Anda di halaman 1dari 23

KLT Preparatif (KLTP)

Metode isolasi : 1. sederhana dan mudah dilakukan untuk pemisahan produk alam (popularitas berkurang setelah kesuksesan HPLC dan countercurrent Chrommatogrphy). 2. tidak membutuhkan peralatan mahal. 3. Pemisahan dapat dilakukan dg cepat. 4. Dapat menghasilkan dg isolat 1 mg 1 g (cukup untuk elucidasi struktur).

Kapan Penggunaan KLTP ??


untuk pemurnian tahap akhir dalam prosedur isolasi ( tergantung kompleksitas ekstrak).

Biomass (Plant, ekstraksi Mikroba, Insect Partisi or marine)

Fraksi nonpolar Kromatografi kolom KCV, CC, HPLC Lebih dari 1 tahap?? KLTP

Fraksi polar

Jika campuran komplek dilakukan KLTP sebagai langkah awal, maka materi banyak pengulangan, banyak plate dan waktu lama. (KLTP diutamakan untuk pemisahan campuran yang telah dipisahkan sebagian). Campuran komplek, sebagai langkah awal dipisahkan dg KCV, KK lebih dahulu sebelum KLTP

Kapan Penggunaan KLTP ??


Senyawa yang dapat dipisah dg KLTP sangat tergantung bagaimana profilnya pada sistem kromatografi (umumnya pemisahan campuran tak lebih 4 komponen mayor). Data Proses isolasi tritepen friedelane : Species Phyllobotryon spathulatum (kulit) Ekstrak Petroleum dan CHCl3 Step (1) VLC pada silika gel. Fraksi dielusi dg 25% EtOAc dalam Hexane Step (2) KLTP dg Toluen-EtOAcAcOH (80:18:2)
O

Struktur
CH3 HO OH

FRIEDELANE

Membutuhkan hanya satu kali tahap pemurnian sebelum KLTP tidak mempunyai kromophor visualisasi dg pereaksi semprot : Vanilin H2SO4

Scale-Up dari lempeng analitik ke KLTP


scale-up dari analitik ke preparatif terjadi perubahan ukuran sistem pemisahan mempengaruhi kromatografi produk natural - ketebalan sorbent : Analitik 0,1-0,2 mm, KLTP : 0,5-4 mm - ukuran plate : Analitik < 20x20 cm, KLTP : 20 x 20 cm - ukuran partikel (ex silika) : Analitik 5-20 m, KLTP 5-40 m
Kromatografi dr senyawa yang dipisahkan dg lempeng analitik (1 g) bahan) profil dapat berubah signifikan bermakna ketika beberapa miligram (10 mg) diaplikasikan. Salah satu yg berpengaruh : ukuran partikel sorbent. Pada silika (phase normal), ketika mengubah dari analitk ke skala preparatif, mungkin diperlukan mengurangi polaritas solven untuk mendapatkan Rf sama (trial and error) contoh : Pemisahan campuran 2 komponen yg pada analitik dg heksana : EtOAc (60:40) sebagai phase mobil perlu sistem yang kurang polar seperti heksana : EtOAc (90:10) untuk menghasilkan Rf yang sebanding.

Lempeng KLTP komersial


Karakteristik : Lempeng yang biasa digunakan : silika, alumina, C18, dan selulosa dg ketebalan 0,5, 1,0 dan 2 mm. Lempeng silika distribusi ukuran partikel 5 40 m, dibandingkan plate analitik 5 20 m. Lempeng silika mempunyai luas permukaan tinggi, sangat homogen dan memberikan hasil yang bagus. Lempeng normal phase memerlukan pre-elusi dg solven polar seperti diklormethan untuk membersihkan dan mengambil kontaminan. Pengotor dapat diambil dg solven ke plate atas dan kemudian dikeringkan sebelum digunakan. Ketika membuka kemasan, Lempeng yg belum digunakan sebaiknya disimpan di desikator krn keberadaan air akan berpengaruh pada aktivitasnya (khususnya silika).

