es menor, por lo cual el perfil tiende a asemejarse ms a una respuesta tipo pulso, es decir, un pico ms angosto, lo que a su vez significa que existe un menor efecto de dispersin. Como se simul igual cantidad de protena inyectada en los tres casos analizados, resulta lgico pensar que a menor dispersin se obtiene una mayor concentracin mxima de salida (Y/Yo).

Volumen de muestra inyectada [mL]

muestra que el volumen de muestra inyectado afecta el ancho del pico, la mxima concentracin a la salida, y el tiempo de retencin de la protena. Un mayor volumen de muestra se traduce en un pico ms ancho (mayor dispersin) y ms alto (mayor Y/Yo). Adems, la disminucin del volumen de muestra implica un retraso en la elucin de la protena, esto es, un tiempo de retencin mayor. Esta situacin puede atribuirse a una posible saturacin de la columna debido a la elevada cantidad de protena inyectada, lo que adelantara su elucin.

En cuanto al nmero de platos (Np), es posible afirmar que ni el volumen de muestra ni la pendiente del gradiente influyen sobre este parmetro, a diferencia de la velocidad de flujo y la difusividad crtica, que tienen un efecto importante sobre Np.

El parmetro Dcrit, que representa la difusividad crtica en la fase estacionaria, influye directamente sobre el nmero de platos (Np). Un menor Dcrit implica un mayor nmero de platos, lo que a su vez se traduce en un pico ms angosto. Esto significa que un aumento en la difusividad crtica en la fase estacionaria implica una disminucin de la resistencia a la transferencia de masa interna, luego la curva de elucin se acerca ms a una respuesta tipo pulso.