Lempeng preparatif yg dibuat sendiri lebih fleksible dalam pemilihan sorben dapat memvariasi ketebalan plate memerlukan penambahan binder (CaSO4), beberapa jenis sorbent silika sudah mengandung binder (Merck) lempeng yang disiapkan dapat menggunakan indikator UV atau tidak. Jika dilakukan penggabungan perak nitrat pada sorbent, plate sebaiknya disimpan dan dikembangkan ditempat gelap untuk menghindari perubahan warna sorben. Lebih murah

Aplikasi sampel
Sebelum digunakan (jika buat sendiri) plate preparatif dioven 115C selama 4 jam kmd didinginkan pd suhu kamar. Sampel yang diperiksa dilarutkan dalam sedikit pelarut (umumnya konsentrasi 10-20 mg/ml). Sampel ditotolkan dekat tepi dasar (~1,5cm) sebagai garis tipis (lebar 2 4 mm) menggunakan mikrosiring (pipa kapiler) Jika diperlukan, aplikasi sampel ditandai dg pencil (sekitar 1,5 dari tepi) atau dg bantuan kertas HVS A4 yg diletakkan atas plate. Jangan mengaplikasikan sampel hingga tepi plate untuk menghindari edge effect (kecepatan bergerak pelarut keatas pada tepi plate atau sorbent kurang homogen) pita tak beraturan.

Pengembangan dan Deteksi


Diawali pemilihan sistem solven-sorben yang tepat. Fase gerak dibuat baru. umumnya 100 ml dapat untuk mengembangkan 1-2 plate pada chamber dan waktu yang sama. Chamber perlu dijenuhkan dg bantuan kertas saring sepanjang sisi chamber. Silika merupakan sorben yang cukup reaktif dan banyak produk alam yang tak stabil sehingga selama pengembangan perlu dijaga dari sinar langsung agar tidak terjadi degradasi produk alami. Pengembangan dilakukan hingga beberapa mm dari tepi atas, kmd plate diambil dan dikeringkan.

Pengembangan dan Deteksi


Sampel yang semimurni akan menunjukkan residual yang berwarna, dapat mengetahui seberapa jauh bermigrasi Senyawa pigmen seperti klorofil dapat diamati secara visual. Senyawa yang mengabsorbsi UV dapat dilakukan deteksi dan selanjutnya bagian yang jadi tujuan dikerok untuk proses isolasi. Senyawa yang sedikit/tidak mengabsorbsi UV, dilakukan deteksi dg pereaksi semprot pada bagian tepi. Jika hasil deteksi menujukkan pemisahan tidak bagus maka senyawa/ bagian yang telah bereaksi harus diangkat dari lempeng untuk menghindari kontaminasi.

Desorpsi dan recovery


Setelah pemisahan senyawa telah cukup dilakukan produk alami perlu di-recovery dari sorbent, dikeringkan dan disimpan untuk elucidasi struktur (dapat juga untuk PK). Jika silika telah mengandung indikator flourescen, maka pita yang mengabsorbsi uv ditandai dg pencil dan dilepaskan dari padatan pendukung sorbent. Jika deteksi menggunakan pereaksi semprot, maka bagian pita yang telah diwarnai pereaksi dilepaskan dari plate menggunakan penggaris.
Gunakan masker saat melepaskan pita dari plate untuk menghindari bahan berbahaya yang tek diketahui masuk pernapasan.

Bagaimana lepaskan dari sorben ??


3 cara : Sorbent yang mengandung senyawa dipindah ke erlenmeyer dan pelarut ditambahkan. Disuspensi 30 menit untuk melepaskan senyawa dari sorben, disaring. Proses diulangi 2 atau 3x untuk memastikan recovery berjalan baik. Jenis solven yang digunakan sebaiknya lebih polar dari yang biasa digunakan untuk melarutkan, misalnya sample dilarutkan pada CHCl3 maka pelarut digunakan unuk recovery CHCL3: metanol (9:1) atau (8:2). Langkah ini untuk meyakinkan recovery telah maksimal dari sorbent dan meminimalkan kemungkinan produk tetap tertahan pada sorbent. Sorbent yang mengandung senyawa ditempatkan pada corong dg sinterglas yang dipasang pada labu buchner untuk aplikasi vakum. Sorbent dicuci dg pelarut dan larutan yang dihasilkan ditampung dan diuapkan untuk menghasilkan produk. Pencucian diulang untuk efektifitas recovery senyawa dr plate. Menggunakan kolom kecil, dikemas dg sorben yang mengandung senyawa. Kolom kemudian dielusi dg solven untuk recovery senyawa. Membutuhkan waktu lama dan diasumsikan senyawa stabil.

Penting diperhatikan !
Pada beberapa kasus, dimana sorbentnya silika, metanol dapat digunakan sebagai langkah akhir untuk menyakinkan senyawa telah direcovery. Beberapa senyawa yang sangat polar (glikosida flvonoid atau glikosida triterpen) memerlukan penambahan 1 - 2% asam asetat. Produk yg diperoleh harus dikeringkan dg cepat, sebaiknya dg aliran N2 dan disimpan dalam frezer. Dihindari penggunaan vep atau alat penguap yang menggunakan panas beresiko terjadi oksidasi, dekomposisi atau hilang menguap.

Uji Kemurnian dengan TLC


KLT analitik dapat digunakan untuk menetapkan kemurniannya. Ukuran partikel yang lebih kecil pada plate KLT akan memberikan resolusi lebih baik dan kemampuan yang lebih besar dalam mengukur kemurnian. Penggunaan minimal 3 sistem solven yang berbeda untuk melihat senyawa yang mempunyai kemiripan nilai Rf pada sistem solven. jika senyawa menunjukkan ketidakmurnian bahkan setelah di KLTP ada kemungkinan senyawa tidak stabil pada sorbent atau dalam larutan.
perlu dicari alternatif fase diam atau proses pemisahan lain.

Keuntungan KLTP
metode yang murah jika dibanding HPLC atau kromatografi countercurrent. teknik pengerjaan sederhana, hanya memerlukan sedikit latihan dan pengetahuan kromatografi. suatu metode analitik yang bisa di scale-up untuk metode preparatif. Produk natural dapat di isolasi dengan cepat dalam scala mg g jika dibanding HPLC. Pemilihan solven dan sorben fleksibel, solven dapat diubah dg cepat selama runing. Sejumlah besar senyawa dapat dianalisis atau dipisahkan secara simultan.

Kelemahan KLTP
deteksinya kurang peka jika dibandingkan HPLC. kecepatan eluasi tidak dapat dikendalikan seperti pada HPLC. kecepatan operasional lebih lambat jika di banding KCV. Jika diperlukan pengembangan ganda (terutama 2-D) untuk isolasi skala gram perlu waktu lama. terbatas hanya dengan sorbent-sorbent sederhana seperti silika, alumina, selulosa.

KLT Bioassay
KLT bioassay terhadap fungi & bakteri banyak digunakan, karena : Mudah penggunaannya Murah Cepat Mampu untuk proses scale-up terhadap aktivitas antibakteri Prinsip Dilakukan KLT kemudian mikroorganisme disemprotkan pada lempeng (Direct bioautography) atau lempeng ditutupkan pada medium pertumbuhan yang mengandung mikroorganisme (overlay assay).

bakteri yang resisten obat butuh obat-obat baru biassay sederhana sebagai antimikroba.

KLT bioutografi langsung (Direct bioautography)


Menggunakan fungi atau bakteri Untuk melacak aktivitas selama proses pemisahan Sangat sensitif dan akurat dalam menunjukkan senyawa aktif Uji antifungi umumnya tehadap Cladosporium cucumerinum, - patogen tehadap tumbuhan - non patogenik tehadap manusia - mudah membentuk spora - dapat dg mudah tumbuh pada lempeng KLT

KLT bioutografi langsung (Direct bioautography)

Uji antifungi:
1. Spot ekstrak/senyawa murni pada KLT (duplikate) dikembangkan dg fase gerak sesuai dan dikeringkan, 2. Menyiapkan C. Cucumerinum dari kultur hingga berumur 2 hari. 3. Menyiapkan medium pertumbuhan pada TLC 4. Menyiapkan suspensi spora fungi (no 2 ditambahkan no 3) 5. Menyemprotkan suspensi pada lempeng KLT dan menginkubasi pada 25C (2 hari) pada nampan uji yang berisi kapas lembab 6. Keberadaan senyawa antifungi ditunjukkan dengan penghambatan pertumbuhan micelia fungi. 7. Pengamatan lempeng KLT (ke-2) dg reagen atau UV dan membandingkan dg lempeng yg diinkubasi

KLT bioutografi langsung (Direct bioautography)


Kelemahan metode : Tak dapat membedakan metabolit yang fungistatic/ fungicidal. Perlu uji lanjutan penetapan MIC (Minimum Inhibitory Concentration) Contoh : Dellar et.al mengisolasi 2 senyawa dari Prosthanthera sp (Labiatae) melalui direct bioutografi dengan target fungi Cladosporium cucumerinum.
OH

HO

Prosthantherol (10ug, 70 jam)


OH O

Aristolen-2-one (1ug, 70 jam)


OH O

Senyawa 1 O (0,25 ug)


O O

OCH3

Senyawa 2 (3 ug) O
OH

Uji aktivitas antifungi senyawa fenol. Hostettmenn dan Marston meneliti kelompok xanton (senyawa 1,2,3) dari Hypericum brasiliense (Guttiferae) terhadap Cladosporium cucumerinum

OH

Senyawa 3 (3 ug)

KLT bioautografi overlay assay


Senyawa murni/ekstrak dilakukan KLT, kemudian ditutup dg medium yg mengandung m.o (dapat bakteri/fungi).

Uji terhadap Staphylococcus aureus Nutrient agar dituang pada dish uji. Ekstrak, fraksi atau senyawa murni di KLT (dibuat 2) Bercak dideteksi dengan UV, Rf ditentukan (akurat) Menginokulasi S aureus dengan titer 109 CFU/ml dalam MH, ditambahkan agar untuk mengentalkan hingga titer final 105 CFU/ml Lempeng KLT diletakkan pada nutrient agar, medium yang mengandung m.o uji dituang diatas plate, diinkubasi pada 37 C (24 jam). Zone hambat tampak spot jernih dg latar koloni bakteri. Zone divisualisasi dg garam tetrazolium (p-iodonitrotetrazolium chloride (INT) atau Methylthiazoltetrazolium chloride). Zone hambat (senyawa antimikrobial) nampak sebagai zone jernih dg latar purple. Zone hambat dibandingkan pada KLT ke-2 sehingga metabolit aktif dapat diisolasi. Dapat digunakan ampicillin atau kloramphenicol sebagai kontrol.

KLT bioautografi overlay assay


Uji terhadap bakteri resisten obat, seperti methicillinresistant Staphylococcus aureus, perlu ditambahkan methicillin (1 mg/L) untuk memperkecil resiko tanpa resistensi. Batista et.al. menggunakan metode overlay dalam bioassay-guided fractination pada ekstrak akar Plectranthus hereroensis (Labiatae) mengisolasi diterpen antibakteri (senyawa 4) dg menggunakan S. aureus. Senyawa diuji pada dilution assay dengan MIC 31,2 g/mL.

OH O OAc

OH

Senyawa 4